利用核糖体基因进行申克孢子丝菌基因分型

目的 利用探针与DNA印迹法对申克孢子丝菌进行种内分型,探讨其基因型特征与菌种来源及临床表现的关系.方法 CTAB法提取来源于不同地区31株孢子丝菌临床分离株及1株标准株的基因组DNA,以真菌通用引物ITS4、NS5扩增标准株的rDNA序列作为探针,与经限制性内切酶ApaI酶切后的基因组DNA进行印迹杂交.结果 杂交后形成多种清晰而稳定的带型,根据带型将31株孢子丝菌分为15种基因型(A-O型),其中A、B、C三型占51.61%.结论 探针与DNA印迹法是孢子丝菌种内分型较为敏感而可靠的方法,该方法所分基因型的不同与菌种的地区来源及临床表现有一定的相关性.     

马尔尼菲青霉临床分离株的rDNA ITS序列分析

目的 为设计马尔尼菲青霉种特异性引物,探讨马尔尼菲青霉病更加确切的诊断方法.方法 实验菌株为北京大学真菌和真菌病研究中心保存的4株马尔尼菲青霉,来源于国内不同地区.用真菌通用引物ITS1和ITS4 PCR扩增马尔尼菲青霉rDNAITS,扩增产物纯化后直接测序,测序结果在基因库核酸序列数据库进行同源序列搜索,并依据序列对比、分析.结果 4株临床分离的马尔尼菲青霉的rDNA ITS序列相同.与国外来源于美国、印度尼西亚、法国、澳大利亚的马尔尼菲青霉rDNA ITS序列基本一致.马尔尼菲青霉与荚膜组织胞浆菌、新生隐球菌、念珠菌的rDNAITS序列差异较大,青霉和曲霉属间rDNAITS的序列相似性较低,而青霉种间rDNAITS序列的差异不大.结论 不同来源的马尔尼菲青霉菌株间乃至不同青霉的种间的rDNA ITS序列均具有较高的同源性,提示该区可能不适于作为靶基因来设计马尔尼菲青霉的种特异性引物或探针.     

应用PCR技术快速鉴定申克孢子丝菌的实验研究

采用Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA,用申克孢子丝菌种特异性引物分别对21株申克孢子丝菌的基因组DNA进行PCR扩增.成功提取21株申克孢子丝菌基因组DNA,并用申克孢子丝菌种特异性引物分别从21株申克孢子丝菌基因组DNA中获得长度为320 bp的扩增产物.以申克孢子丝菌特异引物为基础的聚合酶链反应法鉴定申克孢子丝菌简便、快捷、特异,可用于临床诊断.     

聚合酶链反应技术检测申克孢子丝菌的实验研究

目的研究申克孢子丝菌的种特异性引物聚合酶链反应鉴定方法,从而为临床孢子丝菌病的分子诊断奠定基础。方法采用根据申克孢子丝菌几丁质合成酶基因1序列设计合成的一对寡核苷酸引物,分别对26株申克孢子丝菌(包括1株标准株,7株实验室保存株,18株临床分离株)及6种6株普通真菌(分属于3个菌属)的基因组DNA进行PCR扩增。结果扩增产物选择性的从26株申克孢子丝菌基因组DNA中获得,而对念珠菌属、毛癣菌属、小孢子菌属的6株普通真菌基因组DNA均为阴性。结论采用以申克孢子丝菌几丁质合成酶基因1序列为基础的聚合酶链反应法鉴定申克孢子丝菌特异、简便、快捷,可用于临床诊断。     

波氏假阿利什菌和尖端赛多孢子菌随机扩增DNA多态性分析

目的 了解波氏假阿利什菌和尖端赛多孢子菌的基因学特征,研究DNA分型与菌种来源的关系.方法 采用随机扩增多态性DNA分析(RAPD)方法.结果 3种引物可将来自5个国家的13株波氏假阿利什菌和18株尖端赛多孢子菌分为31个基因型.多引物聚类分析所得树状图显示,除来自哥伦比亚土壤的3株波氏假阿利什菌外,其他受试菌株无地域性群集分布特点.但受试菌株中的多数波氏假阿利什菌和尖端赛多孢子菌株分别聚集成一群.结论 波氏假阿利什菌和尖端赛多孢子菌存在较大株间差异,致病菌没有明显的地域性分布趋势,RAPD分型聚类分析结果与形态学分类之间具有一定一致性.     

申克孢子丝菌基因型鉴定在临床诊断中的应用

目的：探讨申克孢子丝菌临床分离株的基因型鉴定在临床诊断中的应用。方法：使用PCR法扩增引起三种临床类型的申克孢子丝菌菌株核糖体保守区及内转录间隔区（5．8SrDNA，ITSII）的基因序列，并进行测序。结果：三株临床分离菌株核糖体保守区及ITSII区基因序列完全一致，经测定为申克孢子丝菌，该基因序列与基因库中申克孢子丝菌菌株（AB089138）相关序列的同源性达100％。结论：申克孢子丝菌的ITS区相对保守，通过对ITS段基因序列的测定可在基因水平上对孢子丝菌进行菌种鉴定，为临床快速、准确诊断和治疗提供确切依据。     

申克孢子丝菌野生株致病性的实验研究

目的 研究申克孢子丝菌野生株的致病性。方法 制备申克孢子丝菌野生株的细胞悬液,注入小鼠体内,于接种后第1周开始至第10周,视发病情况每周分批处死、剖检,观察发病情况。结果 从自然环境中分离的申克孢子丝菌通过不同注射途径进入小鼠体内后均可导致小鼠致病;其产生色素的黑色菌株与不产生色素的白色菌株致病性无差异(P>0.05);腹腔组与尾静脉组比较致病性有差异(P<0.05).结论 申克孢子丝菌的野生株均具有致病性;黑白菌株致病性无显着差异;不同的致病途径致病性不同。     

四对孢子丝菌引物的特异性和敏感性评价

目的 筛选对孢子丝菌特异且敏感的引物。方法 以50株不同地区来源的孢子丝菌临床分离株及标准株的基因组DNA作为研究样本,以毛霉、烟曲霉、念珠菌临床分离菌株基因组DNA作为对照,通过特异引物PCR扩增的方法筛选国内外文献中报道的4对孢子丝菌引物。所有受试孢子丝菌菌株均出现同一扩增产物,而对照菌株未出现者记为特异性引物,随后将基因组DNA模板倍比稀释后依次行PCR扩增,记录各引物出现阳性扩增结果时的最小模板浓度,检测敏感性。结果 在相同PCR条件下,引物S2-R2、SSHF31-SSHR97及ITS3-SSP具有较好特异性,而引物SS3-SS4对孢子丝菌及念珠菌菌株均可扩增出同样大小的PCR产物。引物S2-R2的敏感性最好,基因组DNA模板浓度为5 pg/μL时即可被检出。结论 针对几丁质合成酶1基因的引物S2-R2为孢子丝菌特异且敏感的引物。     

应用PCR-RFLP进行申克孢子丝菌的分子生物学鉴定

目的　探索一种简单、快速的申克孢子丝菌的鉴定方法。方法　应用真菌通用引物ITS1和ITS4对来源于不同地区及不同临床型别孢子丝菌病的 2 8株申克孢子丝菌以及 9种其他临床上重要的真菌进行PCR扩增 ,利用限制性内切酶HaeⅢ对PCR产物进行酶切分析鉴定。结果　所有 2 8株申克孢子丝菌和其他 9种真菌均扩增出一条约 3 5 0bp的片段 ,其中 2 8株申克孢子丝菌RFLP带型一致 ,与 9种其他临床上重要的真菌RFLP带型差异较明显。 结论　PCR RFLP可以为建立一种简单、快速鉴定申克孢子丝菌的方法提供依据。     

不同地区申克孢子丝菌基因分型研究

目的:探讨申克孢子丝菌基因分型特征与菌种来源的关系。方法:采用随机扩增DNA指纹方法(RAPD)对来源于不同地区的31株申克孢子丝菌临床分离株进行DNA多态性分析。结果:①筛选出4个具有较好扩增片段的引物。②31株菌的DNA带型不完全相同,具有一定的遗传变异性,与菌株的地区来源有关。③同一患者不同部位取材的菌株间DNA型可不同。结论:随机扩增DNA多态性方法可用于申克孢子丝菌的DNA分型,其DNA带型与菌株的地区来源有关。     

Disseminated phaeohyphomycosis caused by Cyphellophora ludoviensis: A novel case report from Iran

Disseminated phaeohyphomycosis is a rare and unusual infection that can be caused by dematiaceous fungi. Cyphellophora is an uncommon aetiological agent of cutaneous and systemic fungal infections. This study describes a case of disseminated phaeohyphomycosis caused by C. ludoviensis in Iran. The molecular identification of the isolates was established by DNA sequencing of the internal transcribed spacer (ITS) region of rDNA. The patient was successfully treated with an 8-month course of systemic voriconazole.     

PCR-RFLP技术快速鉴定八种致病丝状病原真菌的实验研究

目的 建立能快速鉴定深部丝状真菌感染病原菌的PCR-RFLP方法。方法 用真菌通用引物扩增烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉、杂色曲霉、构巢曲霉、尖端赛多孢和串珠镰刀菌的ITS区,分别用HhaⅠ、HaeⅢ、HinfⅠ、TaqⅠ和MspⅠ 5种限制性核酸内切酶对PCR产物进行酶切,建立以PCR为基础的RFLP方法,然后对22株临床株和2株环境分离株进行PCR-RFLP图谱分析。结果 对PCR产物进行RFLP分析可以准确鉴定8种深部致病丝状真菌,从DNA提取到酶切分析可以在1个工作日完成。22株临床株和2株环境分离株PCR-RFLP鉴定结果与传统的形态学鉴定结果一致。结论 PCR-RFLP技术是一种能够快速鉴定丝状真菌的有效方法。     

“ITS/CAL"靶位分子鉴定结合表型分析确诊狭义申克孢子丝菌致淋巴管型孢子丝菌病一例

患者女,54岁,农民.左上肢近手腕部外伤后出现豌豆大小的单一红色结节15d,后肿大、破溃,并在30 d内发展为多个成串状分布的结节.皮肤科检查:患者左上肢可见多个呈线性排列的紫红色结节,质硬;部分结节破溃,伴少许脓性分泌物.组织病理提示,感染灶呈混合炎性细胞浸润为主的化脓性肉芽肿炎症;过碘酸雪夫染色阴性,未见真菌孢子、菌丝及星状体.活检组织真菌培养阳性.根据培养物形态学分析和内部转录间隔区(ITS)及钙调蛋白(CAL)编码区靶位的分子生物学鉴定结果,确诊该病例为狭义申克孢子丝菌致淋巴管型孢子丝菌病.给予患者10％碘化钾溶液10 ml/次每日3次口服;治疗2个月后,患者自觉症状明显改善,后失访.本例报道提示联合应用表型鉴定和“ITS/CAL”靶位的基因分析能够准确将孢子丝菌复合体鉴定到种水平.     

Rapid identification of Trichophyton tonsurans by specific PCR based on DNA sequences of nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) 1 region

BACKGROUND: Trichophyton tonsurans, a dermatophyte implicated in an international epidemic of tinea capitis, was also found to be responsible for infecting wrestling and Judo athletes nationwide in Japan since 2001. OBJECTIVE: A rapid and highly accurate means of identifying this pathogen has been required to control the infection. We have developed a T. tonsurans-specific PCR method based on the DNA sequences of the nuclear ribosomal internal transcribed spacer 1 region. SUBJECTS: Eighteen species of six genera of standard strains and 75 strains of clinically isolated Trichophyton species were used in this study. METHODS: A T. tonsurans-specific PCR primer pair (tonsF1 and tonsR1) was designed on the nuclear ribosomal internal transcribed spacer 1 region, located between 18S and 5.8S rDNA. Fungal DNA was extracted from the colonies grown on culture plates, and the specificity of the PCR primers was tested. RESULTS: The specific PCR product was amplified from the standard strain of T. tonsurans and from five strains isolated from black dot ringworms, but there was no band from the 70 clinical isolates of other Trichophyton species. This T. tonsurans-specific PCR method was able to detect 10 pg of T. tonsurans genomic DNA with ethidium bromide staining. CONCLUSIONS: A PCR identification system specific for T. tonsurans is rapid, sensitive, and specific.     

Epidemiological data and molecular characterization (mtDNA) of Sporothrix schenckii in 13 cases from Mexico

BACKGROUND: Sporotrichosis is an endemic mycosis in Mexico and Central America. OBJECTIVES: To present epidemiological data and characterize molecular subtypes of 13 strains of Sporothrix schenckii, and to correlate clinical and epidemiologic presentation with subtypes. METHODOLOGY: Thirteen Mexican cases of sporotrichosis were identified, and mitochondrial DNA (mtDNA) from clinical isolates of S. schenckii were analyzed using RFLP Hae III. Molecular types 2, 3, 14, 28, and 29 were observed. RESULTS: Clinical presentations and molecular types were consistent with established epidemiologic patterns for S. schenckii in this region. CONCLUSIONS: This investigation provides further evidence of the strong regional specificity of molecular types of this organism.     

HPLC法检测申克孢子丝菌的辅酶Q系统

目的 探讨一种真菌化学分类的新方法,了解申克孢子丝菌不同临床株的辅酶Ｑ系统。方法以ＹＭＢ培养基获取菌体经高压灭菌、皂化、正己烷提取的等获取辅酶Ｑ,采用ＨＰＬＣ分析其Ｑ－６、Ｑ－１０的含量。结果 正己烷提取可获粗制的辅酶Ｑ,方法简便。７株申克孢子丝菌临床分离株皆含有Ｑ－１０,仅２株菌含有少量Ｑ－６。结论 正己烷提取真菌的辅酶Ｑ方法简便,ＨＰＬＣ分析法灵敏度较高,申克孢子丝菌主要含有辅酶Ｑ－１０。