大鼠β神经生长因子前体基因的克隆及其真核表达载体pEGFP-NGF的构建

目的克隆大鼠脑组织中神经生长因子(NGF)β亚基前体的全长序列,构建其真核表达载体pEGFP-NGF。方法采用RT-PCR方法扩增NGFβ亚基前体的全长序列,克隆入载体pMD18-T,转化大肠杆菌JM109,挑选白色菌落行酶切鉴定、PCR鉴定及序列分析;利用高保真Taq酶自重组质粒pMD 18-T／NGF中扩增目的基因NGF,将目的基因与真核表达载体pEGFP-N1行双酶切,T4连接酶连接,转化大肠杆菌DH-5α,挑选白色菌落行酶切鉴定。结果pMD 18-T／NGF测序结果与GenBank的序列完全一致,pEGFP-NGF、行限制性内切酶HindⅢ、BamHⅠ酶切,可见酶切片断与插入基因长度相符。结论成功从大鼠脑组织中克隆神经生长因子(NGF)β亚基前体的全长序列,并构建其真核表达载体pEGFP-NGF,为从分子水平开展NGF转基因相关研究奠定了基础。     

人酸性成纤维细胞生长因子真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人酸性成纤维细胞生长因子真核表达载体pEGFP-N1-haFGF。方法 PCR扩增人酸性成纤维细胞生长因子（haFGF）基因,BglⅡ和HindⅢ双酶切后克隆入真核表达载体pEGFP-N1,构建haFGF真核表达载体pEGFP-N1-haFGF,并经限制性酶谱分析和DNA测序对重组表达载体的正确性进行鉴定。结果重组真核基因表达载体pEGFP-N1-haFGF经限制性内切酶BglⅡ和HindⅢ酶切,DNA电泳显示465 bp的haFGF目的片段和4 700 bp的pEGFP-N1载体片段,重组载体经DNA测序显示所克隆的haFGF基因核苷酸顺序与Genbank中记载的haFGF序列一致。结论本实验成功构建人酸性成纤维细胞生长因子真核表达载体,为进一步研究haFGF的功能奠定基础。     

人PPARa受体cDNA全长序列的克隆及测序

目的 对人过氧化物酶体增殖物激活受体α（hPPARα）全长cDNA序列进行克隆并测序，为构建含hPPARα基因真核表达载体奠定基础。方法 通过逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）从HepG2细胞总RNA克隆hppARα全长cDNA序列。胶回收目的条带后与pMD19-T载体连接并转化DH5α感受态菌，用BamH Ⅰ、Sal Ⅰ双酶切及基因测序筛选鉴定阳性克隆pMD19-hPPARα-T载体中hPPARα基因的完整性和忠实性。结果经酶切和DNA测序证实pMD19-hPPARα-T载体中插入的hPPARa基因序列与GeneBank中提交的序列（NM001001928）一致。结论 成功克隆了hPPARa基因，构建了pMD19-hPPARα-T中间载体，为含hPPARa基因真核表达载体的构建奠定了基础。     

人canstatin基因克隆及其重组蛋白表达

目的克隆人血管能抑素canstatin基因,重组表达canstatin蛋白.方法从人胎盘组织中提取总RNA做模板,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法扩增canstatin cDNA,转入克隆载体pUCm-T,再转化E.coli DH5α,挑选阳性克隆,测定基因序列.酶切克隆载体目的基因,插入表达载体pET-22b( ),转化E.coli BL21,诱导表达重组蛋白.结果RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳证实与目的基因长度一致.RT-PCR产物与pUCm-T的连接产物转化E.coli DH 5α,篮白斑筛选后,选6个白色菌落做酶切鉴定,证实其中1个为阳性克隆,测序结果与GenBank公布的canstatin基因序列完全一致.将pUCm-T上目的基因片段酶切后插入pET-22b( ),转化E.coli BL21,挑选7个菌落做酶切鉴定,证实均为阳性克隆.IPTG诱导其中1个克隆表达重组蛋白,SDS-PAGE电泳分析表明在相对分子质量24 000左右出现新的蛋白条带.结论成功克隆出canstatin基因,重组表达出canstatin蛋白,为进一步研究其临床应用打下基础.     

人可溶性血管内皮生长因子受体-2基因的克隆与鉴定

目的获取人可溶性血管内皮生长因子受体-2(sKDR)基因,构建sKDR基因真核表达载体,为进一步研究sKDR抗肿瘤血管生成的基因治疗奠定基础。方法提取人胎盘组织总RNA,利用RT-PCR方法扩增获得sKDR基因cDNA,将其克隆到pMD18-T载体中,测序证实后,用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切pMD18-T-sKDR重组载体,胶回收sKDR基因,再将其定向亚克隆到真核表达载体pCMV-Script中,提取质粒做双酶切和测序鉴定。结果构建的重组sKDR基因真核表达载体pCMV-Script-sKDR分别做双酶切和测序鉴定,证实其中含有sKDR基因,测序结果经BLAST分析,与预期设计的编码区cDNA序列一致。结论成功克隆了人sKDR基因的真核表达载体。     

人可溶性血管内皮生长因子受体-1基因的克隆与鉴定

目的获取人可溶性血管内皮生长因子受体-1(sFlt-1)基因,构建sFlt-1基因真核表达载体,为进一步研究sFlt-1抗肿瘤血管生成的基因治疗奠定基础。方法提取人胎盘组织总RNA,利用RT-PCR方法扩增获得sFlt-1基因cDNA,将其克隆到pUCm-T载体中,测序证实后,用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切pUCm-T-sFlt-1重组载体,胶回收sFlt-1基因,再将其定向亚克隆到真核表达载体pCMV-Script中,提取质粒作双酶切和测序鉴定。结果构建的重组sFlt-1基因真核表达载体pCMV-Script-sFlt-1分别作双酶切和测序鉴定,证实其中含有sFlt-1基因,测序结果经BLAST分析与预期设计的编码区cDNA序列完全一致。结论成功克隆了人sFlt-1基因的真核表达载体。     

人PPARδ受体cDNA全长序列的克隆及测序

目的:对人过氧化物酶体增殖物激活受体δ(hPPAR δ)全长cDNA序列进行克隆并测序,为构建含hPPAR δ基因真核表达载体及其受体功能研究奠定基础.方法:采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)从HepG2细胞总RNA克隆hPPAR δ全长cDNA序列,胶回收目的条带后与pMD19-T载体连接并转化DH5α感受态菌,用BamH Ⅰ、Sal Ⅰ双酶切及基因测序筛选、鉴定阳性克隆pMD19-hPPARδ-T载体中hPPARa基因的完整性和忠实性.结果:经酶切和测序证实pMD19-hPPARδ-T载体中插入的hPPARδ基因序列与GeneBank中提交的序列(AY919140)一致.结论:成功克隆了hPPARδ基因,构建了pMD19-hPPARδ-T中间载体,为含hPPARδ基因真核表达载体的构建和受体功能研究打下了良好的基础.     

人PPARα受体cDNA全长序列的克隆及测序

目的对人过氧化物酶体增殖物激活受体α(hPPARα)全长cDNA序列进行克隆并测序,为构建含hPPARα基因真核表达载体奠定基础。方法通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)从HepG2细胞总RNA克隆hPPARα全长cDNA序列,胶回收目的条带后与pMD19-T载体连接并转化DH5α感受态菌,用BamH I、Sal I双酶切及基因测序筛选鉴定阳性克隆pMD19-hPPARα-T载体中hPPARα基因的完整性和忠实性。结果经酶切和DNA测序证实pMD19-hPPARα-T载体中插入的hPPARα基因序列与GeneBank中提交的序列(NM001001928)一致。结论成功克隆了hPPARα基因,构建了pMD19-hPPARα-T中间载体,为含hPPARα基因真核表达载体的构建奠定了基础。     

碱性成纤维细胞生长因子真核荧光表达载体的构建

目的：构建可在真核细胞中表达碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的真核表达载体,为进一步开展bFGF基因治疗缺血性脑血管疾病奠定基础。方法：①采用线栓法建立SD大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血模型,取缺血灶周围脑组织经逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增bFGF基因;②将bFGFDNA克隆到pGEM-TEasy质粒,经菌落PCR和HindⅢ和EcoRI双酶切鉴定;③然后将bFGF DNA亚克隆到pEGFP-N3质粒;通过抗性基因筛选阳性克隆,经菌落PCR、酶切和测序鉴定。结果：菌落PCR、酶切和DNA序列鉴定均证实插入片段与GenBank报道的bFGF基因序列一致。结论：经RT-PCR反应得到了特异的bFGF基因片段并成功构建了bF-GF荧光真核表达载体。     

家兔C型利钠肽基因真核表达载体的构建及鉴定

目的为开展C型利钠肽(CNP)基因治疗构建家兔CNP基因真核表达载体。方法通过RT-PCR从家兔腹主动脉组织中克隆CNP基因全长编码区,将该DNA片段亚克隆至克隆载体pMD 18-T中,用PstⅠ单酶切筛选出负向插入片段,用HindⅢ和KpnⅠ双酶切将目的DNA片段定向克隆至真核表达质粒pEGFP-N1中,然后用双酶切、DNA序列测定鉴定方法对重组质粒进行鉴定。结果酶切及测序鉴定证实,家兔CNP基因全长编码区被准确插入到pEGFP-N1酶切位点HindⅢ和KpnⅠ中。结论含家兔CNP基因真核表达载体的成功构建和鉴定为CNP基因治疗的研究奠定了基础。     

人角化上皮生长因子基因(hKGF)达载体对大鼠肺泡Ⅱ型细胞增殖的影响

目的:构建人角化上皮生长因子基因真核表达载体pEGFP-C2-hKGF,为以后的hKGF基因功能和基因治疗研究提供实验材料.方法:提取人胚肺成纤维细胞(HLF)总RNA,逆转录酶-多聚酶链式反应(RT-PCR)扩增hKGF基因全长cDNA序列,经与pMD18-T载体连接、筛选、克隆、抽提质粒和双酶切后,将纯化的hKGF基因cDNA全长序列插入绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C2中,筛选、克隆、抽提质粒,从而构建hKGF基因真核表达载体pEGFP-C2-hKGF.载体转染后大鼠肺泡Ⅱ型细胞进行免疫细胞化学及荧光显微镜鉴定,并进行细胞记数,绘制生长曲线.结果:经RT-PCR获得609bp含限制性内切酶位点的DNA片段,T载体克隆后经双酶切、测序,确定该片段为hKGF基因cDNA,进而构建hKGF真核表达载体pEGFP-C2-hKGF,经双酶切,测序确证.转染载体后,有hKGF的阳性表达并随时间逐渐增加,大鼠肺泡Ⅱ型细胞也随时间出现明显分裂增殖.结论:成功构建hKGF基因真核表达载体pEGFP-C2-hKGF,为进一步应用于基因治疗研究提供工具.     

人DNA聚合酶β全长cDNA的克隆、鉴定及真核表达载体的构建

【目的】克隆人类DNA聚合酶 (pol β)基因全长cDNA ,构建该基因的真核高效表达载体。【方法】抽提人胚肺纤维细胞HLF总RNA进行RT PCR扩增 ,用pGEM T载体经T/A克隆、DNA测序确定后 ,用双酶切将 pol β全长cDNA定向克隆到绿色荧光蛋白表达载体 pEGFP C1,转染大肠杆菌DH5α ,筛选阳性克隆 ,双酶切鉴定重组质粒。【结果】经RT PCR获得 1 0 3kb的产物 ,经DNA测序 ,确定所扩增片段为人类 pol β基因全长cDNA ,进而成功筛选出真核表达载体 pEGFP C1 β。【结论】成功构建人 pol β基因全长cDNA真核表达载体 ,为进一步建立该基因的高表达细胞株提供基础     

乙肝病毒全长基因组真核表达载体构建

目的构建乙肝病毒全长基因组真核表达载体。方法PCR一步法扩增乙肝病毒全长基因组;乙肝病毒基因组和真核表达载体pcDNA3.1( )经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切,连接并转化大肠杆菌DH5α。结果PCR、酶切和测序表明乙肝病毒全长基因组成功插入真核表达载体pcDNA3.1( )。结论成功构建乙肝病毒全长基因组真核表达载体。     

人自噬基因hAPG_(12)的克隆及其重组真核表达载体的构建

目的:探讨克隆人自噬基因h APG12 ,构建重组真核表达载体p EGFP- C2 -h APG12 ,为进一步研究h APG12 的功能奠定基础。方法:从正常人外周血单个核细胞中提取总RNA,采用两步法RT- PCR,首先把RNA逆转录为c DNA,而后通过一对h APG12 的特异性引物扩增出目的基因,PCR产物与测序载体p UC18连接后转化到大肠杆菌DH5 α,而后对单菌落进行菌落PCR、酶切和测序鉴定。将测序正确的h APG12 亚克隆入真核表达载体p EGFP-C2 ,该重组载体转化到大肠杆菌DH5 α后进行菌落PCR和酶切鉴定。结果:测序结果表明从正常人外周血单个核细胞中所获得的h APG12 c DNAs含有2 2 5个碱基,与Genbank( BC0 1 1 0 33)序列完全一致。构建的重组真核表达载体经鉴定证实h APG12 基因已完全正确亚克隆到p EGFP- C2 。结论:成功克隆了人自噬基因h APG12 并构建了具有报告基因-增强绿色荧光蛋白( EGFP)基因的重组真核表达载体p EGFP- C2 - h APG12 ,为以后研究h APG12 的功能奠定基础     

人核糖体蛋白S13编码基因的克隆及其正反义真核表达载体的构建

目的：克隆人核糖体蛋白S13(RPS13)cDNA片编码区全长序列，构建其正、反义真核表达载体，以进一步研究RPS13基因与胃癌多药耐药的关系。方法：采用RT-PCR法扩增RPS13cDNA片段编码区全长序列，DNA重组技术构建其正、反义真核表达载体。结果：RT-PCR法成功扩增了RPS13cDNA片段编码区全长序列，经DNA序列分析，证实与文献报道的人RPS13编码区序列一致。目的基因分别按正、反两个方向亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1（ ），并经酶切鉴定证实。结论：成功克隆了人RPS13编码区全长基因序列，并构建了正、反义真核表达载体。     

四环素诱导性人肝细胞生长因子真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建四环素诱导性人肝细胞生长因子（HGF）真核表达载体。方法 运用基因重组技术,将人HGF cDNA全长序列,定向克隆于四环素诱导性真核表达载体pBI-L多克隆位点MluⅠ和SalⅠ之间,限制性内切酶酶切和测序鉴定。结果 重组pBI-L-HGF真核表达载体经限制性内切酶酶切,与理论值相符;测序结果与GenBank比对,序列正确。结论 本实验成功构建人HGF四环素诱导性真核表达载体pBI-L-HGF,为今后临床开展HGF基因治疗提供了一种安全可调控的基因治疗策略。     

人甲状腺刺激激素受体cDNA的克隆及真核表达载体的构建

目的克隆人甲状腺刺激激素受体(hTSHR)基因cDNA并构建其真核表达载体。方法以人甲状腺组织cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增hTSHR基因编码区的全部序列,克隆入pGEM-T载体中,经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,并进行双酶切鉴定。结果PCR扩增的特异性片段长度为2 337 bp,以此构建的pGEM-T-hTSHR克隆载体,经限制性内切酶酶切及DNA序列分析证实载体中带有hTSHR基因编码区的目的片段,重组质粒pcDNA3.1-hTSHR经KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后显示5 1000 bp和2 300 bp左右的2个条带,DNA序列分析显示与GenBank中的hTSHR基因cDNA序列一致,证明hTSHR基因已成功克隆入真核细胞表达载体pcDNA3.1中。结论成功构建了野生型pcDNA3.1-hTSHR重组真核表达载体。     

重组Sox5蛋白cDNA克隆与真核表达载体的构建

目的 克隆人类睾丸组织特异的Sox5基因全长cDNA，构建重组Sox5真核表达载体pcDNA3-Sox5。方法 从成人睾丸组织提取总mRNA，采用RT-PCR技术扩增SoxScDNA片段，并将扩增的cDNA片段插入pcDNA3真核表达质粒，双酶切及测序鉴定重组质粒。结果 经RT-PCR获得1．1kb的产物，连接重组后经双酶切筛选阳性克隆，DNA测序验证，确定成功筛选出真核表达载体pcDNA3Sox5。结论 成功构建人Sox5基因全长cDNA真核表达载体，为进一步探索精细胞特异表达的Sox5转录因子是否参与ZNF30的转录调控打下了基础。     

未知基因CGI-100的克隆及其真核表达载体的构建

目的:为探讨研究未知基因CGI-100的功能,克隆人CGI-100基因并构建其真核表达载体.方法:通过RT-PCR从人白血病K562细胞中克隆CGI-100基因全长编码区,将该cDNA片段亚克隆至载体pMD18-T SimpleT中,经测序鉴定后,用BamH Ⅰ和Pst Ⅰ双酶切将目的cDNA片段定向克隆至相同处理的pIRES2-EGFP真核表达质粒中,然后经酶切、PCR鉴定和DNA序列测定三重鉴定方法对重组质粒进行鉴定.结果:经酶切、PCR及测序鉴定证实,CGI-100基因全长编码区cDNA被准确正向插入至pIRES2-EGFP质粒的酶切位点BamH Ⅰ和Pst Ⅰ之间,未发现碱基突变或移位.结论:成功地构建并鉴定了含CGI-100基因全长编码区的真核表达质粒,为以后研究该基因的功能奠定了基础.     

结缔组织生长因子的克隆及其真核表达载体的构建

目的结缔组织生长因子(CTGF)在肿瘤发生,胚胎发育、骨折愈合、细胞增殖和分化、血管形成等众多领域都有着重要的作用,对结缔组织生长因子进行克隆及构建其真核表达载体,对其在功能上的进一步研究及应用有积极意义.方法以含有鼠CTGF基因序列的EST克隆为模板,通过PCR的方法克隆出目的基因CTGF,再以分子克隆学的方法将CTGF克隆入真核表达载体pAdTrack-CMV,进一步以PCR、酶切、DNA测序的方法筛选出正确的真核表达质粒.并通过Western-Blotting的方法对质粒的表达功能进行研究.结果 PCR、酶切、DNA测序的方法均证实已经成功克隆获得序列正确的目的基因CTGF,并将CTGF克隆入真核表达载体pAdTrack-CMV.Western-Blotting的结果表明构建的表达CTGF的真核表达载体高表达CTGF蛋白质.结论成功克隆目的基因CTGF并构建其真核表达质粒,证实在蛋白质水平获得了表达.