人冠状病毒HCoV-HKU1和HCoV-NL63双重实时荧光RT-PCR检测方法的研究

目的建立一种快速、灵敏、高效的人冠状病毒HKU1(HCoV-HKU1)和NL63(HCoV-NL63)双重实时荧光RTPCR检测方法。方法根据GENBANK数据库中HCoV-HKU1和HCoV-NL63的基因序列,利用BIOEDIT5.0软件进行序列比对分析,选择基因组的保守序列,并借助引物设计生物信息学软件,设计筛选出一套针对HCoV-HKU1和HCoV-NL63双重实时荧光PCR扩增的引物。从特异性、最低检测限、重复性等方面进行评估,建立了HCoV-HKU1和HCoV-NL63双重实时荧光PCR检测方法。结果分别以HCoV-HKU1和HCoV-NL63质粒为模板,HCoV-HKU1和HCoV-NL63双重实时荧光PCR方法的最低检测量分别为4.96×102 copies/ml和4.96×102 copies/ml。该方法针对其他病原微生物及人类基因组无反应信号,特异性好。4个梯度稀释质粒样本的4次重复检测Ct值变异系数均5%,重复性好。结论 HCoV-HKU1和HCoV-NL63双重实时荧光RT-PCR方法准确性好、灵敏度高、稳定性好,在临床鉴别诊断和口岸冠状病毒的监测中具有很好的应用前景。     

鼠疫耶尔森氏菌环介导等温扩增检测方法的建立

目的:将环介导等温扩增技术(LAMP)应用于鼠疫耶尔森氏菌的快速检测。方法:针对鼠疫耶尔森氏菌F1基因设计特异性引物,进行LAMP扩增。应用LAMP技术对鼠疫菌和非鼠疫菌进行检测以确定其特异性;对倍比稀释鼠疫菌液进行检测以确定其灵敏度,并与常规PCR方法进行比较。结果:对10种非鼠疫菌进行LAMP扩增,均为阴性结果,证明该方法具有很高的特异性。LAMP方法最低检出量为20个鼠疫菌,比常规PCR方法的灵敏度高10倍。通过加入染料进行LAMP扩增可直接观察结果。结论:本方法检测鼠疫耶尔森氏菌特异性强、灵敏度高,并且操作简便、结果易于判定,有望发展成为快速检测鼠疫耶尔森氏菌的有效手段。     

SARS冠状病毒环介导等温扩增可视化检测方法的建立

目的应用环介导等温扩增(LAMP)技术建立SARS冠状病毒可视化快速检测方法。方法针对SARS冠状病毒RNA聚合酶编码基因保守区设计LAMP引物及环引物,反应体系加入钙黄绿素作为LAMP扩增反应指示剂,结合LAMP浊度仪优化扩增条件,根据钙黄绿素的颜色变化进行结果判定,评价所建立LAMP方法的特异性和灵敏性。结果本方法最低检出限约为10拷贝/反应管,高于普通PCR;检测特异性高,仅SARS冠状病毒反应管钙黄绿素颜色由褐色变为黄绿色,而甲型H1N1病毒、高致病性H5亚型禽流感病毒、普通流感病毒均不发生变色反应;体系的扩增效率高于普通PCR,35 min内出结果。结论所建立的基于颜色判定的SARS病毒检测方法具有特异、灵敏、设备要求简单等特点,适用于SARS冠状病毒现场快速检测。     

志贺菌环介导等温扩增检测方法建立

目的 建立志贺菌环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法.方法 针对志贺菌侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)特征性保守序列设计1套4条引物,应用LAMP技术对21株志贺菌和非志贺菌进行特异性检测以确定其特异性;使用LAMP和聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)对ipaH基因重组质粒倍比稀释液进行检测以确定其灵敏度;使用重组质粒计算其初始拷贝数与反应时间之间的线性关系以评估定量检测的可能性.结果 荧光定量LAMP扩增曲线图显示,LAMP技术可以在1 h内获得结果;有较好的特异性,与其他17种食源性致病菌无交叉反应;LAMP检测技术的灵敏度高出经典PCR技术10倍以上,检测限达到200拷贝/μL;平均变异系数＜5%;反应时间与模板初始浓度有良好的线性关系(R2=0.985 5).结论 志贺菌环介导等温扩增检测体系是一种快速、灵敏、特异的核酸筛查方法,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段.     

汉滩型汉坦病毒环介导等温扩增(LAMP)检测方法建立

目的建立一种针对汉滩型汉坦病毒的环介导等温扩增(LAMP)检测技术,以实现汉坦病毒的快速、高效检测。方法针对汉坦病毒汉滩型S片段的保守区,设计合成4条特异性引物,建立汉滩型汉坦病毒LAMP检测方法。结果该方法能够有效检测汉坦病毒标准质粒,并且该套引物具有良好的特异性,检测灵敏度达到10个基因拷贝,应用建立的LAMP检测方法能够有效检测血液样本中的汉滩型汉坦病毒。结论建立的LAMP方法具有高度灵敏性及特异性,是一种高效快速的检测汉滩型汉坦病毒的基因检测方法 。     

环介导恒温扩增技术检测人冠状病毒的研究进展

冠状病毒(Coronavirus,CoV)是一类严重危害人类和畜禽健康的致病微生物,广泛存在于自然界中。目前已知能感染人的冠状病毒共7种,分别为人冠状病毒229E(HCoV-229E)、人冠状病毒OC43(HCoV-OC43)、SARS冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome virus,SARS-CoV)、人冠状病毒NL63(HCoV-NL63)、人冠状病毒香港I(HCoV-HKU1)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)和新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)。核酸扩增技术是生命科学领域非常有效的技术,环介导恒温扩增技术(loop mediated isothermal amplification,LAMP)是科研人员发展的十多种核酸恒温扩增技术之一。本文着重介绍LAMP技术在检测人冠状病毒的研究进展。     

环介导恒温扩增结合纳米横向流生物传感技术对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌快速检测方法的建立与应用

目的 基于环介导恒温扩增结合纳米生物传感技术（loop - mediated isothermal amplification combined with nanoparticle - based lateral flow biosensor, LAMP - LFB）对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin - resistant Staphylococcus aureus,MRSA）快速、准确、便捷检测技术的构建及应用评价。方法 以MRSA菌株特异性基因mecA为检测靶点,设计并修饰LAMP引物。采用实时浊度仪、孔雀石绿扩增指示剂（Malachite green, MG）及纳米生物传感器（nanoparticle - based lateral flow biosensor, LFB）为检测手段对LAMP扩增产物进行鉴定。对MRSA - LAMP - LFB检测体系的扩增温度和扩增时间进行优化,分析MRSA - LAMP - LFB检测方法灵敏性和特异性。应用微生物培养技术,PCR技术和新构建的MRSA - LAMP - LFB方法分别对48份临床疑似MRSA感染患者全血样本进行检测,进而评价MRSA - LAMP - LFB技术的临床应用性。结果 MRSA - LAMP - LFB技术优化后的反应条件为67 ℃,40 min。该技术的检测结果可直接通过观察LFB板条上的CL和TL条带显色进行结果判定。该技术的灵敏度为100 fg/μl（32 copies/μl）,其检测特异性为100%,与非MRSA菌株无交叉反应。经临床样本验证,LAMP - LFB技术对MRSA的检测结果与传统的“细菌培养 - 药敏鉴定”检测结果一致,其灵敏度高于传统的PCR方法。结论 基于LAMP和LFB技术建立的MRSA - LAMP - LFB检测方法特异性强、灵敏度高,能准确、快速地检测MRSA菌株,能为临床用药和MRSA防控提供准确、快速的实验室诊断依据。     

环介导等温扩增技术在钩端螺旋体病监测中的应用

目的:评价LAMP技术在钩端螺旋体检测与监测中的可行性。方法:采用LAMP技术对感染病人血清及钩体标准菌株感染鼠肾进行检测,同时与卫生行业标准推荐的引物G1/G2 PCR方法进行对比。结果:LAMP快速检测方法 60 min内即可完成检测,具有较高的检测灵敏度,对纯培养的钩体检测灵敏度可达1.5 CFU/ml,比PCR法高出两个数量级,结果肉眼直接可观。同时对21种共42株细菌进行LAMP扩增,仅钩体结果为阳性,显示该LAMP方法具有较强特异性。结论:LAMP方法操作简便、特异性强、灵敏度高且成本低廉,在钩体的快速检测和疫情监控中具有良好的应用前景。     

霍乱弧菌环介导等温扩增LAMP技术检测

目的 应用环介导等温扩增技术(LAMP)进行霍乱弧菌的快速检测.方法 针对霍乱弧菌的管家基因(mdh)设计4条特异性引物(2条内引物和2条外引物),建立快速检测食品中霍乱弧菌的环介导等温扩增方法;应用该方法对17种细菌共42株菌进行LAMP扩增,并进行确证,全面评估该方法的灵敏度、特异性、准确性等.结果 该方法检测21株霍乱弧菌均得到阳性扩增结果,其余21株非霍乱弧菌均未扩增出条带,扩增反应最佳反应时间为60min,反应温度为65℃.霍乱弧菌基因组DNA和纯培养物的检测灵敏度分别约为40 fg和50 cfu/mL.对模拟食品样品进行直接检测,检测限为70 cfu/g.结论 该方法具有特异性强、灵敏度高,操作简便快速、不需要复杂仪器设备,适用于食品的快速检测.     

环介导等温扩增方法检测H9亚型流感病毒的研究

目的:建立环介导等温扩增(LAMP)方法用于H9亚型流感病毒基因的检测,为基层实验室提供简便快速的检测方法。方法:根据GenBank中公布的H9亚型流感病毒血凝素基因序列,选择保守区域应用在线软件PrimerExplorer V4设计LAMP引物。以克隆有H9亚型流感病毒血凝素基因的阳性质粒为模板,建立和优化LAMP检测方法,并进行灵敏度、特异性评价和病毒检测。结果:LAMP检测方法对H9亚型流感病毒基因的检出灵敏度达到5个拷贝,比普通PCR方法高出2个数量级,对H1、H3、H5亚型流感病毒不产生非特异性扩增,显示出良好的特异性。结论:建立的LAMP检测方法能快速、敏感、特异地检测H9亚型病毒,适合在基层实验室推广使用。     

环介导恒温扩增法快速检测寨卡病毒

目的建立环介导恒温扩增(LAMP)方法快速检测寨卡病毒。方法针对寨卡病毒NS5基因设计并筛选LAMP引物,优化反应条件,验证方法的特异性和灵敏度,通过实时浊度仪和钙黄绿素显色法判定结果。结果针对寨卡病毒NS5基因的LAMP方法可在64℃50 min特异性扩增NS5基因,与基孔肯雅病毒、登革病毒、黄热病毒、甲型H1N1流感病毒均无交叉反应。检测灵敏度达到10拷贝/μl,是PCR方法的100倍。结论 LAMP方法快速检测寨卡病毒操作简便,适用于口岸现场快速检测。     

嗜肺军团菌的环介导等温扩增检测技术研究

目的建立一种简便、快速和高灵敏度的嗜肺军团菌的检测方法。方法利用环介导等温扩增(1oop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,根据嗜肺军团菌mip基因的特征性保守序列,设计LAMP检测引物,建立LAMP检测方法,用常规PCR检测平台和其他21种致病菌评估该方法的特异性、灵敏度、重复性及实用性,同时以荧光法建立反应阈值与模板初始浓度之间的线性标准曲线。结果建立的LAMP方法检出限为1.0×102copies/μl,与其他致病菌无交叉反应,反应阈值与初始模板浓度有良好的线性关系(R2=0.9843),LAMP检测结果与传统分离培养方法具有良好的吻合性。结论环介导等温扩增技术检测嗜肺军团菌简便、快速、敏感度高,具有广阔的应用前景。     

LAMP法和PCR法快速检测阪崎肠杆菌的比较

[目的]建立阪崎肠杆菌环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)快速检测技术,并与PCR检测方法进行比较,为阪岐肠杆菌感染的快速诊断提供实验依据。[方法]根据阪崎肠杆菌外膜蛋白OmpA基因,设计特异性引物,建立LAMP和PCR检测技术体系,并对2种方法检测的灵敏度、特异性和实际样品的检测结果进行比较。[结果]建立了优化的LAMP和PCR检测体系,灵敏度检测结果显示,LAMP检测限为101cfu/ml,PCR检测限为102cfu/ml,LAMP检测灵敏度高于PCR;对36株近源菌进行特异性检测,结果显示,LAMP仅8株阪崎肠杆菌得到阳性结果,PCR产物则出现非特异性条带,LAMP特异性比PCR高。应用于46份奶粉样品的检测,LAMP和PCR均有清晰、特异的预期条带和结果产生,并与常规检测结果一致。[结论]LAMP检测技术作为一种快速检测阪崎肠杆菌的方法具有简便、灵敏快速,与PCR方法比较,特异性强、操作简便、检测成本低,耗时短,更有望发展成为快速检测阪岐肠杆菌的有效手段。     

阪崎肠杆菌环介导等温扩增检测方法建立

目的 针对当前国内外传统检测方法缺点,建立阪崎肠杆菌快速检测法.方法 根据阪崎肠杆菌外膜蛋白(OmpA)基因,设计4条特异性引物(内、外引物各2条),建立并优化环介导等温扩增(100p-mediattA isothermalamplification,LAMP)检测体系及反应条件,并进行LAMP反应的灵敏度、特异性实验及实际样品检测.结果 LAMP检测阪崎肠杆菌,优化后的条件选择为:Mg2+浓度6 mmoVL,dNTP浓度0.6 mmoVL,甜菜碱浓度0.8 moVL,外引物与内引物的浓度比1:4,扩增温度580C 60min;细菌纯培养检测灵敏度为101cfu/mL;对11种细菌共26株菌进行LAMP扩增,仅8株阪崎肠杆菌得到阳性扩增结果,证明引物具有很高的特异性;对实际样品进行增菌检测,采用试剂盒提取DNA,从样品处理到报告结果,耗时26 h;并采用传统检测方法验证,正确性为100%.结论 该方法检测阪岐肠杆菌特异性强、灵敏度高,并且操作简便、检测成本低、耗时短,有望成为快速检测阪岐肠杆菌的有效方法.     

贝氏柯克斯体可视化等温扩增法建立

目的建立针对贝氏柯克斯体的快速可视化环介导等温扩增(LAMP)方法。方法体外合成贝氏柯克斯体的IS1111a基因,构建重组质粒。利用在线引物设计软件设计3组LAMP引物,用实时浊度仪筛选出最佳引物,同时对羟基萘酚蓝浓度进行优化,建立可视化LAMP反应体系,并评价其敏感性和特异性。结果建立的可视化LAMP反应可准确检测出贝氏柯克斯体的重组质粒和新桥株,不与其他立克次体产生交叉反应,最低可检测到3.6×10~2拷贝/反应,较普通聚合酶链反应(PCR)法的灵敏度提高了一个数量级,等同于实时浊度法和实时荧光定量PCR方法的检测灵敏度。结论建立的可视化LAMP方法可敏感、特异地检测出贝氏柯克斯体感染,操作简单快捷,适用于基层卫生防疫和疫情现场的病原筛查。     

结核分枝杆菌LAMP检测方法的建立及应用

目的建立一种基于环介导等温扩增(LAMP)的结核分枝杆菌核酸快速检测方法,并应用于出入境人群的肺结核样本检测。方法针对结核分枝杆菌插入序列6110(IS6110)设计5组LAMP引物,利用LAMP实时浊度仪筛选出1组最佳引物,用20株临床致病菌株进行特异性检测,用10倍梯度稀释法进行灵敏度测定,用25份痰培养阳性样本对阳性率进行评估。结果筛选出1组最佳引物TB159,该引物特异性良好,与20株常见致病菌株无交叉反应。此方法的最低检测限为24.77 pg/μl,对25份痰培养阳性样本检测的阳性率为100%。结论建立了一种特异性好、灵敏度高的LAMP快速检测方法,可以应用于结核病检测。     

小肠结肠炎耶尔森菌环介导管温扩增技术检测方法的建立

目的将一种新颖的核酸扩增技术——环介导等温扩增技术(LAMP)应用于小肠结肠炎耶尔森菌的快速检测。方法针对小肠结肠炎耶尔森氏菌毒素基因yruI/yru R设计5条特异性引物,进行LAMP扩增,对扩增反应进行优化。并考核方法的敏感性和特异性。结果最佳反应时间为60min,反应温度为60℃。对8种相关肠道细菌进行LAMP扩增,仅小肠结肠炎耶尔森菌得到阳性扩增结果,证明引物具有很高的特异性。小肠结肠炎耶尔森菌基因组DNA和纯培养物的检测灵敏度分别约为74fg和43cfu/ml。对模拟食品样品进行直接检测,检测限为76cfu/g。结论本方法检测小肠结肠炎耶尔森菌特异性强、灵敏度高,并且操作简便、检测成本低,1.5h即可完成,有望发展成为快速检测小肠结肠炎耶尔森菌的有效手段。     

环介导等温扩增技术检测痰标本中结核分枝杆菌的研究

[目的]寻找1种快速的，且敏感度高，特异性强的结核分枝杆菌的检测方法。[方法]环介导等温扩增基因检测（Loop-mediated isothermal amplification LAMP）是一种便捷、灵敏度高而又特异性强的核酸基因扩增检测技术。木课题组根据结核分枝杆菌gyrB特征性序列设计3对特征性引物对痰液中和培养基中的结核分枝杆菌进行检测。其中1对环状引物结合于特征性序列中环状结构部分，可极大地加快LAMP反应速度，且不干扰内引物在LAMP反应中作用。（结果]实验结果表明：使用环状引物的LAMP反应可在0.5h内完成，总共分析时削不超过1h。LAMP检测技术的灵敏度比经典PCR技术高100倍左右，LAMP检测技术具有与实时PCR（Real-time PCR）技术相同的特异度。另外，由于LAMP检测技术是在恒温的情况下进行，不需要特别昂贵的仪器设备，检测方法简单，结果判定直接。（结论]该方法的特点和优势可以使之在基层实验室及现场监测方面广泛使用，在快速检测方面具有一定的开发潜力。     

环介导等温核酸扩增法快速检测副溶血性弧菌的研究

目的基于环介导等温核酸扩增法(LAMP)建立副溶血性弧菌tlh基因的快速检测方法。方法以副溶血性弧菌tlh基因为扩增的靶序列分别设计外引物、内引物和环引物各1对,通过引物特异性识别tlh基因上的6个独立区域在恒温条件下扩增靶序列,快速检测副溶血性弧菌。并对该法进行灵敏度、特异度试验,将该方法与荧光定量PCR法检出率进行统计学比较。结果 LAMP法最低检出限为10 fg/μl,灵敏度是荧光定量PCR的10倍;特异度实验中除检出2株副溶血性弧菌外,6株非副溶血性弧菌均未检出;LAMP法与荧光定量PCR法检出率差异无统计学意义(P0.05)。结论 LAMP法具有高特异性、高效性、快速简便易检测等特点,适合现场快速检测,在食物中毒暴发处置中有深远的经济价值。     

环介导等温扩增快速检测阳性血培养瓶中的金黄色葡萄球菌

目的 建立采用环介导等温扩增(LAMP)技术从阳性血培养瓶中快速检测金黄色葡萄球菌的方法.方法 以293份阳性血培养瓶中的细菌为检测对象,采用盐酸胍-苯甲醇法提取细菌DNA,然后以LAMP技术扩增ssa和mecA基因来鉴定金黄色葡萄球菌及其对甲氧西林的耐药性,并将检测结果与传统方法相比较.结果 在293份阳性血培养瓶中,采用LAMP法检测到22株金黄色葡萄球菌,与传统方法比较,其检测金黄色葡萄球菌的灵敏度和特异度均达100%,且检测时间缩短约1 h.结论 该方法灵敏度高、特异性强、检测方便快速,适合从阳性血培养瓶中快速检测金黄色葡萄球菌.