转基因骨髓基质细胞对人脐血CD34+细胞体外扩增作用的研究

为探讨转染FL基因的人原代骨髓基质细胞对脐血CD34+ 细胞的体外扩增效应 ,建立了转基因骨髓基质细胞与人脐血CD34+ 细胞共培养体系。采用免疫磁珠法分离人脐血CD34+ 细胞 ,在不同的体外培养体系中进行培养并取样检测细胞总数 ,CFC和CD34+ 细胞百分率。结果表明 ,在不同组合的培养体系中 ,转基因骨髓基质细胞培养体系较骨髓基质细胞培养体系和无滋养层培养体系对有核细胞总数 ,CFC含量和CD34+ 细胞含量均具有明显的扩增作用 ,分别扩增了 12 2 .5± 4 .3,39.6± 2 .7和 11.8± 0 5 2倍 (P <0 .0 5 )。结论 :转染FL基因的人骨髓基质细胞协同其它细胞因子可增强对人脐血CD34+ 细胞的体外扩增作用。     

人脐血巨核系祖细胞体外扩增的实验研究

本研究旨在探讨各种细胞因子对人脐血CD34 细胞体外扩增生成巨核细胞的作用,以建立人脐血巨核系祖细胞体外扩增的最佳体系。采用Ficoll分离液分离脐血单个核细胞,免疫磁珠法分离纯化CD34 细胞,进行体外半固体集落培养和液体培养,观察各种细胞因子组合对CD41 细胞和巨核细胞集落形成单位(CFU-MK)的影响。结果显示:TPO IL-6 IL3 FLT-3L4因子组合体外培养14天效果最好,在第7、14天CD41 细胞分别扩增了154.67±32.21倍、193.23±25.24倍。结论:本实验建立的巨核系祖细胞体外扩增体系,为促进脐血移植后血小板恢复奠定了实验基础。     

动员人外周血巨核祖细胞体外扩增的研究

本研究探讨多种细胞因子(TPO、SCF、FL、IL-1、IL-3、IL-6)组合的几种培养体系对人外周血CD34+细胞体外诱导扩增生成巨核细胞的作用,研究人外周血来源的巨核细胞体外扩增的最佳细胞因子组合及培养时间。用Ficoll-Hapaque分离法分离动员的外周血(MPB)单个核细胞,免疫磁珠法分离纯化CD34+细胞,并将其在含胎牛血清的液体培养体系中、各组细胞因子诱导下培养15天。在不同时间点采用血细胞计数板进行细胞计数,采用流式细胞术检测培养体系中CD41+细胞的含量;同时采用甲基纤维素半固体培养法进行巨核细胞集落培养,测定巨核细胞集落形成单位(CFU-MK)的数量。结果表明经过15天的培养,在MPB来源的CD34+细胞体外诱导并扩增巨核祖细胞体系中,以TPO/FL/IL-6/IL-3组合的扩增效果最好,明显高于其它3组,CD41+细胞第5天、10天分别扩增了93.97±17.27倍、131.23±18.26倍。第15天CD41+细胞含量及CD41+细胞数迅速下降。CFU-MK产率(/1×103个细胞)第5天、10天分别为83.33±10.02个、120.67±13.01个,明显高于其余3组。结论以TPO/FL/IL-6/IL-3因子组合为体外诱导扩增巨核祖细胞的最佳组合,动员外周血的巨核祖细胞体外诱导扩增以培养第10天为宜。本实验建立了动员人外周血来源的巨核祖细胞体外扩增体系。     

人胎盘贴壁细胞的分离培养及造血相关因子表达

目的：探讨人胎盘贴壁细胞(hPDAC)的分离培养及造血相关因子的表达。方法：酶消化法分离培养人胎盘组织中贴壁细胞，并鉴定其生物学特性，用RT-PCR方法检测造血相关因子表达。结果：成功分离培养出hPDAC，并证实其具有间充质干细胞特性，表达多种造血相关因子，包括SCF、FL、G-CSF、GM．CSF、M-CSF和IL-6。结论：hPDAC可为脐血CD34^ 细胞体外扩增提供潜在滋养层。     

人参总皂甙协同造血生长因子体外诱导CD34+造血干/祖细胞扩增与分化的作用

为探讨人参总皂甙(total saponins of panax ginseng,TSPG)协同造血生长因子体外诱导CD34+造血干/祖细胞(HSC/HPC)扩增与分化的作用,收集人脐血、骨髓细胞并采用StemsepTM干细胞分选系统分离纯化CD34+HSC/HPC,用不同剂量TSPG加入不同组合的造血生长因子进行培养,检测细胞总数、CD34+细胞和CD33+细胞比例及集落形成细胞总数(CFC)、粒系祖细胞(CFU-GM)数量变化.结果显示10-70μg/ml TSPG均可不同程度地提高脐血细胞总数、CFC数和CD34+细胞数,50μg/ml是最佳刺激浓度,可使细胞总数、CFC数和CD34+细胞数分别增至(2470.5±79.96)×103、(53.96±4.29)×100%和(21.86±3.09)×100%;20μg/ml是液体培养诱导骨髓CD34+细胞向粒系分化的最佳浓度,可使细胞总数、CFU-GM和CD33+细胞分别增至(133.2±9.03)×103、(26.78±1.91)×100%和(16.98±1.73)×100%;甲基纤维素半固体培养检测显示,TSPG(10-50μg/ml)均能提高CD34+细胞形成CFU-GM的集落产率,以TSPG 20μg/ml效果最为明显.结论合适剂量的TSPG能够促进CD34+造血干/祖细胞体外扩增与定向诱导分化.     

人骨髓基质细胞促进脐血CD34+细胞的体外扩增和对NOD/SCID小鼠的植入

目的 研究人骨髓基质细胞(MSC)促进脐血CD34+细胞体外扩增及植入能力的作用.方法 分离、培养正常人的MSC作为滋养层细胞.在TPO、SCF、FL和G-CSF刺激下,比较有、无MSC滋养层细胞对扩增脐血CD34+细胞后,CD34+细胞和CFU数的增加倍数,以及植入非肥胖性糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠的能力.结果 以骨髓MSC为滋养层细胞的培养体系可以更加有效地扩增脐血CD34+细胞.体外扩增1周总细胞数(TNC)、CD34+细胞和CFU的均数分别增加111.6、19.3和58.0倍;体外扩增2周后TNC、CD34+细胞和CFU的均数分别增加532.8、41.3和563.5倍.脐血细胞输入NOD/SCID小鼠6周后,移植未扩增脐血细胞的对照组小鼠骨髓细胞中人CD45+细胞比例仅为1.2%～3.7%;移植单纯细胞因子刺激扩增组小鼠骨髓中,人CD45+细胞比例为7.6%～12.1%;以MSC为滋养层扩增的脐血细胞移植组,人CD45+细胞比例达到45.3%～59.1%.结论 以人骨髓MSC为作为饲养层细胞,不但可以更加有效扩增脐血CD34+细胞,而且可以促进脐血细胞植入NOD/SCID小鼠的能力,有潜在的临床应用价值.     

脐血间充质干细胞的生物学特征及其对造血干/祖细胞体外扩增的支持作用

目的探讨脐血间充质干细胞(MSC)的生物学特征及其对造血干/祖细胞体外扩增的支持作用。方法用液体培养法分离脐血贴壁细胞,采用ELISA方法检测贴壁细胞条件培养液中细胞因子的表达;用流式细胞术分析其免疫表型特征;在成软骨细胞诱导培养条件下诱导细胞分化,并用RTPCR方法检测分化后细胞原胶原Ⅱ型基因的表达。采用分阶段共培养方法观察脐血贴壁细胞对CD34+细胞体外扩增的支持作用。结果脐血单个核细胞纤维样细胞集落形成率为(3.5±0.7)/106。脐血MSC体外至少可以扩增15代。没有分化的脐血MSC表型为CD13、CD29、CD90、CD105、CD166、SH2、SH3和SH4阳性,CD45、CD34和CD14阴性;脐血MSC培养上清中干细胞因子、IL6和肿瘤坏死因子α检测阳性。在成软骨细胞诱导培养基培养条件下,脐血MSC原胶原Ⅱ型基因mRNA表达阳性。脐血MSC与CD34+细胞共掊养14d,CD34+细胞扩增率高于未共培养组4倍。结论脐血MSC具有类似于成体骨髓MSC的特征,对造血干细胞增殖有明显的支持作用。     

Tpo、IL-11基因修饰的基质细胞对CD34+CD38-早期造血祖细胞扩增的影响

目的　观察经Tpo、IL 11基因修饰的基质细胞对脐血CD3 4 + CD3 8-细胞体外扩增的影响。方法　用载有Tpo、IL 11基因的重组逆转录病毒感染成纤维样基质细胞HFCL ,通过Northernblot法检测基因修饰的HFCL细胞Tpo、IL 11基因的表达。以未经基因修饰的HFCL细胞作为对照 ,将脐血CD3 4 + 造血干 /祖细胞在这种基因修饰的HFCL细胞支持下 ,进行 7d体外扩增后 ,用锥虫蓝拒染法计数活细胞总数 ,并用流式细胞仪分析扩增细胞中CD3 4 + 细胞以及CD3 4 + CD3 8-细胞的比例。结果　在Tpo基因修饰的HFCL细胞、IL 11基因修饰的HFCL细胞和Tpo +IL 11基因共同修饰的HFCL细胞的支持下 ,扩增后CD3 4 + CD3 8-早期造血祖细胞的比例分别为 (1.8± 0 .2 4 ) %、(1.6 2± 0 .2 3) %、(2 .4 5±0 2 8) % ,细胞扩增倍数为 4 .2倍、3.6倍、6 .9倍 ,高于对照组的 (0 .80± 0 .2 3) %和 1.5倍 ,同时扩增细胞总数和CD3 4 + 细胞比例亦高于未经基因修饰的HFCL细胞所支持的扩增体系。结论　Tpo、IL 11基因修饰的基质细胞可有效促进脐血CD3 4 + 造血干 /祖细胞体外扩增 ,同时能有效维持扩增体系中的CD3 4 + CD3 8-细胞以及促进其扩增。     

FL与SCF、IL-3、GM-CSF及EPO协同调控脐血造血干/祖细胞的体外扩增

目的　探讨造血细胞因子的不同组合对脐血造血干 /祖细胞的扩增作用。方法　应用免疫磁珠法分离纯化脐血CD3 4+ 造血干 /祖细胞 ,在体外液体培养体系中经各种不同细胞因子组合扩增 1周 ,用流式细胞仪检测CD3 4+ 造血干 /祖细胞并进行甲基纤维素法半固体培养 2周 ,在倒置显微镜下计数集落产率。结果　在FL、SCF、IL 3、GM CSF、EPO造血细胞因子的不同组合下脐血造血干 /祖细胞得以扩增 ,以IL 3+SCF +FL +EPO组的扩增效率最高 ,其有核细胞数、CD3 4+ 细胞及CFU GM、BFU E集落分别扩增 46 2± 175、3.47± 1.6 4、2 6 4± 10 5和 12 8± 6 7倍。结论　FL对扩增CD+ 3 4细胞具有较强的协同作用 ,合理的细胞因子组合扩增的脐血造血干 /祖细胞可成为异基因造血干细胞移植的主要来源。     

细胞因子介导的人脐血单个核细胞体外扩增并重建NOD/SCID小鼠造血及免疫功能

背景:细胞因子介导的脐血造血细胞体外扩增有望能解决脐血移植数量不足的问题.目的:实验拟确立在无基质培养条件下体外扩增脐血单个核细胞最合适的细胞因子组合及干细胞因子、FLT3配基协同促聚核细胞生成因子对造血及免疫重建功能的影响.方法:将新鲜脐血标本分离的单个核细胞接种于含有不同细胞因子组合的无血清无基质培养体系中培养7 d,根据不同细胞因子组合分组,将3因子干细胞因子+FLT3配基+促聚核细胞生成因子组合在无血清无基质条件下扩增培养7 d前后的脐血单个核细胞移植给经亚致死量照射的NOD/SCID小鼠.在扩增培养0,7 d检测脐血CD34+细胞数及CD34+CXCR4+,CD34+CD62L+,CD34+CD49d+的细胞数.脐血移植6周后通过流式细胞仪,PCR法检测存活小鼠体内的人源性细胞.结果与结论:移植6周后,存活小鼠体内均可检测到人源性CD45+细胞,扩增脐血移植组的NOD/SCID小鼠存活率和人特异性基因捡出率均高于新鲜脐血移植组和高于生理盐水移植组(P<0.05).扩增脐血组存活NOD/SCID小鼠骨髓中可检测到人髓系细胞(CD33+),T淋巴细胞(CD4+),B淋巴细胞(CD19+)和人造血干细胞成分(CD34+)细胞的表达.结果提示干细胞因子+FLT3配基+促聚核细胞生成因子3因子组合脐血造血细胞体外扩增是最合适的细胞因子组合,其扩增的脐血单个核细胞能够植入并重建NOD/SCID小鼠的造血及免疫功能.     

人胎盘组织源造血干/祖细胞的初步研究

为了探讨足月胎盘组织源单个核细胞(human mature placenta tissue-derived mononuclear cells,hPTMNC)中CD34+细胞的体外增殖、分化能力,寻找新的造血干/祖细胞来源供临床应用,分别采用流式细胞术检测、造血干/祖细胞集落培养和体外无细胞因子长期培养的方法,测定胎盘组织源和脐血中的CD34+细胞及其亚群和集落形成单位的数量。结果表明:胎盘组织源CD34+细胞(2.74±0.61%)及其亚群CD34+/CD38-细胞(2.46±0.42%)、造血干/祖细胞集落CFU-GM(186.90±24.52)和BFU-E(101.40±13.35)水平都较脐血CD34+细胞(1.73±0·32%)、CD34+/CD38-细胞(0.80±0.25%)、CFU-GM(136.90±25.15)、BFU-E(49.20±8.13)高;前者在体外无细胞因子培养条件下存活时间长,且细胞数量增加约2倍。结论:胎盘是胎儿期的造血器官,胎盘细胞成分更幼稚,是一种造血干/祖细胞移植的新的种子细胞。     

人骨髓间充质干细胞与脐血CD34+细胞体外扩增

为了研究骨髓间充质干细胞(MSC)及细胞因子对脐血CD34 造血祖细胞体外扩增的作用,及其扩增作用 对细胞黏附分子的影响,用免疫磁珠富集脐血CD34 细胞,然后接种到含有或不含有MSC和细胞因子的24孔培 养板,体外培养1周,观察不同指标并进行组间比较。结果表明:①SDF-1α SCF TPO FL因子组合与SCF TPO FL因子组合对脐血CD34 细胞的扩增作用无显著性差异(无论有无MSC细胞层存在)(P>0.05);②MSC 与上述细胞因子共存的培养体系优于相应的单纯细胞因子培养体系(P<0.05);③扩增前与扩增后脐血造血祖 细胞黏附分子CD44的表达没有明显变化。结论:趋化因子SDF-1α对SCF TPO FL因子组合的扩增作用无显 著影响;MSC增加细胞因子的脐血细胞体外扩增的作用;体外扩增不影响跻血细胞黏附分子CD44的表达。     

不同细胞因子组合对人脐血单个核细胞体外扩增及CD49d和CXCR4表达的影响

为了探讨不同的细胞因子组合对脐血单个核细胞体外的扩增作用及扩增后CD49d和CXCR4的变化，将新鲜脐血标本分离的单个核细胞接种于含有不同细胞因子组合的无血清无基质培养体系中培养7天，在0天，7天检测有核细胞数，CD34^＋细胞数及CD34^＋CXCR4^＋，CD34^＋CD49d^＋的细胞数和集落形成单位（CFU）数．根据不同细胞因子组合实验分组为：对照组；SF组（SCF＋FL）；SFT组（SCF＋FL＋TPO）和SFT6组（SCF＋FL＋TP0＋IL-6）。结果表明，和对照组相比，SF组合仅能低水平支持脐血造血细胞扩增，加入TPO后即SCF／FL／TPO组合能有效的扩增脐血细胞，但SFT和SFT6两组之间差异却无明显发生（P〉0．05）；SF，SFT和SFT63组的细胞因子组合均可提高脐血CD34^＋细胞CD49d，CXCR4的表达，但3组之间差异无显著性（P〉0．05）。结论：SF组合可协同扩增人造血细胞，但协同作用较弱；TPO在脐血造血干／祖细胞体外扩增中起重要调节作用，而IL-6作用不显著；SCF／FL／TPO 3种因子组合不仅可促进脐血造血祖细胞的扩增，而且可上调脐血造血细胞CD49d，CXCR4表达。     

Expansion of mobilized peripheral blood progenitor cells under defined culture conditions rsing CD34+CD71-CD45- cells as a starting population

A major goal of experimental and clinical hematology is the identification of mechanisms and conditions supporting the expansion of transplantable hematopoietic stem cells. We assessed the expansion potential of CD34+CD71-CD45- cells derived from granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF)-mobilized peripheral blood under recently defined serum-free culture conditions. The CD34+CD71-CD45- cells in mobilized peripheral blood were found to contain the majority (92%+/-5.6) of primitive long-term culture initiating cells (LTCIC) and 53.5%+/-16.7 of the more committed colony-forming cells (CFC). Furthermore, this population represents 23.3%+/-4.1 of the total CD34+ cells and allows reduction of the cell density important for maintenance/expansion of primitive progenitor cells. CD34+ CD71- CD45- cells were cultured in defined serum-free media supplemented with 300 ng each of Flt-3 ligand and stem cell factor (SCF), 60 ng of interleukin (IL)-3, and 20 ng each of IL-6 and G-CSF. Mononuclear cells (MNC) and CFC were expanded 50-fold and 200-fold, respectively; primitive progenitor cells (LTC-IC) were maintained at input values after a total of 10 days of expansion. The addition of IL-15 to our cytokine cocktail expanded LTC-IC 2- to 3-fold and CFC to >500-fold. The data presented should allow clinical manipulation (purging) and expansion procedures with mobilized PBPC harvests without the loss of primitive progenitor cells and could be made applicable for large-scale clinical expansion.     

人胚胎AGM区基质细胞在体外培养中对脐血CD34+细胞的支持作用

目的探讨人主动脉-性腺-中肾(AGM)区基质细胞对脐血CD34+细胞的造血支持作用.方法采用免疫磁珠法分离人脐血CD34+细胞,接种于底层已制备好的人AGM区基质细胞S1～S5饲养层的24孔板中,同时设无饲养层组及取自同期胚胎的躯干成纤维(hFT)细胞为对照,体外培养28 d,每7 d收获细胞并检测总数,流式细胞术检测CD34+、CD34+CD38细胞含量,并行造血细胞集落培养.结果在未加外源性造血生长因子的条件下,5株人AGM区基质细胞hAGMS1～S5对造血细胞总数、CD34+及CD34+CD38细胞、造血细胞集落均有不同程度的扩增及维持作用,与无饲养层组、hFT细胞组比较差异有统计学意义(P＜0.05).细胞总数在21 d达到峰值[扩增(25.13±4.83)倍],CD34+、CD34+CD38-细胞在扩增14 d达到峰值[(2.68±0.51)倍、(2.38±0.45)倍],高增殖潜能集落形成单位(HPP-CFU)亦在14 d达到峰值[(2.62±0.85)倍].hAGMS1～S5的造血支持作用组间比较差异亦有统计学意义(P＜0.05),其中hAGMS3、S4优于S1、S2及S5.结论人AGM区基质细胞对脐血CD34+细胞具有维持及扩增作用,特别是hAGMS3、S4两株细胞具有更好的维持作用,为胚胎早期造血发生机制和诱导胚胎干细胞造血分化研究提供了重要的模式细胞和基础资料.     

脐血体外同时诱导扩增T,NK和CD34+细胞

体外研究表明,人脐血含有比骨髓细胞更原始更早期的造血干细胞群。移植后所引起的GVHD发生率及程度都比骨髓及外周血要低,但其相应的GVL效应也较低,容易复发。单份脐血所含有的造血细胞量仅可以满足一定体重以下的儿童患者需求,对需移植的大部分成人患者则要进行体外扩增。脐血体外扩增后进行干细胞移植是一种新的设想和尝试,移植物中免疫细胞的组成和功能是决定干细胞移植能否成功重建造血与免疫、以及平衡GVHD和GVL的重要因素。为了研究脐血体外同时诱导扩增T、NK和CD34 细胞的可能性,本实验无菌采集健康正常足月产新生儿脐血,并分离出单个核细胞,在不同的细胞因子组合作用下用IMDM培养液培养14天。在培养0、3、7、14天时收集细胞,用FCM分析扩增前后脐血干/祖细胞及T、NK免疫细胞含量。结果表明,与无细胞因子的对照组相比,所有细胞因子SCF,IL3,IL6,IL7,IL2组合组别均能显著扩增脐血中的单个核细胞。所有细胞因子组合组别均能显著增加脐血中的CD34 细胞比例,使其含量从新鲜脐血中的1.6%升高到最高D组的11.9%。第7天时CD34 细胞平均增加10至50倍不等。新鲜脐血中CD3 T细胞平均为(18.7±4.3)%,在无细胞因子的对照组中CD3 T细胞下降明显,而在含细胞因子的组别中CD3 T有不同程度的增加,扩增最高的组别中CD3 T细胞是新鲜脐血的2倍。在新鲜脐血中含(3.6±1.9)?56 细胞。CD56 细胞数量仅在含细胞因子IL2的组别中有显著增加,其它组则无明显变化。结论:脐血中T细胞、NK细胞在一定细胞因子组合下,可与干/祖细胞同时在体外被扩增和诱导分化。     

脐血CD133^＋细胞体外扩增巨核系祖细胞的研究

本研究探讨脐血CD133^＋（UCB—CD133^＋）细胞体外扩增巨核系祖细胞的能力和最佳收获时间。采用免疫磁珠激活细胞分选系统（MACS）分选UCB—CD133^＋细胞，将纯化的UCB—CD133^＋细胞接种于含TPO、IL-3和SCF的无血清液体培养体系中体外扩增巨核系祖细胞，在培养第7、10和14天进行细胞计数，流式细胞仪检测扩增过程中CD133、CD34、CD41抗原表达的动态变化，并采用半固体法对不同扩增阶段的细胞进行巨核祖细胞集落形成单位（CFU—MK）培养。结果表明：培养至第7天时，UCB—CD133^＋细胞扩增效果最佳，扩增了8、2-1-2．2倍；培养至第14天，细胞总数扩增了116倍；培养至10天时，平均1个CD133^＋细胞所产生的CD133^＋CD41^＋和CD34^＋CD41^＋细胞数最多，分剐为2．5±0．9和2．6±0.5个，所产生的CD41^＋细胞为20．3±5、9个；扩增前后的UCB—CD133^＋细胞均能形成CFU—MK，扩增第10天的UCB—CD133^＋细胞所形成的CFU—MK总数最多，CFU—MK扩增倍数为59．5±11．8倍。巨核细胞免疫组织化学染色显示，扩增后的巨核系细胞多呈幼稚状态，未见血小板形成。结论：UCB—CD133^＋细胞具有较强的体外扩增巨核系祖细胞的能力，培养第10天扩增效能最佳。