石蜡包埋组织中4种DNA提取方法的比较研究

目的 探讨石蜡包埋组织中提取DNA的简易有效方法.方法 取我院2003年肿瘤细胞减灭术切除的10%甲醛固定石蜡包埋的上皮性卵巢癌标本20例,分别以一步法、氯化钠盐析法、酚氯仿抽提法、试剂盒法提取其DNA,然后进行电泳和聚合酶链反应扩增分析.结果 酚氯仿抽提法所得样本DNA的产量为55.12±8.81 μg,氯化钠盐析法为58.39±5.76 μg,两者比较无显著差异(P＞0.05),但分别和另外两组相比有显著差异(P＜0.001);酚氯仿抽提法所得样本DNA的OD 260/OD 280比值为1.81±0.16,氯化钠盐析法为1.84±0.18,两者比较无显著差异(P＞0.05),但分别和另外两组相比有显著差异(P＜0.01);酚氯仿抽提法,氯化钠盐析法所得DNA产量和质量均高于一步法和试剂盒法.结论 蛋白酶K消化氯化钠盐析法简便快捷,不用接触有毒的化学药品,是理想的石蜡包埋组织DNA提纯方法.     

乙型肝炎病毒DNA不同抽提方法的比较及在其隐匿性感染中的应用

目的对血清中HBV DNA不同抽提方法进行比较,选择较优方法进行隐匿性HBV感染的检测。方法分别用直接煮沸法、辛酸钠法、蛋白酶K消化-酚-氯仿法、PEG8000法、辛酸钠-酚-氯仿法、碱裂解法、柱抽提法,抽提血清中HBV DNA,比较各方法对PCR检测HBV DNA得率的影响,并在得率较高的方法中进行灵敏度、重复性的比较。采用辛酸钠法、辛酸钠-酚-氯仿法、碱裂解法处理单一抗-HBc阳性血清并进行套式PCR。结果辛酸钠-酚-氯仿法HBV DNA得率最高,辛酸钠法、碱裂解法、直接煮沸法、柱抽提法得率次之,蛋白酶K消化-酚-氯仿法及PEG8000法得率较低。辛酸钠-酚-氯仿法有较高的灵敏度,较好的重复性。在单一抗-HBc阳性血清中,辛酸钠-酚-氯仿法、辛酸钠法和碱裂解法的HBV DNA检测阳性率分别为35%、25%和20%。结论核酸抽提方法的不同直接影响HBV的PCR检测灵敏度。辛酸钠-酚-氯仿法在隐匿性HBV DNA检测中有较好的效果。     

石蜡包埋组织中结核杆菌DNA不同提取方法比较

目的探讨结核患者石蜡包埋组织中简易有效的结核杆菌DNA提取方法并进行验证。方法 20份4%甲醛固定石蜡包埋的肺或淋巴结结核组织标本,分别以氯化钠盐析法、酚-氯仿抽提法、一步法、试剂盒法提取其DNA,并通过琼脂糖凝胶电泳、聚合酶链反应(PCR)及膜芯片法分析所提取DNA的质量。结果氯化钠盐析法提取的DNA〔(19.338±6.270)μg〕和一步法提取的DNA〔(20.050±5.591)μg〕最多(P<0.001),一步法的A260/A280比值(1.044±0.137)明显低于其他3种方法(P<0.001);电泳结果显示4种提取方法均得到了基因组DNA;PCR与膜芯片验证显示除一步法外其余3种方法提取的DNA中均检测到结核杆菌DNA。结论氯化钠盐析法提取石蜡包埋组织结核杆菌DNA具有高效简便的特点,是较为理想的方法。     

用模糊综合评价法研究从外周血获取DNA标本的影响因素

目的：用模糊综合评价法研究从外周血获取DNA标本的主要影响因素，提供适合于分子流行病学调查时血液标本运输保存方式、血液标本类型、DNA提取方法。方法：采集40位健康志愿者静脉血，各自分成三种不同的类型(全血、血凝块、白细咆)，并随机将其分为四种方法进行保存，用四种常用方法提取DNA。使用模糊综合评价方法评价血液标本类型、DNA提取方法的优劣。结果：评价三种血液标本类型，血凝块提取DNA的综合评分最高，其次为全血和WBC；评价四种DNA提取方法，综合评分排列顺序为盐析法、TKM法、KI法、酚氯仿法。结论：各类样品应以低温运输与低温保存。如果开展较大规模的分子流行病学研究．综合各种因素，建议选取血凝块或全血样品，采用盐析法提取DNA。如特别要考虑DNA纯度可使用酚／氯仿法提取。     

从外周血获取DNA样本的方法学研究--分子流行病学研究方法探讨

目的研究从外周血获取DNA样本的主要影响因素,提供适合于分子流行病学调查时血液标本的处理方法、血液标本类型、DNA提取方法.方法采集40名健康志愿者静脉血,各自分成三种不同的类型(全血、血凝块、白细胞),并随机将其分为四种方法进行保存,用四种常用方法提取DNA.用方差分析比较DNA产量、纯度.分析比较各种条件下所提取DNA的质量.使用模糊综合评价方法评价血液标本类型、DNA提取方法的优劣.结果①DNA产量全血DNA产量最高,血凝块产量其次,白细胞产量最低;提取方法所获DNA产量高低依次为盐析法、酚/氯仿法、KI法、TKM法;样品在低温保存产量大于室温保存产量;3个月低温保存时,白细胞样品的DNA产量下降明显,血凝块DNA产量无明显变化.②DNA质量DNA提取方法中酚/氯仿法最优,盐析法与KI法相近,TKM法略差;从全血、白细胞中提取的DNA纯度略好于血凝块;室温保存样品对纯度有不良影响,特别是对白细胞和血凝快样品影响明显.结论各类样品应以低温运输与低温保存.如果开展较大规模的分子流行病学研究,综合各种因素,建议选取全血或血凝块样品,采用盐析法提取DNA.如特别要考虑DNA纯度可使用酚/氯仿法或KI方法提取.     

人血凝块提取基因组DNA碘化钾法建立

目的 通过与酚/氯仿法比较,建立一种快速、经济、高效从人血凝块提取基因组DNA的简易方法.方法采用双蒸水低渗破碎红细胞,碘化钾直接、快速裂解白细胞及其核膜,氯仿/异戊醇沉淀蛋白质及残存细胞碎片,最后经异丙醇和乙醇沉淀基因组DNA.结果 采用该法提取的基因组DNA浓度为(46.4±8.8)mg/L,吸光度值A260/A280为(1.79±0.23),与酚/氯仿法(46.1±8.3,1.78±0.22)比较差异无统计学意义(P>0.05);2种方法 提取基因组DNA凝胶电泳条带完整,PCR扩增目的 条带完整,能够满足分子生物学实验要求.结论 碘化钾法是一种快速、简便、经济、高效提取人血凝块基因组DNA的方法,可以广泛运用于大规模人群基因组学研究.     

Chelex-100法提取真核表达质粒pcDNA3-HERG的应用体会

目的探讨Chelex-100法提取先天性长QT综合征相关人类真核表达质粒pcDNA3-HERG的可行性。方法分别用Chelex-100法和碱裂解法提取pcDNA3-HERG质粒,将环状质性DNA酶切为线性,0.8%琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下检测质粒提取的有效性。结果用Chelex-100法和碱裂解法提取的pcDNA3-HERG质粒的OD（A260/A280）比较差异无统计学意义[分别为（1.8±0.6）,（1.9±0.4）,P〉0.05],经0.8%琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下检测均有特定的清晰条带。结论两种方法均能提取纯度较高的大肠杆菌质粒DNA,Chelex-100法简便、省时,值得推广。     

快速提取细菌DNA方法的研究

目的:研究快速、有效可以应用于压电基因传感器对病原微生物的快速检测的DNA的提取方法。方法:采用沸水浴法,酚、氯仿法,chelex1 0 0法和试剂盒法提取金黄色葡萄球菌ATCC2 5 92 3、铜绿假单胞菌ATCC 2 785 3和大肠杆菌ATCC 2 5 92 2的DNA对产物进行纯度和产量测定,并对1 6SrDNA区域利用通用引物进行扩增。初步应用自行研制的压电基因传感器检测金黄色葡萄球菌ATCC2 5 92 3的PCR产物。结果:除沸水浴法,其他3种方法均能抽提出3种细菌的DNA与1 0 0法和酚、氯仿法抽提产物的纯度和产量差异无显著性(P >0 .0 5 ) ,但chelex1 0 0法操作更为简单、成本低;试剂盒法抽提出的产物纯度和产量明显高于酚、氯仿法、chelex1 0 0法P <0 . 0 5 ) ,但成本高,操作繁琐。结论:chelex1 0 0法操作简便、省时、成本低,适宜用于压电传感器样本的预处理。     

不同的DNA提取法对两种常见医院感染菌ERIC-PCR鉴定的影响研究

目的研究不同基因组DNA提取方法,对肠杆菌基因间保守重复序列聚合酶链反应（ERIC-PCR）鉴定两种菌株的影响。方法采用5种基因组DNA提取法,分别为化学裂解酚/氯仿法、玻珠击打法、Triton X-100直接裂解法、Triton X-100煮沸裂解法、水煮法对1株肺炎克雷伯菌和1株大肠埃希菌基因组DNA进行提取,在相同的扩增条件下对不同方法提取的DNA模板进行ERIC-PCR。结果不同菌株基因组DNA经ERIC-PCR扩增后产生不同的电泳图谱,而用不同方法提取同一菌株DNA可以得到非常相似的电泳图谱。结论Triton X-100直接裂解法、Triton X-100煮沸裂解法、水煮法可以作为操作简单的DNA提取法用于细菌基因分型。     

Chelex-100法和碱性裂解法提取细菌DNA的比较

目的:通过对两种DNA提取方法的比较,寻找一种灵敏、快速、经济实用的提取方法.方法:采用Chelex-10{3法和碱性裂解法分别提取不同浓度大肠杆菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923的DNA,利用通用引物扩增16SrDNA片段检测两种方法的灵敏度.结果:碱性裂解法提取的不同浓度的两种细菌DNA,经PCR扩增均未显出目的条带;chelex-100法提取不同浓度的两种细菌DNA均扩增出目的条带,PCR检测大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的灵敏度均为1.2×101cfu/ml,电泳结果提示相同浓度的大肠杆菌被提取到的DNA含量比金黄色葡萄球菌的含量高.结论:Chelex-100法操作简便,可用于细菌DNA的快速提取.     

核酸提取方法对乙肝病毒定量PCR检测结果的影响

目的寻找简单、快速地提取血清乙型肝炎病毒(HBV)DNA并能应用于定量PCR测定的方法. 方法使用碱裂解法、酚氯仿法和煮沸裂解法同时提取血清HBV-DNA,比较荧光定量PCR测定的重复性和测定值的差异. 结果碱裂解法所得HBV-DNA量高于酚氯仿法和煮沸裂解法(P＜0.05),并且碱裂解法所得结果的重复性好于酚氯仿法和煮沸裂解法(CV分别为0.21,0.28和0.33). 结论碱裂解法提取HBV-DNA简单、快速,适用于HBV-DNA荧光定量测定.     

鼠疫PCR中模板制备方法的比较研究

[目的]比较3种模板制备方法对鼠疫PCR的检测结果比较。[方法]对鼠疫菌培养物及感染动物脏器组织标本分别用直接水浴煮沸、酚-氯仿提取和NaI裂解-玻璃粉吸附等3种方法制备模板，用UDPE（UDG-DuplexPCR-EIA)法检测效果。[结果]对细菌培养物，直接水浴煮沸和NaI裂解-玻璃粉吸附法制备的模板均能检出0.05个菌/μl，对脏器组织，NaI裂解-玻璃粉吸附法检出率高于酚-氯仿提取法，直接水浴煮沸法未能检出阳性。[结论]NaI裂解-玻璃粉吸附法较其它方法操作简便、灵敏。     

三峡库区沿江口岸鼠类及其分子鉴定特征研究

目的以三峡库区沿江口岸捕获的鼠类为研究对象,应用DNA条形码技术进行鼠类鉴定,分析各种鼠类的分子鉴定特征。方法在三峡库区沿江口岸采集鼠类标本,并保存整只鼠体,制作标本用于形态学鉴定,采集肝脏或肌肉组织,提取DNA,采用通用引物PCR法扩增细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因,并测序。将测序结果与Gen Bank中其他鼠类的DNA条码进行Blast比对,并构建分子进化树。结果共捕获4种61只鼠类,其中42份样本通过PCR扩增获得特异性COⅠ基因条带,所构建的分子进化树结果与形态学鉴定结果一致,但不同口岸鼠类在分子进化水平存在一定差异。结论分子鉴定技术能够应用于对三峡库区口岸鼠类进行有效的物种鉴定。     

改良碘化钾法提取冻存外周血基因组DNA的方法探讨

目的探讨用改良碘化钾法(改良法)提取长期冻存外周血基因组DNA的方法。方法对碘化钾(KI)法加以改良,包括:血量由100μL增加到200μL;使用0.9%NH4CL溶液代替无菌重蒸馏水裂解红细胞;增加裂解白细胞膜的5mol/LKI溶液的用量(为70μL);低温(4℃)离心。然后用改良碘化钾法从82份-80℃冻存外周血标本中提取基因组DNA。同时使用碘化钾法提取其中的30份血标本,比对两种方法提取DNA的浓度和纯度,并进行CYP2C19相关基因PCR扩增。结果两种方法所提取的DNA浓度和纯度分别是碘化钾法为128.2±34.9μg/mL和A260/A2801.74±0.08,改良法为220±91.29μg/mL和A260/A2801.87±0.12。改良法获得的DNA纯度更高,差异有统计学意义(P<0.01),通过增加样本量及对方法进行改良获得的DNA量较多。对改良后方法提取的基因组DNA进行PCR扩增,结果稳定。结论改良碘化钾法从长期冻存外周血中所提取的基因组DNA质量较高,能够满足对临床冻存样本研究的需求。     

应用实时荧光定量PCR检测鼠类生境样本鼠疫耶尔森氏菌的研究

目的评价应用实时荧光定量PCR(RT-PCR)方法检测鼠类生境样本中鼠疫耶尔森氏菌的可行性和有效性。方法优选、评价鼠类生境样本DNA提取方法,提取疫区鼠类洞穴土壤、粪便等生境样本中DNA,应用RT-PCR试剂盒检测鼠疫耶尔森氏菌特异性pla基因。结果柱式土壤DNAout法提取DNA效果最好,回收率是24.54%。联合应用柱式土壤DNAout法和RT-PCR法检测鼠类生境样本,鼠疫耶尔森氏菌pla基因的阳性率为3.44%(10/291)。结论应用柱式土壤DNAout法提取鼠类生境样本DNA,RT-PCR法可以检测到鼠类生境中鼠疫耶尔森氏菌pla基因。     

聊城市麻疹疑似病例血清学检测和麻疹病毒的基因分型

[目的]确定麻疹疑似病例的诊断和麻疹病原毒株的基因分型,为麻疹的预防提供科学理论依据.[方法]采集麻疹疑似病人的血清和病人的咽拭子标本,检测麻疹抗体和分离麻疹病毒.用ELISA法检测麻疹抗体,用酚-氯仿抽提法提取病毒悬液中的RNA,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增N碳末端的核苷酸450个(bp)片段.对扩增产物进行序列测定和基因分型. [结果]从110份麻疹疑似病例中检测出69份麻疹抗体阳性,同时从该69例病人的咽拭子中分离出19株H1基因型麻疹病毒,其中H1a亚型14株,H1b亚型5株. [结论]最近几年我市的麻疹流行是由H1基因型麻疹病毒引起,并且流行株出现了变化.     

血痕中乙型肝炎病毒DNA检测

目的 探讨血痕标本检测乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)的方法.方法 以血痕标本为检材,采用Chelex-100法制备模板DNA,再以巢氏PCR法扩增HBV目的 片段,建立并优化反应条件,分析该法的特异性与敏感性,并将该法检测乙肝病毒感染者的结果与酶联免疫吸附法(ELISA)的检测结果利用配对X2检验进行比较.结果 Chelex-100法与巢式PCR法相结合的检测方法,可从仅3 mm×3 mm的乙肝病毒感染者血痕标本中扩增出193 bp的HBV-DNA特异片段,最低检出量(灵敏度)为5拷贝/μL;本检测法与ELISA法的阳性检出率比较差异无统计学意义(P＞0.05);2种方法的检测结果一致(Kappa系数=0.727).结论 建立了一种灵敏、特异、检材用量少的检测方法,弥补了常规检测方法需以新鲜血液为检材的不足,可用于血痕标本的HBV-DNA检测,对大规模的分子流行病学调查及血液银行的建立提供技术支持.     

郑州市医院1990年婴幼儿轮状病毒腹泻分子流行病学分析

<正> 1990年9月—12月、郑州市婴幼儿急性腹泻流行,我们用聚丙烯酰胺电泳(PAGE)法进行了软状病毒分子流行病学调查,现报告如下。材料与方法 1、标本来源:1990年9月—12月30日,从本市儿童医院、四院、河南医学院第一附属医院收集0—4岁婴幼儿急性腹泻粪便标本117份,放-20℃保存备用。 2、标本处理:取粪便0.1g或粪液0.1ml于小塑料管中,加0.4ml醋酸钠(含1％SDS)和酚、氯仿提取,充分混匀后,1000转/分离心5分钟,取上清液再用酚、氯仿提取一次,含双链RNA的上层液     

国境口岸首次截获贪食睡鼠的分子鉴定及核酸序列分析

目的利用分子鉴定技术,对辽宁大窑湾口岸截获的1只鼠样本(从来自塞尔维亚的原木的集装箱中采集)进行种类鉴定。方法提取已风干鼠样本的基因组DNA,采用动物线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ(COⅠ)的通用引物(COⅠ-1和COⅠ-2),进行靶DNA扩增并进行核酸序列分析。结果截获鼠样本的DNA条形码序列与Gen Bank中贪食睡鼠(Glis glis)的序列相似性最高为100%,鉴定为贪食睡鼠。为国境口岸首次截获该鼠种。结论加强出入境交通工具及集装箱鼠类监测工作,保障国境口岸的卫生安全。     

侵袭性牙周炎牙龈组织中TIMP1基因表达多态性研究

目的：探讨TIMP1基因表达多态性与汉族人群侵袭性牙周炎（AP）易感性的关系。方法：收集汉族重度AP女性患者36例及35名无牙周炎女性对照者的牙龈组织，采用标准酚一氯仿抽提法和蛋白酶K消化法提取DNA。用甲基化敏感的限制性内切酶PCR法测定TIMP1基因的甲基化修饰情况，分析对照组与患者组基因表达的差异。结果：重度女性AP患者组中两条X染色体上TIMP1基因都处于去甲基化状态的比例高于对照组，差异有统计学意义。结论：TIMP1基因表达多态性可能与汉族人群AP的易感性有关。