高表达HMGB1肺癌细胞系的筛选及意义

背景与目的 在人肺鳞癌细胞株YTMLC-9、人肺腺癌细胞株A549、人大细胞肺癌细胞株L9981及人小细胞癌细胞株NCI-H446中筛选高表达HMGB1的细胞株,作为人肺癌细胞HMGB1基因研究的理想材料.方法 采用实时荧光定量PCR和Western blot方法对人肺癌细胞HMGB1基因在4株细胞中的mRNA和蛋白水平的表达进行检测,筛选出高表达HMGB1基因的人肺癌细胞株.结果 人肺鳞癌细胞株YTMLC-9、人肺腺癌细胞株A549、人大细胞肺癌细胞株L9981及人小细胞癌细胞株NCI-H446中均有HMGB1基因表达,其中人大细胞肺癌细胞株L9981表达水平最高,mRNA是表达量最低的人肺腺癌细胞株A549mRNA表达量的10.3倍;人大细胞肺癌细胞株L9981 HMGB1蛋白表达水平最高,与其它3种人肺癌细胞株相比有统计学差异(P<0.001).结论 人大细胞肺癌L9981细胞株为HMGB1高表达细胞株,可作为进行肺癌细胞中研究HMGB1的实验材料.     

X线照射后肺癌细胞肿瘤坏死因子mRNA的表达

目的探讨X线诱导和调节肺癌细胞株NCI-H596和A549肿瘤坏死因子(TNF-α)mRNA的表达作用及其临床意义。方法应用实时荧光定量RT-PCR技术,定量检测NCI-H596和A549细胞株照射前和接受不同剂量(2,5,10,20,30和40Gy)的X线照射后,以及受照30Gy后不同时间TNF-αmRNA的表达。同时进行集落形成试验,检测NCI-H596和A549细胞株的放射敏感性。结果集落形成试验结果显示,未照射的NCI-H596细胞株集落形成率为0.12～0.24;A549细胞株集落形成率为0.37～0.45。照射后,A549细胞的存活分数(SF)在2Gy时为47.3%±9.0%,4Gy时为18.0%±3.0%,6Gy时为6.0%±2.0%,8Gy时为1.4%±0.3%;NCI-H596细胞的SF在2Gy时为55.2%±51.0%,4Gy时为15.9%±9.2%,6Gy时为3.5%±1.7%;8Gy时为0.9%±0.6%;二者SF差异无统计学意义,二者的D0值和Dq值差异亦无统计学意义(P>0.05)。实时荧光定量RT-PCR检测显示,NCI2H596细胞受照后TNF-αmRNA表达逐渐升高,照射剂量达40Gy时,TNF-αmRNA表达水平达高峰,为对照组的83倍;受照后,1hTNF-αmRNA表达逐渐升高,6h达高峰,为对照组的568倍。A549细胞受照后,1hTNF-αmRNA表达即达高峰,为对照组的136倍。结论X线可诱导肺癌细胞株A549和NCI2H596产生TNF-α,且呈剂量、时间依赖性,可提高肺癌放射治疗的疗效,也可对正常组织和     

凋亡抑制基因survivin在多种肺癌细胞株中的表达及其意义

目的:探讨凋亡抑制基因survivin在多种肺癌细胞株中的表达及其意义.方法:分别采用Real-time PCR与Western blot的方法,检测人肺腺癌细胞株A549、肺鳞癌细胞株SK-MES-1、大细胞肺癌细胞株NCI-H460、小细胞肺癌细胞株NCI-H446中survivin mRNA与蛋白的表达水平.结果:Real-time PCR检测发现四种肺癌细胞株中survivin mRNA均呈强阳性表达,且Western blot检测结果亦与 RT-PCR基本一致.结论:Survivin基因与肺癌发生、发展紧密相关,值得进一步深入研究.     

Aurora—A激酶在人类肺癌细胞株中的表达

目的：探讨aurora-A基因在正常肺组织与不同肺癌细胞中的表达。方法：采用半定量RT-PCR、Western blot方法，检测Aurora-A在高转移的肺癌细胞PG、肺腺癌细胞A549、大细胞肺癌细胞NCI-H460三种肺癌细胞株的表达情况。结果：RT-PCR结果显示，三种肺癌细胞与正常肺组织比较aurora-A mRNA均高表达，经图象分析，PG、A549、NCI-H460与正常肺组织中aurora-A／β-actin比值分别为1．14、1．16、0．84和0、26。Western blot结果经图象分析发现，A549、NCI-H460与PG的aurora-A／β-actin比值分别为21．13、6．43与8．96。三者比较，A549最高，PG其次，NCI-H460最低。结论：aurora-A在三种肺癌细胞中其mRNA及蛋白水平均呈高表达，不同细胞株其表达水平不同。aurora-A基因在肺癌细胞中高表达的结果提示，作为一种新的癌基因，aurora-A有可能成为肺癌新的肿瘤标记物及分子治疗靶点。     

人肺癌细胞株中hnRNP A2/B1表达的研究

目的 研究人肺癌细胞株中核内不均一核糖核蛋白(hnRNP)A2/B1及hnRNP B1的表达。方法 采用特异性hnRNP A2／B2及hnRNP B1引物,应用RT-PCR方法研究肺癌细胞株hnRNP A2／B1 mRNA的表达,以抗hnRNP B1单克隆抗体免疫细胞化学染色方法研究肺癌细胞hnRNP A2/B1蛋白的亚细胞定位。结果 RT—PCR显示人肺腺癌细胞株SPC-A1及Y-90,小细胞肺癌细胞株NCI-H446及鳞癌细胞株A431均表达hnRNP A2／B1及hnRNP B1,其PCR产物分子量分别在661及1039bp左右,与预期大小的hnRNP A2/B1 cDNA片断相符。免疫细胞化学研究发现,肺腺癌细胞株SPC—A1及Y-90．小细胞肺癌细胞株NCI—H446及鳞癌A431的细胞浆及细胞核内均可见特异的hnRNP B1染色,鳞癌A43l及小细胞肺癌NCI—H446 hnRNP B1染色较肺腺癌细胞株SPC—A1及Y-90明显。结论 肺癌细胞株hnRNP A2／B1及hnRNP B1表达明显增高。     

GST-π、P—gP、LRP在人肺癌细胞株中的表达与多西他赛治疗敏感性的关系

目的：探讨不同肺癌细胞株中谷胱甘肽转移酶（GST-π）、P-糖蛋白（P～gP）、肺耐药蛋白（lung reistanceprotein,LRP）的mRNA表达差异及对多西他赛化疗敏感性的预测价值。方法：采用RT—PCR技术检测ANIP973细胞株、A549细胞株,A2细胞株中GST-π、P—gP、LRP蛋白mRNA的表达,结合多西他赛体外药物敏感实验,分析GST-π、P—gP、LRP的mRNA表达水平与多西他赛化疗敏感的相关性。结果：在肺癌细胞株中,P—gp、LRP、GST-竹在腺癌细胞株中表达高于鳞癌细胞株,从高到低依次为ANIP973、A549、A2细胞株,差异有统计学意义。多西他赛药敏试验显示细胞株生存曲线受药物抑制由大到小为A2、A549、ANIP973细胞株。多西他赛IC50均值从高至低依次为ANIP973、A549、A2细胞株。经单向方差分析不同细胞株之间IC50差异显著（F=29．636,P=0．000）。3种肺癌细胞株中多西他赛Ic50与GST-π（0=0．626,P=0．001）、P-gp（rs=0．453,P=0．027）、LRP（rs=0．398,P=0．045）表达水平呈正相关,且与GST-π关系最密切（ri〉0．5）。结论：检测肺癌细胞中GST-π、P—π、LRP各蛋白mRNA表达水平对多西他赛化疗敏感性具有一定预测价值,联合检测三者可能对临床判断化疗效果以及合理选择化疗药物具有指导作用。     

多西紫杉醇对非小细胞肺癌细胞株生长及对COX-2蛋白表达的影响

目的：在体外研究不同浓度的多西紫杉醇（泰索帝）对非小细胞肺癌（NSCLC）细胞株生长及对胞内环氧化酶-2（COX-2）蛋白表达的影响。方法：采用人NSCLC细胞株A549和NCI-H460作为研究对象,体外药物敏感试验（MTT）检测不同浓度和作用时间的泰索帝对细胞增殖的抑制效应;应用免疫细胞化学的方法观察分别经泰索帝1、2、4nmol／L作用48小时后,细胞内COX-2蛋白的表达情况。结果：泰索帝住体外对NSCLC细胞株A549的生长抑制作用在药物浓度加大到10nmol／L后处于平台期,对NCI-H460存浓度加大到4nmol／L后处于平台期;两株细胞分别经泰索帝1、2、4nmol／L作用48小时后,细胞内COX-2蛋闩的表达同对照组（不加药物组）无统计学差异（P〉0．05）。结论：泰索帝住体外对NSCLC细胞株A549和NCI-H460的生长有明显的抑制作用,但不影响细胞内环氧化酶-2蛋白的表达。     

洋地黄毒苷对肺癌NCI-H446与A549细胞增殖和周期的影响

目的： 探讨洋地黄毒苷对肺癌NCI-H446与A549细胞增殖和细胞周期的影响,并初步探讨其可能的作用机制。方法：体外培养的NCI-H446与A549细胞分别经不同浓度(10、20、40、80、160 nmol/L)的洋地黄毒苷处理24、48和72 h后,采用MTT法检测细胞增殖情况,应用流式细胞术检测洋地黄毒苷处理细胞48 h后各组细胞周期分布,Western blot检测细胞中Cyclin A和P21蛋白表达水平。结果：与未经洋地黄毒苷处理的对照组相比,不同浓度(10、20、40、80和160 nmol/L)的洋地黄毒苷均可抑制 NCI-H446与A549细胞的增殖, 均呈剂量和时间依赖性(P<0.05),作用48 h后,洋地黄毒苷对NCI-H446与A549细胞的IC50值分别为61.26 nmol/L和110.73 nmol/L。流式细胞仪分析结果显示,随药物作用浓度增加,G0/G1细胞比例降低,S期细胞比例显著增加,与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。Western blot分析结果显示,洋地黄毒苷能剂量依赖性的下调Cyclin A1蛋白表达和上调P21 蛋白的表达(P<0.05)。结论：洋地黄毒苷可抑制体外培养的肺癌NCI-H446与A549细胞增殖,诱导细胞发生S期阻滞,其机制可能与细胞周期相关调控蛋白的表达有关。     

肺癌细胞中survivin与P53的相关性

目的：观察survivin特异性小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）对P53野生型和乃3缺失型肺癌细胞株的生长抑制作用，分析肺癌细胞中survivin与乃3的相关性。方法：以化学合成的survivinsiRNA转染丹3野生型肺癌细胞株A549和P53缺失型肺癌细胞株H1299，用MTF法检测转染前后肺癌细胞的增殖情况，流式细胞术分析细胞周期和凋亡的改变，半定量RT—PCR检测转染对survivinmRNA表达的影响，Westernblotting检测survivin、PARP、P21、P53等蛋白表达的变化。结果：siRNA转染前A549细胞中survivin表达量明显低于H1299细胞（P〈0．05）。SurvivinsiRNA转染组两种细胞survivin蛋白及RNA表达水平均显著低于对照组和无关干扰组（P〈0．01）。SurvivinsiRNA对A549和H1299细胞生长抑制作用均呈浓度依赖性（P〈0．05），但对H1299细胞的抑制起效晚于A549，且抑制程度低于A549细胞。转染后A549和H1299细胞均有G1期比例增加和S期比例相应地减少，H1299细胞的变化更为显著。A549细胞有一定比例出现凋亡，PARP发生了裂解，P53、P21蛋白表达增加，而H1299细胞中上述指标的变化却不明显。结论：P53野生型A549细胞内源性survivin表达明显低于P53缺失型H1299细胞；抑制survivin能上调P53蛋白表达，其对A549细胞的生长、凋亡和P21等蛋白表达的影响明显强于H1299细胞；提示survivin与P53之间可能存在着相互抑制作用。     

CD40信号通过TNFRⅠ途径抑制肺癌细胞增殖的研究

背景与目的：CD40活化信号可抑制多种肿瘤细胞体外生长,但其分子机制尚不明确,本研究旨在探讨激发CD40信号对肺癌细胞株NCI—H460、A549的增殖及肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor,TNFR）、膜型TNF-α（mTNF-α）表达的影响及相关机制。方法：免疫荧光标记和流式细胞术检测肺癌细胞表面CD40的表达以及激发CD40对细胞表面TNFR和mTNF-α表达谱的影响：Western blot检测激发CD40对细胞TNFR和mTNF-α蛋白含量表达的影响;采用四氮唑盐（MTT）比色法抗体中和实验分析阻断TNFRI及TNF-α对CD40激发效应的影响：酶联免疫吸附（ELISA）法检测激发CD40对肺癌细胞培养上清中可溶性TNF-α（mTNF-α）含量的影响。结果：（1）肺癌细胞株NCl-H460、A549表面CD40表达分别为（89．0±3．2）％、（62．2±4．5）％。（2）免疫荧光和流式细胞术示,激发NCl—H460和A549细胞表面CD40分子48h后．其表面TNFRⅠ表达率分别为（36．2±4．6）％、（38．5±5．9）％,较对照组分别为（7．2±1．9）％、（15．2±3．1）％明显升高（P〈0．05）;而其表面TNFRⅡ表达率分别为（5．8±1．2）％、（18．0±1．6）％,较对照组分别为（38．8±4．3）％、（58．1±3．6）％明显降低（P〈0．05）;其表面TNF-α表达率分别为（7．0±0．9）％、（8．7±1．1）％,较对照组分别为（15．0±2．1）％、（26．5±3．2）％也明显降低（P〈0．05）。（3）Westernblot示,激发CD40可使NCl—H460和A549细胞TNFRI蛋白表达增强,TNFRII蛋白表达减弱．而mTNF-α蛋白表达无明显变化。（4）CD40激发前后肺癌细胞培养上清中未检测到sTNF-α的存在。（5）激发CD40能明显抑制NCl-H460、A549细胞的增殖（P〈0．05）,而阻断TNFRⅠ后CD40信号的细胞增殖抑制效应消失。（6）阻断TNF-α亦可明显抑制两肺癌细胞株增殖（P〈0．05）,而同时激发CD40未见两者?     

不同肺癌细胞株中VEGFR-2 mRNA表达的实验研究

目的 研究不同非小细胞肺癌（NSCLC）细胞株中血管内皮生长因子受体-2（VEGFR-2） mRNA的表达情况。方法 采用实时荧光定量PCR法检测人肺黏液表皮样癌NCI-H292细胞株、人肺腺癌NCI-H1299细胞株、人肺腺癌A549细胞株、人肺巨细胞癌95D细胞株和人肺鳞癌Calu-1细胞株中VEGFR-2 mRNA的表达。结果 Calu-1、NCI-H292、95D、NCI-H1299和A549细胞株中VEGFR-2 mRNA表达依次为1.213±0.134、1.008±0.164、0.754±0.088、0.582±0.171和0.121±0.026,差异有统计学意义（F=31.875, P=0.000）。Calu-1与NCI-H292细胞株间VEGFR-2 mRNA表达无统计学差异（P=0.080）,NCI-H1299与95D细胞株间VEGFR-2 mRNA表达亦无统计学差异（P=0.137）,其余细胞株间差异均有统计学意义（P均＜0.05）。结论 不同NSCLC细胞株中VEGFR 2 mRNA表达量不同,可能与不同肿瘤细胞的生物学行为有关。     

柴胡皂甙D对肺癌A549细胞放射敏感性的影响及机制

目的：探讨柴胡皂甙D对肺癌A549细胞的放射增敏作用及机制。方法：利用细胞克隆技术进行剂量-存活曲线分析,MTT法检测细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞周期,并对细胞周期进行分析。结果：柴胡皂甙D组D0值为2.7Gy,空白对照组D0值为3.6Gy（P〈0.05）。随着柴胡皂甙D浓度的增加及作用时间的延长肺癌A549细胞抑制率增加（P〈0.05）,且经柴胡皂甙D处理后,与对照组相比,S期细胞比例降低,G2／M期细胞比例增高。结论：柴胡皂甙D可以明显提高肺癌A549细胞的放射敏感性,机制可能与其引起瘤细胞周期阻滞,诱导肿瘤细胞凋亡有关。     

肺癌组织细胞耐药基因 MDR1、LRP表达及临床意义

目的:研究肺癌多药耐药基因MDR1、LRP在肺癌组织细胞及肺癌细胞系中的表达与肺癌病理类型、组织分化程度的相关性.方法:用RT-PCR方法观察肺癌组织以及肺癌细胞系中MDR1、LRP基因的表达情况.结果:在46例肺癌组织中,MDR1、LRP基因的表达率为39.1%和67.4%,其共同表达率(MDR1 LRP)为26.1%;MDR1、LRP基因的表达率在肺癌的不同病理类型及组织分化程度的表达差异无统计学意义(P＞0.05).MDR1在肺癌细胞系A549、GLC-82、NCI-H446、NCI-H460均呈阳性表达,LRP则在A549、GLC-82、NCI-H460呈阳性表达.结论:MDR1、LRP基因在肺癌组织的阳性表达与肺癌的固有性耐药有关,表现出肺癌患者之间的个体差异,而与肺癌的病理类型及组织分化程度无明显相关(P＞0.05);该结果为探讨肺癌多药耐药性的病理机制提供了一个新的线索,而且有可能为基因治疗逆转肺癌的多药耐药性开辟了一条新的途径.     

Slp2反义真核表达载体的构建及功能研究

背景与目的 肺癌相关基因的研究一直是研究的热门课题，S1p2基因是通过cDNA微阵列技术筛选出的肺癌差异表达基因之一，本研究旨在对S1p2基因在肺癌细胞系中的表达及其功能进行初步研究。方法 提取肺癌细胞系A549、GLC-82、NCI-H446、NCI-H460的细胞总RNA，用RT-PCR方法检测肺癌细胞系中S1p2基因mRNA水平的表达；构建S1p2反义基因，通过离子脂质体将克隆的S1p2反义基因导入肺癌细胞系GLC-82、NCI-H446、NCI-H460，用半定量RT-PCR检测转染目的基因对肺癌细胞系S1p2表达的影响；通过四唑盐比色法绘制细胞生长曲线以及流式细胞分析、软琼脂细胞克隆形成试验，观测转染S1p2反义基因对肺癌细胞系GLC-82、NCI-H446、NCI-H460生长速度、细胞周期以及细胞增殖能力的影响。结果 在4个肺癌细胞系中，S1p2基因均为阳性表达；转染S1p2反义基因后的肺癌细胞系GLC-82、NCI-H446、NCI-H460的细胞生长速度明显减慢；在流式细胞分析直方图上表现为G2期的细胞增多，并曾在转染目的基因的NCI-H446细胞流式直方图中观察到了位于G0／G1期左侧的“亚Gt峰”的出现；转染S1p2反义基因后肺癌细胞系的软琼脂培养细胞克隆形成率明显低于未转染细胞。结论 S1p2基因与肺癌细胞的生长、增殖力密切相关，有必要进行深入研究和探讨。     

蛋白激酶CK2抑制剂对肺癌细胞系放射敏感性的影响

目的 探讨蛋白激酶CK2抑制剂对肺癌细胞系放射敏感性的影响。方法 通过蛋白印迹法检测蛋白激酶CK2α、β亚基在不同肺癌细胞系中的表达情况。平板克隆形成试验检测CK2激酶抑制剂醌茜素对肺腺癌细胞A549和大细胞肺癌细胞H460对X线的放射敏感性影响。流式细胞术检测醌茜素与X线联合作用对A549、H460细胞凋亡及周期分布影响。组间比较采用方差分析和成组t检验。结果 蛋白激酶CK2α、β亚基在对放射不敏感的A549、H1650、H460细胞中高表达, 而在放射敏感的小细胞肺癌H446细胞中低表达。使用醌茜素预处理的A549、H460细胞存活分数(SF)明显低于未处理组, 25 μmol/L的增敏比(D₀值比)分别为2.771、2.463。醌茜素可引起细胞凋亡增加, 但X线联合醌茜素与单独醌茜素作用相比未增加A549细胞和H460细胞凋亡(X线照射+醌茜素:单独醌茜素, A549细胞P= 0.487和H460细胞P=0.254), 然而X线联合醌茜素与单独X线照射或醌茜素作用相比可明显引起其G₂+M期阻滞(X线照射+醌茜素:单独X线照射, A549细胞P=0.000, H460细胞P=0.0024;X线照射+醌茜素:单独X线照射, A549细胞P=0.000, H460细胞P=0.000)。结论 通过醌茜素抑制蛋白激酶CK2活性可增加NSCLC细胞的放射敏感性。     

miR-126对细胞周期的调控及其与肺癌患者预后的关系

目的研究miR-126在肺癌中的表达变化及其与癌细胞周期调控的关系,并分析miR-126表达对肺癌患者术后生存期的影响。方法对肺癌细胞株A549和49例临床肺癌手术标本进行实时定量RT-PCR检测miR-126的表达;A549细胞转染miR-126表达载体,MTT和流式细胞术检测miR-126表达对癌细胞增殖和细胞周期的影响;Kaplan-Meier曲线和log-rank分析方法比较miR-126高、低表达组之间无瘤生存期和总生存期的差别。结果A549肺癌细胞miR-126低表达（2.10±0.67）,转染miR-126表达载体后,miR-126表达升高（12.33±1.67）;转染miR-126后96小时,A549细胞存活率为（68.33±6.67）%,明显低于亲本A549细胞（105.33±8.58）%,差异有统计学意义（P〈0.001）;与亲本A549细胞比较（G0/G1期：37.48±3.28;S期：62.03±5.23）,转染miR-126的A549细胞G0/G1期细胞比例上升（53.67±6.06）,S期下降（43.21±3.75）,差异有统计学意义（P〈0.001）;肺癌组织miR-126表达水平（12.41±4.34）明显低于癌旁肺组织（23.29±6.28）,差异有统计学意义（P〈0.001）;miR-126高表达组无瘤生存期和总生存期均明显高于低表达组（P〈0.01,P〈0.001）。结论 miR-126在肺癌的发生、发展中有重要作用,可能成为肺癌治疗的可选靶点之一。     

The Role of Chemokine Receptor CXCR7 in Lung Cancer

OBJECTIVE To investigate whether CXCL12 and its receptor,CXCR7, play a role in lung cancer invasion and metastasis.METHODS Western blot and immunocytochemistry were used to detect CXCR7 protein expression in 8 lung cancer cell lines, EKVX, HOP62, HOP92, NCI-H23, NCI-H226, NCIH322M,NCI-H446, and A549, and cell migration experiment was conducted to observe mobility of the lung cancer cells. The concentration of intracellular calcium in cytoplasm was measured under the fluorescence microscopy.RESULTS CXCR7 protein was positively expressed in the 8 lung cancer cell lines EKVX, HOP62, HOP92, NCI-H23, NCI-H226, NCIH322M,NCI-H446, and A549. Following CXCL12 stimulation,obvious pseudopodia of lung cancer cells was observed under the microscope. The cell migration experiment showed that after incubation with CXCL12, the number of EKVX cells, which passed through the polycarbonate microporous filter membranes increased to a great extent. This phenomenon can be reversed by CXCR7-siRNA. After CXCL12 incubation, the intracellular Ca2+level in the EKVX cells was increased to a great extent. CONCLUSION Chemokine CXCL12 facilitates the migration of lung cancer cells by changing the concentration of intracellular Ca2+. The CXCL12-CXCR7 axis may play an important role in lung cancer invasion and metastasis. It could be a potential target for lung cancer therapy and an effective way to prevent recurrence and metastasis of lung cancer.