DNA条形码技术用于进口货物中肩突硬蜱的鉴定简

目的利用DNA条形码技术对入境货物中截获未知种类的蜱进行种属鉴定。方法抽取蜱DNA,用特异性扩增线粒体细胞色素C氧化酶第Ⅰ亚基（COⅠ）基因片段,并测序。利用NCBI进行BLAST比对。结果蜱样本COⅠ基因序列与肩突硬蜱（Ixodes scapularisSay,1821）COⅠ基因匹配度达100%。形态学上,该蜱符合肩突硬蜱的形态学特征。该蜱种在我国尚无检出报道。结论该蜱为肩突硬蜱。这是国内首次报道从进口货物中截获肩突硬蜱。     

DNA条形码技术在鉴定绥芬河口岸日本血蜱和嗜群血蜱中的应用

目的建立用DNA条码技术对绥芬河口岸两种形态学特征非常相近的嗜群血蜱和日本血蜱的鉴定方法,探讨DNA条形码在蜱类鉴定中的实用性。方法在黑龙江绥芬河口岸采集游离血蜱103只,形态学鉴定完毕后,提取蜱样本基因组DNA,采用PCR方法从2种血蜱基因组中扩增线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因,测序后进行同源性分析,用Mega6.0软件构建系统发生树并进行系统进化分析。结果经形态学鉴定嗜群血蜱89只,日本血蜱14只;2种血蜱COⅠ基因之间的同源性为87.5%,嗜群血蜱与GenBank中编号KR108867.1公布的嗜群血蜱CO Ⅰ序列相似性为99.8%;日本血蜱与GenBank中编号KR108879.1公布的日本血蜱CO Ⅰ序列相似性为99.8%,与形态学鉴定结果一致。结论对于形态学特征相近蜱种的鉴定,在传统形态学分类的基础上结合DNA条码技术鉴定方法能更准确地鉴定蜱的种类,也能更好地了解其进化关系,为蜱传播疾病的预防控制提供依据。     

基于DNA条形码鉴定口岸截获鼠类

目的 利用基于线粒体细胞色素C氧化酶Ⅰ(COⅠ)基因、线粒体控制区（D-loop）基因、16S rRNA基因的DNA条形码技术对广州口岸截获的1只死鼠进行种类鉴定。方法 从鼠肌肉中提取DNA,用PCR法扩增COⅠ、D-loop、16S rRNA基因片段,将测序结果与GenBank和BOLD systems v4中鼠类的DNA条形码进行比对,用Mega 6.0构建系统发育树,计算遗传距离。结果 该鼠类样本能扩增出COⅠ、D-loop、16S rRNA基因片段,通过COⅠ、16S rRNA基因扩增片段序列比对与德氏柔毛鼠Praomys daltoni同源性均为99%,D-loop基因扩增片段序列比对与猪吻柔毛鼠Praomys rostratus同源性为100%,结合形态学特征,最终鉴定为德氏柔毛鼠Praomys daltoni。结论 COⅠ、16S rRNA基因片段能够对鼠类进行有效鉴定,弥补了形态学鉴定的不足之处。     

新疆边境地区伊宁县图兰扇头蜱形态学及分子生物学鉴定

目的 对新疆边境地区伊宁县图兰扇头蜱进行形态学和分子生物学鉴定.方法 在新疆边境地区的伊宁县随机采集畜牧体表寄生蜱324只,进行形态学初步筛选,从中选取6只形态差异较大的图兰扇头蜱,进行线粒体16S rRNA和线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ (CO Ⅰ)基因序列扩增、测序,并与GenBank登录的图兰扇头蜱参考序列进行遗传进化分析.结果 形态学鉴定采集的伊宁县蜱类皆为图兰扇头蜱,两段序列的碱基组成均显示较高的A+T比例(16SrRNA基因为73.8％,CO Ⅰ基因为70.34％),在变异程度上16S rRNA基因较CO Ⅰ基因明显保守.结论 首次应用形态学、16S rRNA和CO Ⅰ基因测序分析表明新疆伊宁县采集蜱皆为图兰扇头蜱,并证明图兰扇头蜱具有生物多样性.     

上海口岸1只进境犬携带蜱的种类鉴定与溯源分析

目的对上海口岸截获的德国成犬体表蜱进行种类鉴定及溯源分析。方法 2016年11月28日在上海口岸进口的69只德国警犬中的第33号警犬右前肢内侧检获蜱1只,对其进行形态学鉴定,并提取其DNA,扩增线粒体16S r RNA基因进行测序、比对,并对感染途径进行溯源分析。结果形态学鉴定该蜱符合血蜱属的形态特征,分子鉴定表明该蜱的线粒体基因序列与广泛分布于古北区和东洋区的褐黄血蜱(Haemaphysalis flava Neumann,1897)线粒体基因匹配度达98%。结论截获蜱为褐黄血蜱,为犬入境后感染。     

河南口岸截获未知蝇种细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因分析

目的应用DNA条形码技术对河南口岸截获的1只形态不完整的未知蝇类进行鉴定。方法利用以细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)为目的基因的DNA条形码技术,对该未知蝇类基因组DNA进行扩增、序列比对和分析。结果通过DNA条形码鉴定和序列比对,该未知蝇类的DNA条形码序列与BOLD中绯颜裸金蝇的序列同源性高达100%,确认该蝇种为绯颜裸金蝇。结论 DNA条形码技术弥补了传统形态学鉴定的局限性,在国境口岸医学媒介生物鉴定中有广阔的应用前景。     

国境口岸首次截获贪食睡鼠的分子鉴定及核酸序列分析

目的利用分子鉴定技术,对辽宁大窑湾口岸截获的1只鼠样本(从来自塞尔维亚的原木的集装箱中采集)进行种类鉴定。方法提取已风干鼠样本的基因组DNA,采用动物线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ(COⅠ)的通用引物(COⅠ-1和COⅠ-2),进行靶DNA扩增并进行核酸序列分析。结果截获鼠样本的DNA条形码序列与Gen Bank中贪食睡鼠(Glis glis)的序列相似性最高为100%,鉴定为贪食睡鼠。为国境口岸首次截获该鼠种。结论加强出入境交通工具及集装箱鼠类监测工作,保障国境口岸的卫生安全。     

褐黄血蜱与铃头血蜱的分子生物学鉴定

目的建立2种形态学特征非常相近的褐黄血蜱及铃头血蜱的分子生物学鉴定方法,探讨它们的系统发生关系。方法在湖北省从动物体表采集寄生蜱,形态学鉴定完毕后,采用PCR方法从2种血蜱基因组中扩增12SrDNA、16SrDNA及线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因,测序后进行同源性分析,用PAUP4.0软件分别构建系统发生树并进行系统进化分析。结果 2种血蜱12SrDNA、16SrDNA及COⅠ基因之间的同源性分别为90.8%、90.4%和86.8%,湖北省采集的褐黄血蜱3个基因片段与已知褐黄血蜱的同源性分别为100%、99.5%和99.7%。用这2种蜱的12SrDNA、16SrDNA及COⅠ基因的核苷酸序列分别构建系统发生树,湖北省采集的褐黄血蜱与已知的褐黄血蜱聚在一起,褐黄血蜱及铃头血蜱均形成独立的分支,但用3个基因构建的系统发生树中血蜱属不同种间的亲缘关系不同。结论对于形态学特征相近蜱种的鉴定,在传统形态学分类的基础上结合分子生物学鉴定方法能更准确地鉴定蜱的种类,也能更好地了解其进化关系,为蜱传播疾病的预防控制提供依据。     

DNA条形码技术在兰州中川机场鼠类鉴定中的应用

目的调查兰州中川机场及其附近地区鼠类的组成,并利用DNA条形码技术对鼠种进行鉴定。方法 2015年1月—2017年7月,在中川机场及其附近地区采用笼夜法采集鼠类,提取鼠肾DNA,用PCR方法扩增线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因并测序,测序结果在DNA条形码专用数据库BOLD中进行比对,确定鼠种。利用Mega 6.0构建分子进化树。对于形态学和COⅠ基因鉴定结果不一致的样本,进一步通过细胞色素b(Cytb)基因进行分子鉴定。结果 118份样品均能扩增出特异性COⅠ基因片段,115份样本的分子鉴定结果与形态学结果基本一致,3份样本形态学鉴定结果与分子鉴定有差异,经Cytb基因序列比对及形态学反复鉴定,确定初步形态学鉴定结果有误,采用分子鉴定结果。结论 DNA条形码技术可以对鼠类进行有效鉴定,是对形态学鉴定的有力补充,为口岸病媒生物的快速识别和鉴定提供了科学依据。     

利用DNA条形码技术鉴定陕西口岸输入性鼠类

目的利用DNA条形码技术鉴定在入境航空器中截获的1只鼠类。方法提取截获鼠类的肝脏DNA,通过PCR方法扩增细胞色素C氧化酶亚基I(cytochromecoxidase I,CO I)基因并测序。将测序结果进行比对分析,从而鉴定物种。结果成功扩增到该鼠类样本的CO I基因,通过序列对比和系统进化分析,显示该鼠序列与黄胸鼠同源性为100%,鉴定为黄胸鼠。结论 DNA条形码技术在啮齿动物鉴定中应用良好,是一种简单、快速、高效的鼠类鉴定方法 。     

东北部分地区蜱传埃立克体DNA的检测

目的 了解东北部分地区一些蜱种中是否携带埃立克体。方法 应用16SrRNA基因构建的特异性引物进行半套式PCR,检测蜱标本中埃立克体DNA,并对扩增产物进行克隆和序列测定,与基因库中已知序列进行同源性比较。结果从辽宁清原和吉林抚松、和龙、敦化、珲春的全沟硬蜱(Lpersuleatus)和森林革蜱(D．silvarum)中均扩增出了查菲埃立克体DNA,扩增片段与美国分离株(基因库M73222)相对应片段完全一致,同源性为100％;另外从吉林抚松、珲春的全沟硬蜱中扩增出了粒细胞埃立克体DNA,扩增片段与美国分离株(基因库U02521)相对应片段相差2个碱基,同源性为99.7％。结论 发现东北部分地区存在埃立克体病的病原学迹象,提示该地区可能存在埃立克体病的自然疫源地。     

DNA条形码技术在河北省坝上地区夜行鼠鉴定中的应用

目的以河北省坝上地区捕获的夜行鼠为对象,应用DNA条形码技术进行鼠类鉴定。方法在河北省坝上地区采集鼠肝脏标本,并保存整只鼠,制作标本,提取DNA,采用通用引物PCR法扩增细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因,并测序。将测序结果与Gen Bank中其他鼠类的DNA条码进行Blast比对,并构建分子进化树。结果 36份样本均能通过PCR扩增出特异性COⅠ基因条带,所构建的分子进化树结果与形态学鉴定结果有所不同,经头骨鉴定,进化树结果正确无误,更正形态学鉴定结果。其中2只夜行鼠未能在Gen Bank中找到同源性较高的鼠类基因,且头骨受到严重损坏,暂无法确定鼠种。结论 DNA条形码技术能够对鼠类进行有效的物种鉴定。     

基于COⅠ基因的媒介蝇类快速分子鉴定研究

目的 为解决蝇类形态学鉴定的不足,建立基于细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COⅠ）基因的DNA条形码技术对蝇类进行分子鉴定。方法 选取烟台口岸常见的16只蝇类作为研究对象,形态学鉴定后,取蝇的单后足代表微量组织,提取总DNA。依据资料,选取COⅠ国际通用引物LCO1490：5′-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3′,HCO2198：5′-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3′,建立PCR体系,完善PCR程序,有效扩增蝇类的COⅠ基因。纯化PCR产物后进行序列测定和比对。此外,应用Mega5.05软件分别用最大似然法、邻接法、最大简约法分析系统发育,构建系统发育树比较进化关系。结果 16只蝇类COⅠ基因扩增片段长度为690 bp,其中A＋T平均含量高达68.53%。序列比对结果及系统进化关系显示,16只蝇类COⅠ基因的分子鉴定与形态学鉴定结果一致。结论 应用DNA条形码技术可成功扩增蝇类的COⅠ基因,其分子鉴定与形态学鉴定结果完全一致,尤其适用于微量组织样本的鉴定。     

东北部分地区蜱携带几种病原立克次体的分子检测

目的为了解东北地区蜱中携带立克次体的情况。方法应用人工小时布旗法采集东北部分地区不同生境的游离蜱,采用PCR作斑点热立克次体、查菲埃立克体、人粒细胞无形体DNA检测。结果从东北地区全沟硬蜱和森林革蜱检出查菲埃立克体DNA,全沟硬蜱平均阳性率为3.29%,森林革蜱为1.88%;从全沟硬蜱检出人粒细胞无形体DNA,平均阳性率为2.98%;从嗜群血蜱检出斑点热立克次体DNA,其平均阳性率(6.67%)明显高于全沟硬蜱(1.69%)和森林革蜱(2.36%)。结论东北地区全沟硬蜱和森林革蜱可能是查菲埃立克体、人粒细胞无形体的主要携带媒介,嗜群血蜱主要携带斑点热立克次体,提示东北地区存在三种蜱媒立克次体病的自然疫源地。     

吉林延边地区蜱复合感染新塔拉塞维奇立克次体及SFTSV调查研究

  目的  为了解吉林省延边地区蜱类新塔拉塞维奇立克次体(candidatus rickettsia tarasevichiae，CRT)和复合感染新布尼亚病毒(sever fever thrombocytopenia syndrome virus，SFTSV)的感染情况。  方法  采集吉林省延边朝鲜族自治州(延边州)延吉、汪清、珲春、敦化、安图、和龙6个县游离蜱，进行形态学分类，通过巢式多聚核苷酸链式反应(nested polymerase chain reaction，nested PCR)和实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)方法检测蜱体内CRT和SFTSV。对其CRT进行目标DNA测序，分析同源性和系统进化关系。  结果  此研究共采集各种蜱类1 032只，分别为全沟硬蜱(ixodes persulcatus)(35.56%)、森林革蜱(dermacentor silvarum)(20.64%)、日本血蜱(haemaphysalis japonica)(20.45%)、长角血蜱(haemaphysalis longicornis)(10.47%)、嗜群血蜱(haemaphysalis concinna)(8.33%)以及其他种类(4.55%)。全沟硬蜱、长角血蜱、日本血蜱、森林革蜱检测出CRT，最低感染率(minimum infection rate per 100 ticks，MIR)为10.47%。嗜群血蜱、日本血蜱、全沟硬蜱、长角硬蜱、森林革蜱检测出SFTSV，最低感染率为2.52%。全沟硬蜱、日本血蜱、森林革蜱3种蜱存在CRT和SFTSV复合感染现象，复合感染MIR为1.26%。本研究CRT ompA和17kDa基因序列与中国河南信阳株(KX365196.1)序列同源性达100%。系统进化分析，延边地区蜱CRT ompA基因序列和该河南信阳株基因序列成为一簇，而17kDa基因则形成独立分支。  结论  本研究首次从吉林省延边地区游离蜱中检测出CRT，全沟硬蜱为主要媒介宿主。因此，可以明确该地区为新塔拉塞维奇立克次体病自然疫源地。同时发现，延边地区蜱类存在CRT与SFTSV复合感染的现象。因此，在该地区必须加强新塔拉塞维奇立克次体病和发热伴血小板减少综合征(sever fever thrombocytopenia syndrome，SFTS)疫情监测。     

三峡库区沿江口岸鼠类及其分子鉴定特征研究

目的以三峡库区沿江口岸捕获的鼠类为研究对象,应用DNA条形码技术进行鼠类鉴定,分析各种鼠类的分子鉴定特征。方法在三峡库区沿江口岸采集鼠类标本,并保存整只鼠体,制作标本用于形态学鉴定,采集肝脏或肌肉组织,提取DNA,采用通用引物PCR法扩增细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因,并测序。将测序结果与Gen Bank中其他鼠类的DNA条码进行Blast比对,并构建分子进化树。结果共捕获4种61只鼠类,其中42份样本通过PCR扩增获得特异性COⅠ基因条带,所构建的分子进化树结果与形态学鉴定结果一致,但不同口岸鼠类在分子进化水平存在一定差异。结论分子鉴定技术能够应用于对三峡库区口岸鼠类进行有效的物种鉴定。     

淮安市长角血蜱遗传多样性的线粒体基因COⅠ分析

目的 本研究旨在了解淮安市长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)的遗传多样性,比较不同地理种群间的进化关系,为本市H.longicornis及蜱传病的预防提供理论基础。方法 在淮安市盱眙县山区采集游离蜱和羊寄生蜱,PCR法扩增细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(mt COⅠ)基因并测序。对mt COⅠ基因序列进行系统进化分析和种群遗传多样性分析。结果 JS-XY种群的mt COⅠ基因的核苷酸同源性为97.00～100.00%,JS-XY种群在进化枝上属于"Compound"进化谱系枝。JS-XY种群共有3单倍型,单倍型多样性Hd=0.439,核苷酸多样性为π=0.001,多态性位点S=2,Tajima's D值为-0.849 71。结论 研究表明,淮安地区的优势蜱种为长角血蜱,H.longicornis JS-XY种群近期可能经历过种群扩张。     

2016—2019年内蒙古大兴安岭林区立克次体关联细菌群监测

目的了解内蒙古大兴安岭林区蜱中立克次体关联细菌群的流行情况和分子特征。方法 2016—2019年,在内蒙古东部林区采集游离蜱样本,利用形态学特征和18S rRNA分型法鉴定蜱种。提取蜱DNA,对斑点热立克次体(gltA和rOmpA)、无形体属(msp2/p44)和埃立克体属(omp1/p28)等特异性基因进行PCR扩增。扩增序列测序后进行同源性比对和系统进化分析。结果共采集成蜱3 251只,隶属于3属4种。PCR检测结果显示,斑点热立克次体阳性率为43.3%,扩增出的gltA序列与已注册Candidatus R. tarasevichiae(MN450397)和R.heilongjiangensis(AY285776)的同源性为100%,检出率分别为40.1%和3.1%。无形体msp2阳性率为8.1%,埃立克体omp1阳性率为7.0%。2016—2019年连续监测的结果显示,Candidatus R. tarasevichiae一直保持较高的检出率,为31.0%～46.6%,R.heilongjiangensis的检出率为2.6%～3.5%,无形体和埃立克体的阳性率分别为5.7%～10.6%、6.7%～7.9%。其中,全沟硬蜱Candidatus R. tarasevichiae的阳性率基本呈现上升的趋势,且感染率均高于其它蜱类。结论该地区全沟硬蜱为优势蜱种,Candidatus R. tarasevichiae和R.heilongjiangensis为优势菌种,且在该地区蜱中的高感染率,表明人类接触该菌的风险很高,需加强监控。     

满洲里口岸蜱类携带斑点热群立克次体的核酸检测及核酸序列分析

目的了解中俄边境地区蜱类自然感染斑点热群立克次体(Rickettsia japonica)的状况,为蜱传斑点热的监测和检测提供技术支持。方法采集鼠类寄生蜱,研磨后提取蜱DNA,利用PCR扩增斑点热群立克次体Omp A基因,对阳性产物进行序列分析。结果在满洲里地区,鼠类体表采集到的蜱类样本,均为全沟硬蜱(Ixodes persulcatus),从8只蜱中检测到斑点热群立克次核酸。序列分析结果表明,其中12号标本中检出的斑点热立克次体与Gen Bank数据库中已注册的斑点热群立克次核酸序列有高度的相似性(98%~99%)。结论应加强对内蒙古满洲里地区蜱传斑点热的监测和检测,防止蜱传疾病的发生。     

南沙口岸首次从入境牛皮中截获盾陷璃眼蜱

目的 介绍盾陷璃眼蜱,以便于口岸检疫人员及相关人员参考。方法 根据截获标本及相关文献资料,详细描述盾陷璃眼蜱成蜱的形态特征;并将其与近似种小亚璃眼蜱进行比较。结果 盾陷璃眼蜱为南沙口岸从意大利入境生牛皮中截获,也是我国首次从国外货船上截获。详细描述了盾陷璃眼蜱的形态特征,并将其与近似种小亚璃眼蜱的分类学、生物学和传播疾病重要性进行了比较和讨论。结论 蜱类有较高的输入风险,应加强对外来蜱和入境相关货物的检疫监管。