重组结核分枝杆菌ESAT-6的克隆与表达

目的:克隆和表达结核分枝杆菌ESAT-6。方法:以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)扩增esat-6基因片段,克隆至pMD18-T载体,PCR筛选阳性克隆并测序。将esat-6基因亚克隆至pET-28a,构建pET-esat-6重组质粒,转化入大肠杆菌BL21感受态,PCR和双酶切鉴定阳性克隆,经IPTG诱导表达,用His-bindTM亲和层析柱纯化ESAT-6,SDS-PAGE和Western blotting鉴定。结果:PCR扩增出esat-6基因的特异片段,成功构建重组表达质粒pET-esat-6,并在BL21获得表达,纯化的ESAT-6能被结核病人血清所识别。结论:成功克隆和表达获得重组蛋白ESAT-6。     

结核分枝杆菌esat6基因原核表达载体的构建和表达

目的：构建结核分枝杆菌(MTb)esat6基因原核表达载体并进行表达。方法：PCR扩增MTbeast6基因，克隆入pQE30质粒，测序正确后，再亚克隆入pET32a( )质粒，构建PQE30—ESAT6和PET32a( )—ESAT6重组体。结果：重组体分别转化DH5α和BL21(DE3)菌后，经IPTG诱导，pQE30—ESAT6未表达目的蛋白，而PET32α( )—ESAT6表达出19kDA左右重组蛋白。SDS—PAGE分析显示，IPTG诱导4h重组蛋白表达量最高，表达蛋白以可溶性非包涵体形式存在于胞浆中，表达量占全菌蛋白质的42％，用Westermblotting证实其有良好的抗原性；经过Ni—NTA柱纯化，获得纯度为92％的重组蛋白。结论：成功构建原核表达载体pET32a( )—ESAT6，并获得重组ESAT6蛋白，为MTb重组抗原的应用奠定基础。     

结核分枝杆菌抗原蛋白ESAT-6基因重组穿梭质粒的构建与鉴定

目的　构建分泌性表达结核分枝杆菌抗原蛋白 ESAT- 6的重组卡介苗。方法　分别以卡介苗(BCG)和结核分枝杆菌 H37Rv株基因组 DNA为模板 ,通过 PCR扩增得到约 117bp的 BCGα抗原 (α- Ag)信号肽序列和 2 85 bp的结核杆菌 esat- 6基因序列。将 esat- 6基因与大肠杆菌 -卡介苗穿梭质粒载体 p MV2 6 1重组 ,得到重组质粒 p ME。再将 BCGα- Ag信号肽序列克隆至 p ME中 ,得到重组质粒 p SME。结果　质粒 p SME用双酶切和 PCR扩增鉴定证实 ,克隆基因 α- Ag信号肽序列和 esat- 6正确插入载体 p MV2 6 1。结论　重组质粒 p SME可望在 BCG中分泌性表达结核分枝杆菌的免疫保护性抗原蛋白 ESAT- 6 ,该质粒的构建成功为改造卡介苗、发展新型结核病疫苗奠定了基础     

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的表达及纯化研究

目的构建表达结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的表达系统，建立表达及纯化方法，为其应用打下基础。方法根据ESAT-6的基因序列设计引物，从结核菌基因组DNA中扩增基因，酶切后插入表达载体，测序证实后转入大肠杆菌JM109菌株，经IPTG诱导表达，产物经谷胱甘肽-琼脂糖凝胶法纯化。结果ESAT基因产物大小、酶切片断大小和载体的大小与设计一致、ESAT-6基因测序的结果与目的基因完全符合。表达纯化的蛋白的大小与蛋白质分子量标准比较一致。结论构建结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的表达载体成功，纯化出目的蛋白。     

结核分枝杆菌RpfA蛋白的原核表达、鉴定和纯化

目的:构建结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)复活促进因子A(Resuscitation-promoting factor,ARpfA)的原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达和纯化.方法:采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出RpfA基因(1 224bp),然后用双内切酶消化后,与同样酶消化的pET32aα( )载体连接,转入大肠杆菌Top10;阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定.测序正确后,将重组质粒转化到的大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导,由盯启动子调控表达了RpfA蛋白;利用His-tag in-gel Stain对表达蛋白进行鉴定,最后对目的蛋白进行纯化.结果:双酶切鉴定所切下的片段大小与理论值相符,测序结果与文献报道一致.经SDS-PAGE分析和His-tag in-gel Stain鉴定均发现66ku处有特异性蛋白条带.结论:成功克隆并构建了RpfA基因的重组表达质粒pET32 α( )-RpfA,并获得了高纯度的重组蛋白,为以后的深入研究奠定了基础.     

结核分枝杆菌ESAT-6基因在毕赤酵母中的构建及其表达

目的在毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统中表达结核分枝杆菌ESAT-6基因。方法以重组质粒pET23a-ESAT-6为模板,亚克隆目的片段ESAT-6至酵母菌分泌表达载体pPICZaA,重组质粒经线性化后电转化转染至毕赤酵母菌GS115菌株,经抗生素Zeocin筛选得到高拷贝转化子。经甲醇诱导表达,取细胞裂解上清进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法分析。结果成功构建了pPICZaA-ESAT-6毕赤酵母表达重组质粒。经甲醇诱导,在酵母细胞内表达分子质量单位为18kDa的蛋白。蛋白质印迹（Western blot）显示,18kDa蛋白被活动性肺结核病人血清抗体识别。结论在毕赤酵母菌中成功表达了带有信号肽ESAT-6基因,为进一步研究新型单位疫苗打下坚实的基础。     

结核分枝杆菌耐药性相关膜蛋白MmpL6的表达与纯化

目的 构建结核分枝杆菌外排泵蛋白MmpL6(Rv1557)表达载体,在大肠杆菌E. coli中诱导MmpL6蛋白高表达并进行纯化.方法 以结核分枝杆菌H37Rv菌株基因组DNA为模板,采用聚合酶链反应扩增目的基因片段,构建pET21b-MmpL6表达载体将表达载体转化至大肠杆菌中,加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,并针对不同表达菌株、温度进行优化,获取最优表达条件.采用Ni-NTA亲和层析以及凝胶过滤色谱纯化目标蛋白.结果 成功构建pET21b-MmpL6重组表达质粒,经 IPTG诱导后,在Rosetta菌株中25 ℃条件下获得最高表达量.结论 成功表达并纯化了 MmpL6蛋白,为该蛋白后续的结构与功能研究奠定了基础.     

结核分枝杆菌ESAT-6诊断抗原基因的克隆及同源性分析

目的 获得结核分枝杆菌ESAT-6抗原基因,进行DNA测序、同源性分析,为筛选结核病候选诊断抗原基因奠定基础.方法 以结核菌标准菌株H37Rv为模板,通过PCR技术扩增出结核分枝杆菌ESAT-6抗原基因,将其重组到pGEM-T载体后进行序列测定和生物信息学分析.结果 成功扩增出结核分枝杆菌ESAT-6抗原基因,测序表明该片段开放阅读框由288bp组成,与已发表基因核苷酸序列相比,同源性为99%,推导编码氨基酸序列同源性为90%.结论 成功克隆结核分枝杆菌ESAT-6基因,测序结果表明该片段阅读框完整.     

结核分枝杆菌GroEL2蛋白表达、纯化及生物信息学分析

目的 克隆、表达和纯化结核分枝杆菌H37Ra株GroEL2蛋白，并进行生物信息学分析。方法 以结核分枝杆菌H37Ra株基因组DNA为模板，PCR扩增GroEL2基因，克隆至pET-28a载体中，构建重组pET-28a-GroEL2载体，将其转化至BL21(DE3)菌株中，在异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG)诱导表达后，利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)电泳分析表达产物，镍-亚氨基二乙酸(Ni-IDA)亲和层析柱纯化重组GroEL2蛋白，Western blot鉴定GroEL2的表达效果。利用生物信息学方法对GroEL2蛋白的理化性质、蛋白结构、抗原表位等进行预测。结果 成功构建重组pET-28a-GroEL2表达载体，在大肠杆菌中以可溶形式表达GroEL2蛋白。Ni-IDA亲和层析柱纯化重组GroEL2蛋白，纯度达90%以上。生物信息学分析显示其能与多种蛋白相互作用，且存在多个潜在的T细胞、B细胞...     

结核分枝杆菌lhp-esat6融合基因原核表达载体的构建和表达

目的 :构建结核分枝杆菌 (MTb) 1hp -esat6融合基因及其原核表达载体并进行表达。方法 :用GeneSOEing法 ,将1hp基因和esat6基因体外重组 ,构建融合基因 ,克隆入pQE30质粒中进行表达。 结果 :构建的融合基因经测序证实完全正确 ,重组体转化表达菌DH5α后 ,经过IPTG诱导 ,表达出 2 6kDa左右的CFP10 -ESAT6融合蛋白。SDS -PAGE分析显示 ,IPTG诱导 4h表达量最高 ,表达蛋白以可溶性非包涵体形式存在于胞浆中 ,表达量占全菌蛋白质的 4 0 % ,Westernblotting证实其有良好的抗原性。表达蛋白经过Ni-NTA柱纯化后 ,获得了纯度为 98%的重组蛋白。结论 :成功构建MTblhp -esat6融合基因 ,成功构建原核表达载体pQE30 -CFP10 -ESAT6 ,并获得重组CFP10 -ESAT6融合蛋白 ,为MTb重组抗原的应用奠定了基础。     

结核杆菌ＥＳＡＴ-６抗原多表位ＤＮＡ疫苗的构建与表达

目的:构建含3个结核杆菌ESAT-6抗原T细胞表位及Fh3配体基因的重组质粒,并使其在大鼠肾小球系膜细胞(GMCs)中表达.方法:用计算机软件预测结核杆菌ESAT-6抗原的T细胞表位谱,选取3个T细胞表位,并以Ala-Ala-Tvr(AAY)序列作为接头,合成全基因序列,定向克隆入真核双表达载体pIRES及质粒plRES-FL.在酶切分析与序列测定后.用PEI转染至GMCs细胞,并行Western blot鉴定其体外表达.结果:核酸序列测定证实重组质粒构建正确,Western blot证实该重组质粒能在体外GMCs细胞中表达融合蛋白.结论:成功构建了结核杆菌ESAT-6抗原多表位基因重组质粒.     

结核杆菌ESAT-6抗原及Flt3配体双表达核酸疫苗的构建与体外表达

目的:构建可同时表达flt3配体(flt3-ligand,FL)和结核杆菌6kD早期分泌蛋白(ESAT-6)的重组pIRES质粒,并在大鼠肾小球系膜细胞(GMC)中表达,为进一步研究结核杆菌DNA疫苗提供实验基础.方法:采用PCR方法将FL和ESAT-6基因分别定向克隆入真核双表达载体pIRES.在酶切分析及序列测定后,用脂质体转染至GMC细胞,Western blot鉴定其体外表达.结果:核酸序列测定证实重组质粒构建正确,该重组质粒在体外GMC细胞中能表达FL和ESAT-6两种蛋白.结论:成功构建了结核杆菌FL和ESAT-6双顺反子真核表达质粒,并在体外实现了共表达.     

结核分枝杆菌MPT63抗原蛋白的表达及纯化

目的克隆结核分枝杆菌MPT63抗原蛋白的编码基因Rv1926c,并在大肠杆菌中表达纯化,获得结核分枝杆菌重组MPT63蛋白。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,PCR扩增Rv1926c基因编码序列,克隆入原核表达载体pET-30a,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌后用IPTG诱导表达,纯化表达产物,获得重组MPT63抗原蛋白。结果测序表明重组质粒pET30aRv1926c具有正确的编码序列,质粒构建成功,重组蛋白MPT63在大肠杆菌中以包涵体形式稳定表达。结论结核分枝杆菌MPT63重组蛋白能在大肠杆菌工程菌种成功表达,为进一步的应用研究奠定基础。     

结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6对小鼠巨噬细胞凋亡的诱导作用

【目的】研究结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）分泌蛋白ESAT-6（early secreted antigenic target of 6 kD）对小鼠巨噬细胞凋亡的影响及机理。【方法】应用流式细胞仪分析稳定表达ESAT-6和经重组ESAT-6蛋白作用的小鼠RAW264.7细胞的凋亡;应用Caspase-3检测试剂盒检测caspase-3活性变化;进一步应用Western blotting分析稳转细胞系ESAT-6表达情况。【结果】RAW-EGFP-ESAT-6细胞系培养48 h后的凋亡率与caspase-3活性显著高于RAW264.7和RAW-EGFP细胞系（P〈0.05）;RAW-flag-ESAT-6细胞系培养48 h后的凋亡率与caspase-3活性显著高于RAW264.7和相应对照细胞系（P〈0.01）。10μg/ml重组ESAT-6可显著诱导RAW264.7细胞凋亡,而5μg/ml重组ESAT-6无明显诱导细胞凋亡效果。稳转细胞系RAW-flag-ESAT-6细胞内flag-ESAT-6浓度大约只有500 ng/ml。【结论】胞内低水平表达结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6可依赖caspase-3信号通路诱导小鼠RAW264.7细胞凋亡。     

Expression and immunogenicity of recombinant Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin strains secreting the antigen ESAT-6 from Mycobacterium tuberculosis in mice

Background Tuberculosis remains the leading cause of human death. Currently, Bacillus Calmette-Guerin （BCG） is the only available vaccine against tuberculosis but its efficacy is highly variable. Thus, developing new tuberculosis vaccines becomes an urgent task. In this study, we evaluated in BALB/c mice the humoral and cellular immune responses of recombinant BCG expressing the antigen ESAT-6 from Mycobacterium tuberculosis. Methods Escherichia coli-BCG shuttle plasmid named pDE22-esat-6 was constructed by inserting the BamHI/EcoRI digested esat-6 gene PCR product into the similarly digested parental plasmid pDE22. BCG cells were transformed with pDE22-esat-6, which was named recombinant BCG （rBCG）. BALB/c mice were immunized subcutaneously on the back with 100 μl normal saline containing 106 CFU of BCG or rBCG. They were sacrificed after 4 weeks to detect their humoral and cellular responses. Results There was no any significant differences in the growth characteristics between the conventional BCG and rBCG. In immunized mice, the IgG antibody titres of rBCG group were as high as 1：8000, which was significantly higher than that in BCG group （1：1400, P〈0.05）. The elicited IFN-γ, level of rBCG group was （1993 ± 106） pg/ml, which was also significantly higher than that in BCG group （（1463 ± 105） pg/ml, P〈0.05）. The splenocyte proliferation index of rBCG group reached 4.34 ± 0.31, which was higher than that of BCG group （3.79 ±0.24, P〈0.05）. Conclusion rBCG secreted expressing antigen ESAT-6 stimulated stronger humoral and cellular immune responses than BCG did, and, therefore may be the better vaccine against mycobacterium tuberculosis.     

结核分支杆菌早期分泌性蛋白ESAT-6基因真核表达重组质粒的构建及鉴定

目的 :构建结核分支杆菌早期分泌性蛋白ESAT - 6真核表达重组质粒。方法 :以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板 ,用PCR法对ESAT - 6基因进行扩增 ,PCR反应产物经酶切后 ,克隆于真核表达载体pcDNA3.1( )上。结果 :构建了结核杆菌基因ESAT - 6真核表达重组质粒pcDNA3.1( ) -ESAT - 6 ,测序报告ESAT - 6基因已正向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1( )上。结论 :结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT - 6真核表达重组质粒的成功构建为结核病的诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测打下了基础。     

结核分枝杆菌热休克蛋白60编码基因的克隆与原核表达

目的 克隆结核分枝杆菌热休克蛋白60(Hsp60)编码基因, 并在大肠杆菌中表达.方法 利用PCR技术从结核杆菌H37Rv株中扩增hsp60基因,并将其与pZero-T载体连接,进行DNA测序.将得到的hsp60基因亚克隆到表达载体pProEXHTb中,构建重组原核表达质粒pProEXHTb-TBhsp60,并在大肠杆菌BL21中诱导表达.结果 成功地克隆了结核分枝杆菌hsp60基因.DNA测序证实,与GenBank公布的序列一致.含pProEXHTb-TBhsp60基因表达质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后,能够高效表达相对分子质量(KD)约为60KD的融合蛋白.结论 获得了结核分枝杆菌hsp60基因,成功地构建了原核表达质粒pProEXHTb-TBhsp60,并在大肠杆菌得到表达,为研究其免疫学特性奠定了基础.