噬菌体突变库技术在蛋白质改造中的应用

噬菌体展示突变蛋白库是以噬菌粒为载体,对蛋白质序列中的位点(特异或随机)在DNA水平上进行突变而构建的次级文库。突变蛋白库构建策略包括:寡核苷酸介导的直接位点突变、盒式突变、DNA shuffling以及错倾PCR。蛋白突变库主要应用于提高蛋白亲和力、延长半衰期、确定蛋白关键残基。     

核糖体展示技术的原理与应用

通过构建分子文库 (ｃＤＮＡ文库、随机肽库、抗体库及其它蛋白文库 ) ,采用合适的筛选技术可以非常方便、有效、快速地筛选生物活性物质。目前分子文库技术已经广泛应用于抗原表位分析、功能小肽分子 (如肽类拮抗剂和激动剂 )或功能蛋白分子 (如抗体 )的筛选和改造等领域。筛选技术主要有两类 :1.体内筛选技术 ,如噬菌体展示技术〔1〕 、选择性感染噬菌体技术〔2〕 等。 2 .体外筛选技术 ,如核糖体展示技术〔3〕。噬菌体展示技术是应用最为广泛的一种筛选技术 ,但其自身无法克服的缺点给具体应用造成了许多障碍。以噬菌体抗体库为例 ,由于…     

生物分子工程面临的挑战及我国现状——生物分子工程领域的研究进展

生物分子工程是科学研究和生产中一个崭新的领域,其主要任务是发现和生产有价值的生物分子,随着对生物分子在细胞内作用认识的深化,生物分子工程必将有重大的进展,这一进展又会进一步推动生物分子工程在医药、工业、农业和环保等领域更加广泛的应用。DNA改组（DNA shuffling）做为一种实用的分子进化技术自庭生之日起就受到了广泛的关注,它在生物分子工程中起着关键的作用。本文综述了生物分子工程领域的关键技术和主要产品及发展动态。     

基因转录的顺式调节

借助于缺失分析,定点突变技术,人们在DNA分子上识别出了启动子、增强子和负调节DNA片段三种类型的顺式调节片段,并通过DNA酶印迹法和凝胶迁移率改变等方法证明,顺式调节DNA片段是通过和特异的结合蛋白相互作用而产生调节基因转录效应的。近年来人们已纯化和克隆了一些顺式调节DNA片段结合蛋白,对其结构和功能的关系也进行了深入的研究。本文介绍了这方面的一些研究进展。     

基因芯片技术在医学研究中的应用

基因芯片技术是同时将大量的探针分子固定到固相支持物上 ,借助核酸分子杂交配对的特性对DNA样品的序列信息进行高效的解读和分析。它可用于基因表达谱的分析、突变检测 ,克隆选择和文库筛选等研究工作 ,同时在人类疾病的检测 ,预防等方面也具有广阔的应用价值 ,在未来的生命科学领域中必将发挥重要作     

抑癌基因P16,P15与泌尿系肿瘤

P16、P16是近年来发现新的抑癌基因 ,在很多人类原发性肿瘤和细胞株中有高频率的缺失突变。基蛋白产物通过特异性抑制细胞周期依赖激酶 ,而参与多数恶性肿瘤的发生过程。所以 ,P16 / 15基因已成为分子生物学 ,分子遗传学 ,临床医学等各领域专家研究的热点之一。1　 P16和 P15基因的发现与结构1993年 Serrano等发现了特异抑制细胞周期蛋白依赖性激酶 4( cyclin dependent kinase4,CDK4)的 P16蛋白 ,并克隆了 P16的 c DNA。 1994年美国的 Beach研究小组用 P16的 c DNA为探针 ,从 TGF-β阻断的 Ha Ca T细胞 c DNA文库中克隆出 P16…     

基因芯片技术

基因芯片技术是同时将大量的探针分子固定到固相支持物上,借助核酸分子杂交配对的特性对DNA样品的序列信息进行高效的解读和分析。它可用于基因表达谱的分析、突变检测、多态性分析、基因测序和基因组文库作图等研究工作,同时在人类疾病的检测、预防等方面也具有广阔的潜在应用价值,在未来的生命科学领域中必将发挥重要的作用。     

人慢性粒细胞白血病融合蛋白BCR-ABL适配子筛选及结构分析

目的:筛选、鉴定人慢性粒细胞白血病融合蛋白BCR-ABL适配子。方法:利用SELEX(Systematic evolution of ligands by exponential)技术,以高纯度融合蛋白BCR-ABL为靶分子,从体外化学合成的长度为90 bp的随机单链DNA文库中来筛选与融合蛋白BCR-ABL特异性结合的寡核苷酸适配子,并进行解离常数(Kd)值测定和适配子序列测定,再分别用Clustal W软件包和DNA Folding Sever分析适配子一级结构及二级结构,以酶联仪测定OD450值,根据OD值高低判定适配子亲和力大小。结果:经过13轮筛选,随机ss DNA文库与融合蛋白的亲和率从0.3%上升到47.1%,所有的一级结构没有共同的同源序列,二级结构分析结果显示,茎和环等二级结构可能是适配子和融合蛋白BCR-ABL结合的基础,其中,寡核苷酸适配子A2与BCR-ABL亲和力最高,kd值达72 nmol/L。结论:利用随机寡核苷酸文库筛选技术成功获得抗融合蛋白适配子,为临床上治疗和预防慢性粒细胞白血病提供一定的参考。     

突变型天花粉蛋白TCSYFF81-83ACS的生物活性及免疫原性分析

目的:构建一种突变型天花粉蛋白(trichosanthin,TCS),并对其生物活性和免疫原性进行分析。方法:选择TCS分子上可能的抗原决定簇位点(YFF81-83)进行定点突变,并将所构建的突变体(TCSYFF81-83ACS)在大肠杆菌中进行表达及纯化。随后与野生型TCS(wTCS)比较,分析其DNA酶活性、致核糖体失活活性、免疫原性和急性毒性。结果:初步检测显示,所构建的突变型TCS活性与wTCS活性几乎相当,而其免疫原性有所降低。结论:通过该方法改造TCS是可行的,有可能为抗HIV治疗提供一种高效、低毒、廉价的药物。     

PCR技术在cDNA文库构建中的应用

c DNA文库在基因分离和克隆中具有重要作用。近年来 ,随着分子生物学技术的发展 ,c DNA文库的构建方法有了许多改进和提高。尤其是 PCR技术的发明和引进使从少量来源的组织和细胞中构建 c DNA文库成为可能。本文就 PCR技术在 c DNA文库构建中的应用方面的进展作一综述。     

噬菌体显示技术在短肽库中的应用现状

噬菌体显示技术是近年来出现的一种新技术,它是将外源蛋白通过与丝状噬菌体外壳蛋白融合而将外源蛋白表达于噬菌体颗粒的表面。该技术已经被广泛地应用于噬菌体短肽库的构建。由于该表达的短肽可以与其相应的结合分子相识别而发挥其生物活性,因而,噬菌体短肽库技术在分子间识别机理的研究、蛋白工程的改造以及药物的筛选、疫苗的研制等方面具有广泛应用前景。本文综述了近年来噬菌体显示技术在短肽库中的应用进展。     

p53蛋白三维空间结构改变与人骨肉瘤的关系

目的 研究骨肉瘤中p53基因突变及其蛋白三维结构的改变,旨在分析p53基因突变的分子机制及其与骨肉瘤发生、发展的关系.方法 应用PCR-SSCP、DNA序列分析以及相关分析软件重构p53蛋白三维结构等技术对43例骨肉瘤进行研究.结果 将16例p53基因突变病例分为A组(p53基因DNA结合位点发生突变或缺损组)与B组(非DNA结合位点突变组或同义突变),A组的远处转移率明显高于B组(P<0.01),组织学分化低于B组(P<0.05),且中位生存时间(10.3个月)低于B组(34.3个月).结论 p53基因碱基的突变可引起相应氨基酸的改变,导致p53蛋白三维空间构象改变.p53基因DNA结合位点的突变可影响其蛋白的生物学功能,并促进骨肉瘤的发生、发展.     

通过基因突变提高噬菌体蛋白Ⅷ介导的抗体Fab段的展示

目的　构建基因Ⅷ变种文库 ,筛选表面展示效率高的突变体 ,改进抗体分子在噬菌体表面的呈现效果。方法　通过重叠PCR ,在基因Ⅷ引入随机突变 ,克隆到抗乙肝表面抗原 (HBsAg)的噬菌体抗体表达载体中 ,使抗HBsAg的Fab段通过蛋白Ⅷ展示于噬菌体表面 ,构建蛋白变种Ⅷ文库 ,筛选能使HBsAg表面呈现效果得到提高的蛋白Ⅷ突变体。结果　构建了一个库容为 6× 10 8的基因Ⅷ变种文库 ,使用游离抗原竞争、硫氰酸盐洗涤等方法进行淘筛 ,获得多个展示活性高于野生型蛋白Ⅷ的突变体 ,其中 2个最好的变种可使表面呈现效果提高 5 0～ 70倍。结论　通过对基因Ⅷ的改造可提高其对抗体Fab段的展示性能 ,获得 2株可使展示活性提高 5 0～ 70倍的基因Ⅷ突变体     

人类染色体显微切割技术及其应用

人类染色体显微切割技术可从特定区域切取所需的染色体片段，结合PCR、分子克隆、DNA测序和FISH等方法，用于染色体特定区、带的DNA文库构建、特异性探针的制备、疾病遗传学特征的分析和有关基因的鉴定、分离、克隆和定位等。而且，该技术有助于人类基因组物理图谱的绘制。     

一例线粒体DNA缺失综合征8A型家系的RRM2B基因突变检测及生物信息学分析

目的对一个线粒体DNA缺失综合征8A型(MTDPS8A)家系进行致病基因突变及表型分析。方法应用目标序列捕获加高通量测序技术对1例MDS患者及其父母进行神经肌肉Panel平行测序,在确定先证者的致病基因型后,应用Sanger测序法进行验证,同时检测患者直系亲属的基因型,并用REVEL、MutationTaster与PolyPhen-2软件预测该突变对蛋白功能的影响。结果患者的RRM2B存在罕见的复合杂合错义突变:c.587AG(p.Y196C)和c.424GA(p.D142N),导致该基因编码蛋白的第142位和第196位相应氨基酸的改变。这两种突变通过蛋白功能预测都为有害。结论 RRM2B基因的c.424GA和c.587AG复合杂合突变很有可能是MDS家系的分子发病原因,此基因型与临床表型有相关的部分。     

基因释放剂结合异源双链分析快速检测β地贫最常见的一种突变

β地贫是一种分子病理具有高度异质性的、我国南方最为常见的遗传性血液病.在已发现的23种β地贫突变中,CD41-42(-TCTT)移码突变基因频率最高(达41.6%).根据PCR原理和该突变的特点,作者设计了一对引物进行PCR特异扩增,电泳分析即可检出此种突变.并引进基因释放剂DNA模板快速制备法,从而使此技术更为简便和实用.作者运用此法检测了广东珠海地区114份β地贫样品,CD41-42突变捡出率为40.35%,并成功地应用于产前诊断中.根据实验结果,作者建议在分析未知β地贫突变时,首先采用本法先对CD41-42突变进行初筛,而将RDB和ASO技术作为补充.     

通过随机突变提高抗TNF-α单链抗体的亲和力

目的:提高抗TNFα单链抗体(scFv)的亲和力。方法:应用错配PCR技术在抗TNFαscFv基因中引入随机突变,再通过DNA交换(shuffling)使引入的点突变进一步重排组合,构建突变噬菌体抗体库。采用硫氰酸盐洗脱法对抗体库进行淘筛。挑选活性得到改良的克隆,用斑点ELISA法及硫氰酸盐洗脱ELISA法评估其亲和力的改善。结果:对PCR错配的突变库筛选未得到亲和力明显改善的抗体变种,经DNA交换进一步构建变种库后,筛选获得1个亲和力提高的克隆,其相对亲和指数为1.37mol/L,较亲本抗体的相对亲和指数0.48mol/L有明显提高。结论:通过错配PCR和DNA交换引入随机突变构建抗体库,可有效地提高scFv的亲和力。     

杀菌蛋白DNA改组的初步研究

目的：运用DNA家族改组方法提高杀菌蛋白（BPI23）的杀菌活性。方法：首先将人、猴、兔BPI23基因的PCR产物等量混合，用DNAase I消化，回收50bp左右的片段，再经无引物和有引物2步PCR反应获得与原基因大小相同的改组分子，将其与载体连接获得改组文库。应用Flp-In^TM定点整合表达系统，将BPI23改组文库插入CHO细胞基因组中1个单拷贝位点，分别检测各个细胞克隆的杀菌活性，从中筛选高活性的BPI23改组分子。结果：经过2轮改组和筛选，共获得4个活性高于人BPI23约4倍的克隆，它们与人BPI23基因有7－13个氨基酸的变化。结论：探索了CHO系统中进行DNA改组和筛选的方法与技术路线，成功进行了杀菌蛋白的改组，并为其它分子的改组提供了借鉴。     

1例17α-羟化酶/17,20碳链裂解酶缺陷症的临床和分子遗传分析

目的　通过对1例17α-羟化酶/17,20碳链裂解酶缺陷症(17OHD)患者的临床特点和基因突变研究,初步探讨17OHD临床表现的基因分子机制。方法　收集患者临床资料,提取患者外周血白细胞DNA,PCR扩增CYP17A1基因的8个外显子及内含子边界,测序确定CYP17A1基因的突变位点。结果　患者临床表现及内分泌功能检查完全符合17OHD,PCR产物测序发现, CYP17A1基因第6外显子329位密码子发生了TAC→AA的纯合突变,引起Tyr329Lys错义突变及以后密码子的移码突变,并形成了一个只包含418个氨基酸的截短蛋白,从而使该蛋白完全缺乏17α-羟化酶和17,20碳链裂解酶活性。　结论　CYP17A1突变导致的P450c17蛋白的结构改变是该17OHD患者临床表现的基因分子基础。     

多发性骨骺发育不良患者软骨寡聚物基质蛋白基因新突变

目的 对1例多发性骨骺发育不良女性患者的软骨寡聚物基质蛋白(cartilage oligomeric matrix protein,COMP)基因进行突变分析,为遗传咨询和产前分子诊断提供指导.方法 采集患者血样,提取基因组DNA,用外显子序列捕获+第二代测序技术对COMP基因进行基因突变的检测并用聚合酶链反应结合Sanger法核苷酸序列测定进行突变位点验证.结果 该患者COMP基因第9外显子存在c.956A＞T错义突变,其COMP基因第319位密码子由原来编码天冬氨酸的密码子GAC突变为编码缬氨酸的密码子GTC(p.Asp319Val).SIFT功能预测该错义突变将影响蛋白结构.结论 该患者发病是由COMP基因c.956A＞T突变导致,该突变国内外未见报道.