bFGF联合骨髓干细胞动员剂促进兔缺血后肢血管新生的研究

目的: 观察局部应用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）联合干细胞动员剂对促进兔缺血后肢血管新生的作用。方法: 40只大耳白兔均切断左侧股动脉及其分支，制作兔后肢缺血模型。成模后随机分4组(每组10只):(1)bFGF组,在缺血后肢肌内多次注射重组人bFGF蛋白;(2)G-CSF组,皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）;(3) bFGF+G-CSF组，按bFGF组和G-CSF组的方法给予bFGF和G-CSF;（4）对照组，给予等量生理盐水。术后4周，各组兔行腹主动脉造影，观察侧支血管形成情况。取内收肌和腓肠肌肌组织行病理切片检查;用图像分析系统统计血管密度;用免疫组化检测内收肌和腓肠肌中VEGF阳性表达的血管数。结果: 兔侧支循环血管条数、血管密度及VEGF阳性表达的血管数均依次为：bFGF+G-CSF组 > bFGF组 > G-CSF组 > 对照组 (均P<0.05)。结论: 在缺血下肢肌内注射bFGF蛋白和皮下注射骨髓干细胞动员剂均可促进血管新生，改善肢体缺血状态;但在骨髓干细胞动员的同时，联合应用bFGF蛋白效果更好，缺血肢体改善更明显。     

碱性成纤维细胞生长因子促进兔缺血后肢血管新生的实验研究

目的:了解局部应用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对促进兔缺血后肢血管新生的作用。方法:25只日本大耳白兔随机分2组,外科结扎切断各兔股动脉及其分支,制作兔后肢缺血模型。试验组各兔在缺血后肢肌肉内多次注射重组人bFGF蛋白(n=15);对照组给予等剂量生理盐水(n=10)。术后4周,各兔行腹主动脉造影观察侧支血管形成情况,取内收肌和腓肠肌肌肉行病理切片HE染色应用图像分析系统统计血管密度,并用免疫组织化学方法检测内收肌和腓肠肌中VEGF阳性表达的血管数。结果:试验组兔侧支循环血管条数、血管密度及VEGF阳性表达的血管数均大于对照组(P<0.01),缺血状态得到改善。结论:在兔缺血后肢肌肉中注射bFGF蛋白可促进血管新生,增加兔缺血后肢血液灌注,改善肢体缺血状态。     

小鼠后肢缺血肌肉及骨髓氧分压与HIF-1α蛋白水平的关系

目的探讨正常血供及缺血状态下小鼠后肢肌肉氧分压水平及其与HIF-1α蛋白表达的关系,为血管新生的体外低氧研究提供理论基础。方法选用成年雄性Balb/c小鼠30只〔体质量(20±2)g〕制备小鼠后肢缺血模型,实验分为正常对照组和缺血24 h、1周、2周及3周组,检测各组小鼠双侧后肢腓肠肌和股骨骨髓的氧分压,并对不同缺血时间的腓肠肌组织中HIF-1α蛋白表达水平采用Western blot法进行检测。结果腓肠肌及股骨骨髓正常的氧分压基线水平分别为(47.78±4.37)mm Hg和(21.55±3.40)mm Hg(1 mm Hg=0.133 k Pa)。不同缺血时间组小鼠患肢腓肠肌组织的氧分压均较健侧明显下降(P0.05),并在缺血1周时达到最低,此时肌肉组织的炎症反应也最严重,HIF-1α蛋白的表达水平也最高;随着缺血时间的延长,腓肠肌组织的氧分压有所回升,HIF-1α蛋白表达水平也下调,但肌肉组织HIF-1α蛋白的表达与氧分压的相关性无统计学意义(r=-0.86,P0.05)。股骨骨髓的氧分压在不同缺血时间点的变化不明显。结论缺血组织HIF-1α蛋白的表达水平能够反映肢体的缺血程度;不同组织的生理氧分压水平不同,为组织细胞的体外低氧研究提供了依据。     

绿色荧光蛋白转基因小鼠脂肪干细胞治疗后肢缺血的实验研究

目的观察绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠来源的脂肪干细胞(ADSCs)治疗小鼠后肢缺血的效果及其自身所带荧光标记的有效性。方法取4周龄GFP转基因小鼠的脂肪组织,消化获取GFP来源的脂肪干细胞(GFP-ADSCs),并用流式鉴定其表面的干细胞抗原。建立C57BL/6小鼠左后肢缺血模型并随机分成两组(每组16只):一组后肢缺血的肌肉组织内注射P3代的GFPADSCs 1×106个/100μl,对照组于同样部位注射100μl PBS。1个月后利用苏木素-伊红(HE)、免疫组织化学(IHC)及免疫荧光(IF)染色行CD31染色观察缺血肌肉组织内血管新生情况。结果1从GFP转基因小鼠的脂肪组织中可以获得大量GFP-ADSCs并表达干细胞表面抗原CD90及CD105;2 GFP-ADSCs被成功地诱导成脂成骨;3 GFP-ADSCs组总残肢恢复率显著高于PBS组(P0.05);4 1个月后GFP-ADSCs治疗组缺血的肌肉组织内IHC染色CD31可见较多的新生血管,其微血管密度数显著高于PBS组(P0.05);IF染色显示GFP-ADSCs治疗组的新生血管表达内皮细胞的特异性标记CD31和GFP,而PBS组则未见GFP绿色荧光表达。结论从GFP转基因小鼠的脂肪组织中可以获取大量的ADSCs,其能够促进小鼠后肢缺血肌肉组织内的血管新生,自带的GFP可以示踪ADSCs在受体内的存活、迁移及分化。     

地塞米松预处理减轻肾缺血再灌注损伤

目的探讨地塞米松（dexamethasone,DEX）对小鼠肾缺血再灌注损伤的作用及其机制。方法建立小鼠肾缺血再灌注损伤模型。18只雄性C57BL／6小鼠随机分为3个组（n=6）,分别为假手术组（Sham）、肾缺血再灌注损伤模型组（IRI）和DEX预处理组。Sham和IRI组缺血前60min予生理盐水（腹腔注射）,DEX组缺血前60min给予DEX（4mg／kg）,IRI组和DEX组血管夹夹闭左侧肾蒂,置于32℃温箱后1h松开血管夹,去除右肾。Sham组操作同上,但不夹闭左侧肾蒂,再灌注24h后处死小鼠,收集血清和肾脏标本。PAS染色后观察肾脏病理形态学变化,PCR检测白细胞介素6（interleukin6,IL-6）、干扰素γ（interferonγ,IFN-γ）和肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactorOt,TNF-a）Westernblotting检测pAkt和总的Akt。结果与Sham组相比,IRI组血清肌酐和血尿素氮明显升高。病理检查可见肾脏内肾小管上皮细胞明显肿胀坏死、蛋白管型形成明显,还可观察到炎症细胞浸润明显增加。PCR显示IL-6、IFN-γ和TNF-a mRNA水平明显上调,Westernblotting显示p-Akt蛋白表达量明显增加,但Akt蛋白表达量无明显差异。与IRI组相比,DEX治疗组血清肌酐、血尿素氮明显下降,肾小管上皮细胞肿胀坏死减轻、炎症细胞浸润减少,IL-6、IFN-γ和TNF-a表达降低,p-Akt表达减少,但Akt蛋白表达量无明显差异。结论DEX预处理可通过抑制Akt信号通路激活,从而抑制炎症反应,从而减轻肾缺血再灌注损伤。     

神经生长因子基因转染对缺血肢体血管生成和骨骼肌纤维重塑的影响

目的观察神经生长因子(NGF)对缺血肢体血管生成和骨骼肌纤维重塑的影响,探讨NGF与血管内皮生长因子(VEGF)在血管生成中的关系。方法 18只小鼠随机分为正常对照组、空白对照组和NGF治疗组,每组各6只。建立小鼠左后肢缺血模型,术后第7 d对NGF组进行基因转染。术后第21 d时对3组小鼠左后肢缺血进行评估,然后取腓肠肌组织进行HE染色、增殖细胞核抗原(PCNA)和CD34免疫组织化学染色,ELISA法检测腓肠肌组织中NGF、VEGF蛋白表达量,肌球蛋白ATP酶染色分析肌纤维类型。结果术后第21 d时,NGF组的左后肢肌肉萎缩程度弱于空白对照组,左后肢缺血评分明显低于空白对照组(P0.05),内皮细胞增殖指数、毛细血管密度、NGF和VEGF表达量均明显高于空白对照组(P0.05),Ⅰ型肌纤维比例也明显高于空白对照组(P0.05)。结论 NGF基因转染能够促进缺血肢体NGF、VEGF表达和血管生成,诱导肌纤维向Ⅰ型重塑,相关分子调控机制仍需进一步研究。     

基质细胞衍生因子联合骨髓单个核细胞移植治疗大鼠肢体缺血的实验研究

目的将基质细胞衍生因子(SDF-1)用于自体骨髓单个核细胞(BM-MNC)移植治疗肢体缺血,初步探讨SDF-1促进血管新生的机理和疗效。方法建立大鼠左后肢缺血模型,将动物随机分为非缺血对照组,缺血对照组,SDF-1局部应用组,自体BM-MNC移植组以及两者联合应用组。检测缺血后24 h左后肢腓肠肌SDF-1含量及CD133+细胞数量;于移植后4周动脉造影后处死动物,免疫组化法检测缺血区新生血管密度,评价血管新生情况。结果缺血对照组24 h肌组织SDF-1含量为(1．31±0．20)ng/50μg总蛋白,非缺血对照组为(0．93±0．29)ng／50μg总蛋白(P<0．05); CD133+细胞数(2．10±0．62)vs．(0．24±0．10)个／HP,P<0．01。SDF-1局部应用可增加缺血区CD133+细胞浸润数量(3．64±0．69)个／HP(P<0．01);并可提高四周后组织内新生血管数量;SDF-1与自体骨髓单个核细胞移植联合应用,可进一步提高新生血管数量。结论SDF-1可能在肢体缺血后自体干细胞的动员中起重要作用,其局部应用可促进缺血区血管新生或进一步提高干细胞移植治疗缺血的疗效。     

Mindin基因巨噬细胞特异性敲除小鼠的构建及其在肺缺血再灌注损伤中的作用机制

目的探讨Mindin基因巨噬细胞特异性敲除小鼠的构建, 及其在肺缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury, IRI)中的作用机制。方法通过Cre-Lop系统构建Mindin基因巨噬细胞内特异性敲除小鼠, 将小鼠分为C57/B6野生型小鼠假手术组(Sham组, 10只)、C57/B6小鼠手术组(Surgery组, 10只)、C57/B6小鼠手术组+Mindin重组蛋白干预组[Surgery(WT)+Mindin组, 10只]和Mindin-/-巨噬细胞特异性敲除小鼠手术组[Surgery(Mindin-/-)组, 10只]。通过夹闭肺门法构建肺IRI模型, 观察该基因敲除及重组蛋白干预后, 对肺IRI诱导的急性肺损伤(acute lung injury, ALI)、相关炎症因子IL1β、IL-18、TNF-α、高迁移速率蛋白B1(HMGB1)及核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、Gasdermin-D蛋白(GSDMD)、整合素β4(Integrin β4)的影响。同时, 对小鼠巨噬细胞J774A细胞系进行干预, 检测不同缺氧复氧分组(缺氧复氧组...     

pEGFP-C1/Akt体外转染骨髓间充质干细胞对后肢缺血大鼠血管生成的影响

目的 探讨经肌肉注射转染pEGFP-C1/Akt的鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)对后肢缺血大鼠血管生成的影响.方法 Wistar大鼠30只,制成双后肢缺血模型,双盲法随机分为基因治疗组(肌注经pEGFP-C1/Akt转染的MSCs)、非基因治疗组(肌注MSCs)及对照组(肌注PBS液).造模前、造膜后即刻及MSCs移植后1～7 d内,每天用红外线皮温仪测定大鼠后肢皮温变化.28 d时经动脉造影观察后肢血管生成情况; 免疫组化染色检测后肢毛细血管密度; 逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测后肢肌肉组织中Akt及血管内皮细胞生长因子(VEGF)的 mRNA和蛋白的表达.结果 移植3 d后基因治疗组大鼠后肢皮温升高明显.28 d时经动脉造影观察基因治疗组后肢侧支血管生成明显; 荧光显微镜观察有绿色荧光细胞在基因治疗组的内收肌和半膜肌分布.毛细血管密度: 基因治疗组为(7.1±0.3)个/高倍镜,非基因治疗组为(4.2±0.4)个/高倍镜,对照组为(1.3±0.2)个/高倍镜,各组间差异均有统计学意义(P＜0.01).Akt及VEGF的 mRNA和蛋白的表达分析: 基因治疗组Akt mRNA(2.44±0.14)和蛋白(1.12±0.13)及VEGF mRNA(1.11±0.11)和蛋白(0.97±0.13)表达水平均明显高于非基因治疗组Akt mRNA(1.58±0.13)和蛋白(0.78±0.12)及VEGF mRNA(0.78±0.14)和蛋白(0.67±0.11)以及对照组Akt mRNA(0.64±0.11)和蛋白(0.36±0.12)及VEGF mRNA(0.56±0.11)和蛋白(0.33±0.13)的表达水平(P＜0.01),后2组间比较差异亦均有统计学意义(P＜0.01).结论 pEGFP-C1/Akt体外转染骨髓MSCs促进后肢缺血大鼠血管生成的效果优于单纯MSCs治疗,为基因转染MSCs治疗缺血性疾病提供可能.     

小鼠异体皮移植创面使用细胞毒性T淋巴细胞抗原4-Ig重组腺病毒载体对其免疫功能的影响

目的　在小鼠背部移植异体皮后局部使用细胞毒性T淋巴细胞抗原 4 Ig(CTLA4 Ig)重组腺病毒载体 ,观察其对机体免疫功能的影响。　方法　将 6 0只BALB/c小鼠随机分为手术对照(A)组、CTLA4 Ig转染 (B)组及正常对照 (C)组 ,每组 2 0只。A、B组小鼠制作 1 .5cm× 1.5cm创面 ,移植同创面大小的C57BL小鼠皮肤后 ,A组小鼠创面涂抹不含腺病毒的交联聚丙烯酸树脂 (卡波姆霜 )0 .1g;B组小鼠创面涂抹含腺病毒的卡波姆霜 0 .1g,病毒滴度 5× 1 0 9/L。C组小鼠不作任何处理。术后 1d分别向 3组小鼠腹腔内注射体积分数 1 0 %绵羊红细胞 (SRBC)1ml。术后 7、1 4、2 1、2 8d收集血清进行凝集试验 ,检测SRBC抗体的效价 ,同时取BALB/c、C57BL及昆明小鼠的脾淋巴细胞作混合淋巴细胞培养 (MLC),观察CTLA4 Ig对脾淋巴细胞的抗原识别特异性及再次应答的影响。结果3组小鼠抗SRBC抗体效价组间比较 ,差异无显著性意义 (P >0.0 5 )。术后 1 4d内与A组比较 ,B组小鼠脾淋巴细胞与对C57BL小鼠脾淋巴细胞表现出特异性低反应 (P <0.0 5);1 4d后 ,A、B组的再次应答达到或超过C组 (P >0.0 5 )。结论　局部使用CTLA4 Ig重组腺病毒不影响小鼠的体液免疫功能 ,但可能引起系统性的特异性细胞免疫耐受。