野生型p53基因重组质粒的构建及对人卵巢癌细胞的抑制作用

目的:研究p53基因转染对卵巢癌细胞系SKOV-3生物学行为的影响.方法:用分子克隆技术构建人野生型p53基因与真核细胞表达载体PCNDA3的重组体(PCNDA-p53),并用脂质体介导的转染技术,将其导入不表达p53的人卵巢癌SKOV-3细胞中,经筛选、鉴定后,观察细胞生长速度、集落形成能力和增殖周期的变化.结果:成功地构建了人野生型p53基因与真核细胞表达载体的重组体,转染后获得稳定表达p53的转染克隆.外源性p53基因的表达明显抑制了卵巢癌细胞的生长速度及集落形成能力,使细胞阻滞于G1期.结论:外源性野生型p53基因能抑制卵巢癌细胞的增殖.     

p53基因治疗与放疗联合作用对卵巢癌细胞的杀伤效果

目的：探讨外源性p53基因转染与放疗联合作用对人卵巢癌细胞的杀伤效果。方法：用脂质体介导的转染技术，将人野生型p53基因的真核表达载体及不含p53基因的空载体分别导入不表达p53的卵巢癌SKOV-3细胞中，经G418筛选，Northern blot及Western blot鉴定后，观察X射线照射对其集落形成的影响。结果：外源性p53基因在转染细胞中有效表达。经X射线照射后，转染p53基因组的SKOV-3细胞的集落形成数与转染空载体组及未转染的SKOV-3细胞组相比，明显降低。结论：外源性p53基因能增加卵巢癌细胞对放射线的敏感性，2者联合作用能更有效地杀灭肿瘤细胞。     

重组腺病毒介导的人野生型p53,GM-CSF和B7-1基因在胰腺癌细胞中的表达

目的: 以复制缺陷型重组腺病毒为载体,使用人野生型p53基因、人GM-CSF基因和B7-1基因为目的基因,探讨三基因在胰腺癌细胞BxPC-3中的表达.方法: 免疫组织化学方法检测外源性p53蛋白在BxPC-3细胞中表达.ELISA方法测定GM-CSF表达量;流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测BxPC-3细胞转染B7-1的表达效果.结果: 重组腺病毒介导的p53基因、GM-CSF基因、B7-1基因在BxPC-3细胞中得到高效表达.结论: 重组腺病毒介导的外源基因在BxPC-3细胞中得到高效的表达,为进一步探讨其体内外治疗胰腺癌的实验研究提供了理论基础.     

siRNA抑制survivin的表达诱导人卵巢癌SKOV-3细胞凋亡的研究

目的筛选能有效抑制survivin基因表达的小干扰RNA(siRNA),探讨survivin基因抑制对人卵巢癌SKOV-3细胞凋亡的影响。方法设计3段survivin siRNA靶位点,用PCR扩增siRNA表达框,与survivin-绿色荧光蛋白融合基因表达质粒共转染293T细胞,再构建有效siRNA的表达载体,转染卵巢癌SKOV-3细胞,分析sur-vivin基因的表达及细胞凋亡情况。结果筛选出了1段能高效抑制survivin表达的siRNA,能显著下调SKOV-3细胞内的survivin表达,并导致SKOV-3细胞凋亡。结论利用RNA干扰能有效抑制survivin基因表达并诱导人卵巢癌SKOV-3细胞凋亡,为进一步的靶向survivin分子的体内抗肿瘤研究奠定了基础。     

人孕酮受体膜组分1表达载体的构建及其重组蛋白对体外血管形成的诱导作用

目的: 构建含人孕酮受体膜组分（progesterone receptor membrane component,PGRMC）1的重组表达质粒,转染人卵巢癌细胞,研究其调控卵巢癌细胞血管生成的作用。方法: 以卵巢癌细胞为模板,采用PCR技术扩增PGRMC1基因编码序列,插入真核载体pSecTag-2B构建重组表达载体;然后,将重组载体pST PGRMC1分别转染人胚肾上皮细胞HEK293T和卵巢癌细胞SKOV-3,采用蛋白质印迹法检测PGRMC1蛋白的表达;实时荧光定量PCR检测卵巢癌细胞中VEGF mRNA的变化,用ELISA法检测上清液中VEGF的分泌情况。体外血管生成实验进一步观察PGRMC1促进体外血管生成的情况。结果： 重组表达载体pST PGRMC1构建成功,重组蛋白PGRMC1在HEK293T和SKOV-3细胞中都能够表达;PGRMC1过表达可促使卵巢癌细胞合成VEGF,并且促进体外血管的形成。结论： 重组蛋白PGRMC1在促进卵巢癌细胞体外血管形成中起着重要作用,可能促进卵巢癌细胞的远处转移。     

微小RNA-495-3p在卵巢癌组织的表达及对卵巢癌细胞凋亡和增殖的影响

目的 观察微小RNA-495-3p(miR-495-3p)在卵巢癌组织和细胞株的表达,并探讨 miR-495-3p对卵巢癌BGC823细胞增殖和凋亡的影响。方法 采用荧光实时定量聚合酶链反应(qPCR)检测10例卵巢癌组织和癌旁组织miR-495-3p表达,并检测miR-495-3p在4种卵巢癌细胞株(A2780、SKOV-3、HO-8910、OC3)及正常卵巢上皮细胞IOSE80的表达。选取miR-495-3p表达水平最低的卵巢癌细胞瞬时转染miR-495-3p或miR-NC。qPCR法检测miR-495-3p表达。流式细胞仪检测细胞凋亡率。细胞计数试剂盒(CCK-8)法和平板克隆实验分别检测细胞活力和增殖能力。生物信息学软件microrna.org预测miR-495-3p的靶基因。qPCR和Western blot法检测miR-495-3p靶基因表达。采用荧光素酶报告基因实验验证miR-495-3p对靶基因核因子蛋白(NF90)的靶向作用。结果 卵巢癌组织miR-495-3p相对表达水平较癌旁组织显著降低(P<0.01)。卵巢癌细胞株中miR-495-3p表达水平明显低于正常卵巢上皮细胞(P<0.05),SKOV-3细胞表达最低。与miR-NC组比较,转染 miR-495-3p能够明显诱导SKOV-3细胞凋亡(P<0.01),抑制SKOV-3细胞的活力和增殖能力(P<0.01),且NF90表达明显下调(P<0.01),miR-495-3p可与NF90-3′-非编码区(UTR)特异性结合,降低荧光值(P<0.01)。结论miR-495-3p在卵巢癌组织和细胞株呈低表达,上调miR-495-3p表达能够通过干扰NF90基因的表达诱导卵巢癌BGC-803细胞的凋亡和抑制细胞的增殖。     

转染野生型p53基因对肝癌细胞生长的影响

目的：通过转染野生型p53基因致肝癌细胞株BEL-7404，研究其对肝癌细胞的生长及凋亡作用。方法：野生型p53基因通过脂质体Lipofectamine介导转染人肝癌细胞株BEL-7404。用四甲基偶氮唑（MTT）法测定细胞生长曲线，用流式细胞仪进行细胞凋亡分析。结果：肝癌细胞BEK-7404转染野生型p53基因后，其生长作用明显受到抑制．细胞生长抑制率在第4天可达50．8％。流式细胞仪分析细胞凋亡结果：阴性对照组为1．7％，转染pUHD10-3组为3．2％．转染pUHD10-3-p53组为40．7％。结论：野生型p53基因可诱导肝癌细胞BEL-7404的生长抑制及发生凋亡。     

hTERT启动子调控的PUMA腺病毒转染卵巢癌COC1细胞的研究

目的：探讨卵巢癌COC1细胞中大量表达p53正向凋亡调控因子（PUMA）在抑制COC1细胞中的作用。方法采用人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子调控的PUMA基因腺病毒载体（Ad-hTERT-PUMA）转染卵巢癌COC1细胞,通过细胞活性检测试剂盒和凋亡试剂盒研究COC1细胞的生长情况,同时分析表达PUMA的水平。结果转染Ad-hTERT-PUMA后,PU-MA大量表达,抑制COC1细胞生长,促进细胞凋亡。结论Ad-hTERT-PUMA成功转染卵巢癌COC1细胞并大量表达,起到了抑制卵巢癌细胞增长的作用。     

转染野生型p53基因对人肝癌细胞生长的抑制作用

目的 研究转染野生型p53基因对人肝癌细胞的生长影响作用。方法 将克隆有野生型p53基因的pUHD10-3质粒,通过Lipofectin转染肝癌细胞株BEL-7402、BEL-7404、HLE、HUH-7及SMMC-7721,用四甲基偶氮唑(MTT)法观察细胞的生长情况。结果 转染野生型p53基因,可使肝癌细胞BEL-7404、HLE、HuH-7的生长明显受到抑制,第4天生长抑制率分别是50．0％、69．0％及65．1％。结论 转染野生型p53基因能有效抑制肝癌细胞株BEL-7404、HLE、HuH-7的生长。     

人磷脂磷酸水解酶3基因真核表达载体的构建及其对卵巢癌细胞生长的抑制作用

目的:构建人磷脂磷酸水解酶3(hLPP3)基因的真核表达载体pLenExpress-hLPP3并转染卵巢癌细胞系SKOV3细胞,初步观察重组表达载体对卵巢癌细胞的转染效率、目的基因表达情况及对卵巢癌细胞生长的影响.方法:采用RT-PCR法从正常胎盘组织中提取hLPP3基因,先克隆人克隆载体pGEM-T easy质粒得到pGEM-T-hLPP3,再用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切,切下的hLPP3基因亚克隆入真核表达载体pLenExpress,得到pLenEx-press-hLPP3重组质粒,采用脂质体转染法转染卵巢癌细胞系SKOV3细胞.实验分为3组:A组为实验组(转染表达hLPP3基因重组质粒)、B组为空质粒对照(转染空表达质粒)、C组为无转染对照.荧光显微镜观察细胞转染效率,实时荧光定量PCR法检测hLPP3 mRNA的表达,化学法测定转染前后细胞上清液中溶血磷脂酸(LPA)含量的变化,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况.结果:重组表达质粒经限制性酶切鉴定得到与hLPE,基因长度一致(936 bp)的酶切产物,测序分析证实,目的基因序列与GenBank上登录的hLPP3基因(BC009196)序列完全一致.荧光显微镜下见A、B 2组SKOV3细胞内有大量绿色荧光信号,转染率分别为67%和69%,C组细胞中无荧光信号.实时荧光定量PCR测定显示A组细胞中hLPP3 mRNA的相对表达量较B、C组明显增加(A、B、C组分别为0.510 9±0.058 4、0.149 9±0.025 5、0.143 3±0.0181,P<0.05).A组卵巢癌细胞上清液中的LPA含量较B、C组明显下降[A、B、C组分别为(2.37±0.76)μmol/L、(6.71±2.03)μmol/L、(6.84±1.49)μmol/L,P<0.05];流式细胞仪检测显示A组卵巢癌细胞凋亡率明显增加[A、B、c组分别为(30.50±2.12)%、(1.26±0.43)%、(0.10±0.03)%,P<0.05],细胞周期无明显变化.结论:成功构建了表达目的基因hLPP3的重组真核表达载体pLenEx-press-hLPP3,并能高效转染卵巢癌细胞系SKOV3细胞,使细胞中hLPP3基因表达水平明显升高.增强hLPP3基因表达可以降低细胞外LPA水平,诱导细胞凋亡,抑制卵巢癌细胞的生长.     

人B7-1基因的cDNA克隆及其重组腺病毒载体制备

目的：构建并制备含人B7-1基因的重组腺病毒（Ad-B7-1)载体,为后续的肿瘤基因治疗研究提供实验基础。方法：应用逆转录-套式PCR方法从人骨髓细胞中克隆B7-1的cDNA后,将其克隆至小片段腺病毒载体pCI′中,后与pHBG10在293细胞内重组包装产生腺病毒,感染SGC7901细胞。结果：成功克隆了人B7-1的cDNA并构建Ad-B7-1载体,且经过酶切鉴定和测序验证,感染Ad-B7-1的细胞经PCR鉴定,表明B7-1基因已整合入细胞基因组。结论：本实验构建的腺病毒载体可有效地转B7-1基因进入肿瘤细胞,该结果为下一步应用于体内肿瘤基因治疗研究提供了实验基础。     

腺病毒介导多基因在胆管癌细胞中的表达

研究腺病毒介导的多基因（ＧＭ－ＣＳＦ,Ｂ７－１,ｐ５３、ＩＬ－２）在胆管癌细胞系ＱＢＣ９３９中的表达及对其生长的影响。方法：构建同时含ＧＭ－ＣＳＦ、Ｂ７－１、ｐ５３、ＩＬ－２ ４种目的基因的重组腺病毒载体Ａｄ－ｍｕｌｔｉｇｅｎｅｓ,应用流式细胞仪、ＥＬＩＳＡ、免疫组化等方法。     

hTERT启动子调控的p53基因膀胱癌细胞靶向性表达载体构建及意义

目的:构建人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)启动子调控的含有治疗基因的质粒,探讨在膀胱癌细胞株中特异性靶向转录表达及其潜在的临床意义。方法:将hTERT起始转录区上游的启动子序列克隆到含有绿色荧光蛋白(GFP)基因及含野生型p53基因的质粒上,分别构建成质粒phTERT-GFP及phTERT-p53。脂质体转染法瞬时转染膀胱癌细胞株T24,应用荧光显微镜、噻唑蓝(MTT)法等方法观察在转染细胞中的差异性表达及膀胱癌细胞生长的靶向性抑制作用。结果:在端粒酶阳性的膀胱细胞中观察到hTERT启动子调控的绿色荧光蛋白的靶向性稳定表达,转染hTERT启动子调控的野生型p53基因靶向性抑制膀胱癌细胞生长,但对端粒酶阴性的正常细胞无明显影响(P<0.05)。结论:成功构建的hTERT启动子调控表达的野生型p53基因和GFP基因可在膀胱癌细胞T24中靶向性表达,hTERT启动子调控表达p53基因可靶向性抑制膀胱癌细胞生长。     

野生型p53基因抑制人结肠癌细胞的体内抑瘤效应观察

目的研究人野生型p53基因对人结肠癌SW1116细胞生长的影响。方法采用电穿孔法将正向携带有野生型p53基因cDNA的重组反转录病毒质粒导入有p53基因突变的人结肠腺癌SW1116细胞,筛选带外源p53基因的G418抗药性SW1116细胞克隆,对其进行生长速度、软琼脂集落形成及裸鼠成瘤等方面的检测,分析其生物学特性变化。结果导入人野生型p53基因使人结肠腺癌SW1116细胞的生长速度明显减慢(P<0.05或0.01)、软琼脂集落数量明显较对照组减少(P<0.05或0.01),移植瘤体积较对照组明显小(P<0.05)。结论人野生型p53基因对人结肠腺癌SW1116细胞有明确的抑瘤效应。     

重组腺病毒载体转染p16基因对肝癌细胞的生长抑制作用

目的：通过腺病毒转染p16基因观察对肝癌SMMC-7721细胞的杀伤作用。方法：克隆人p16基因全长cDNA序列，构建携带p16基因的增殖缺陷型重组腺病毒p16(AdV-p16)，以AdV-p16感染人肝癌SMMC-7721细胞，观察p16基因的表达及其对细胞的生长抑制或杀伤作用。结果：AdV．p16能介导外源基因p16在肝癌SMMC-7721细胞系中高效表达。在感染AdV-p16后随重复感染度(MOI)升高p16基因阳性表达率升高，四甲基偶氮唑蓝染色法(MTT)实验结果表明，SMMC-7721细胞的生长受抑制。结论：腺病毒能够介导p16基因在肝癌细胞中高效表达，促进细胞周期阻滞和诱导肿瘤细胞凋亡。     

野生型p53基因转染对人胃癌细胞系HGC27生长的抑制作用

目的 研究野生型p53基因对人未分化胃癌细胞系HGC27生长的抑制作用。方法 用表达人野生型p53基因全长cDNA的真核载体pcDNA3—p53，转染人未分化胃癌细胞系HGC27，对转染后细胞进行生长曲线、细胞生长抑制率及流式细胞术分析，观察其生物学特性变化。结果 外源野生型p53基因在HGC27细胞内稳定表达，经pcDNA3—p53转染的HGC27细胞生长速度受到明显抑制，流式细胞分析显示G1期增加，S期下降，细胞出现凋亡。结论 野生型p53基因能在HGC27细胞内表达，且能抑制其生长并促进细胞凋亡。     

腺病毒介导转录因子X盒结合蛋白1转染对神经干细胞增殖及在缺氧环境下凋亡的影响

目的:以重组腺病毒为载体,将X盒结合蛋白1基因转染胚鼠海马神经干细胞,观察其是否可以促进干细胞增殖以及在缺氧环境下的抗凋亡能力。方法:取孕16dSD大鼠胚鼠的海马组织进行神经干细胞的分离、克隆、nestin免疫荧光检测,以及传代和扩增;将重组腺病毒Ad-XBP1-EGFP质粒转染胚鼠海马神经干细胞,得到基因修饰后的胚鼠海马神经干细胞,选取普通神经干细胞标记为对照组,转染后的神经干细胞标记为转染组。通过细胞计数和MTT比色法检测对照组和转染组的增殖情况,连续检测7d,绘制生长曲线;取两组神经干细胞用CoCl2诱导缺氧,流式细胞术检测对照组和转染组的凋亡情况。结果:转染组的胚鼠海马神经干细胞增殖能力明显增强(P<0.05);在缺氧条件下,转染组神经干细胞凋亡程度较缺氧对照组减轻(P<0.05)。结论:利用重组腺病毒作为载体成功可以将X盒结合蛋白1基因导入胚鼠海马神经干细胞中;转染后的神经干细胞增殖能力和在缺血、缺氧条件下抗凋亡能力较普通神经干细胞明显增加。     

Foxo3a基因调控大鼠卵巢颗粒细胞体外发育及预防顺铂对卵巢的毒性作用

目的研究Foxo3a基因对大鼠卵巢颗粒细胞体外发育的调控及其预防顺铂卵巢毒性作用。方法大鼠原代颗粒细胞体外 培养,利用HE染色法及免疫荧光法进行原代颗粒细胞鉴定;构建携带Foxo3a基因的重组腺病毒AD-rFoxo3a,利用RT-PCR及 Western-blot法检测Foxo3a表达;实验分为3组：实验组（AD-rFoxo3a组）、阴性对照组（rAD组）及空白对照组（Control组）,分别 绘制各组细胞生长曲线,Western-blot法检测各组cyclin D1、p27、Bax、Bim蛋白表达,利用流式细胞术、Hoechst33342/PI法分别 检测细胞周期及细胞凋亡情况,流式细胞术检测各组细胞加入最适浓度顺铂后细胞凋亡情况。结果（1）体外分离培养大鼠原 代卵巢颗粒细胞存活率>90%,细胞纯度>95%;（2）重组腺病毒AD-rFoxo3a感染颗粒细胞36 h后Foxo3a基因在mRNA水平高 表达,感染48 h后在蛋白水平高表达;（3）实验组细胞增殖受到抑制,G1期细胞比例及细胞凋亡率较空白对照组及实验对照组增 加（P<0.01）,后两组差异无统计学意义;（3）实验组Bim、p27、cyclin D1蛋白较对照组高表达,而各组Bax蛋白表达无明显差异; （4）加入顺铂24 h后实验组细胞凋亡率高于空白对照组及实验对照组（P<0.01）,后两组细胞凋亡率差异无统计学意义。结论 过表达Foxo3a基因在体外可能通过促进cyclin D1和p27蛋白表达诱导大鼠卵巢颗粒细胞静止在G1期,通过增加Bim蛋白表达 诱导颗粒细胞凋亡;同时过表达Foxo3a基因在体外不能逆转顺铂导致的颗粒细胞凋亡,其对于卵泡发育的调控及预防顺铂对 卵巢的毒性作用还有待体内实验进一步研究。