siRNA沉默β-Catenin对肝星状细胞工、Ⅲ型胶原表达的影响

目的 研究siRNA干扰β-Catenin表达、阻断Wnt/β-Catenin信号通路对肝星状细胞(HSC)Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响.方法 将化学合成siRNA β-Catenin以Lipofectamine包裹,转染HSC-T6细胞,设阴性对照和空白对照,抽提细胞总RNA及蛋白质,收集培养上清液,应用反转录-聚合酶链反...     

siRNA沉默β-Catenin对肝星状细胞工、Ⅲ型胶原表达的影响

目的 研究siRNA干扰β-Catenin表达、阻断Wnt/β-Catenin信号通路对肝星状细胞(HSC)Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响.方法 将化学合成siRNA β-Catenin以Lipofectamine包裹,转染HSC-T6细胞,设阴性对照和空白对照,抽提细胞总RNA及蛋白质,收集培养上清液,应用反转录-聚合酶链反应和Western blot法检测细胞β-Catenin表达;Western blot法检测细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原表达情况;细胞免疫荧光法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原表达与定位;酶联免疫吸附法检测培养上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量.结果 转染siRNA的HSC-T6细胞β-Catenin基因及蛋白表达水平明显下调,Ⅰ、Ⅲ型胶原表达显著下调,免疫细胞化学提示转染siRNA β-Catenin后的Ⅰ、Ⅲ型胶原表达均较对照组明显减弱;48 h和72 h时培养上清液中Ⅰ型胶原表达水平显著减少,分别比阴性对照下降(23.68±7.96)％和(38.42±6.58)％(F= 18.26,P＜0.01;F= 26.38,P＜0.01),Ⅲ型胶原含量于72 h时降低(39.68±4.92)％ (F= 37.68,P＜0.0t).结论 siRNAβ-Catenin能高效抑制HSC-T6细胞β-Catenin表达,阻断Wnt/β-Catenin信号通路,从而抑制HSC-T6细胞增殖,显著减少Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成和分泌,具有预防及治疗肝纤维化的潜力.     

卡维地洛对肝星状细胞增殖与凋亡的影响

目的观察卡维地洛对肝星状细胞增殖与凋亡的影响。方法以不同剂量卡维地洛(CVD)作用于肝星状细胞(HSC-T6)。CCK-8法检测CVD对细胞增殖的影响,流式细胞仪检测CVD对细胞凋亡的影响。统计学处理采用t检验。结果 CVD作用于HSC-T6后,CCK-8法检测模拟对照组细胞增殖抑制率为2.18±0.60,CVD10μmol/L组细胞增殖抑制率为6.30±1.44,CVD20μmol/L组细胞增殖抑制率为7.75±1.33。提示细胞增殖抑制率随CVD浓度的增高而增高。CVD10μmol/L组及CVD20μmol/L组与模拟对照组相比,差异有统计学意义。流式细胞术检测模拟对照组细胞凋亡率为(2.30±0.08)%,CVD10μmol/L组细胞凋亡率为(3.54±0.50)%,CVD20μmol/L组细胞凋亡率为(4.25±0.13)%,提示细胞凋亡率随药物浓度的增大而增加。CVD10μmol/L组及CVD20μmol/L组与模拟对照组相比,差异有统计学意义。结论 CVD可以抑制HSC-T6的增殖,促进HSC-T6的凋亡。     

去甲肾上腺素对肝星状细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨交感神经递质去甲肾上腺素（NE）对HSC细胞株（CSFC）增殖和凋亡的影响。方法体外培养CFSC,分为以下6组：（1）空白对照组,为单纯CFSC培养;（2）交感兴奋（NE）组;（3）交感抑制（酚妥拉明＋普萘洛尔）组;（4）α肾上腺素受体（AR）阻滞（酚妥拉明）组;（5）β1AR阻滞（CGP20712A）组;（6）β2AR阻滞（ICI118551）组。MTT法测定细胞增殖;TUNEL法观察CFSC凋亡状况;流式细胞仪检测细胞凋亡率;倒置相差显微镜观察细胞形态学变化。结果MTT法显示,NE对CFSC具有明显的促增殖作用,加入α-AR、β1AR、β2AR阻滞剂后细胞增殖均受到明显抑制。NE作用于CFSC 24h,TUNEL法显示CFSC的凋亡率显著低于对照组（6.60%±3.05%与12.60%±4.76%,P〈0.05）;加入AR阻滞剂后CFSC凋亡率升高,其中α-AR和β2AR阻滞剂作用最显著。同时,流式细胞仪显示加入NE后CFSC凋亡率也显著降低（2.29%±0.22%与3.06%±0.57%,P〈0.05）;与TUNEL结果一致。NE对细胞形态没有明显影响。结论交感神经递质NE对体外活化的CFSC具有促增殖作用,并且可以抑制CFSC的凋亡,可能主要通过α受体和β2体起作用。     

小分子干扰RNA沉默结缔组织生长因子对鼠肝星状细胞培养激活的影响

目的研究化学合成小分子干扰RNA(siRNA)对大鼠原代肝星状细胞(HSC)结缔组织生长因子(CTGF)基因表达的阻抑作用及对HSC培养激活的影响。方法以胶原酶原位灌注消化加密度梯度离心法分离大鼠原代HSC,将siRNA以脂质体包裹,转染培养72h的原代HSC,设空白对照,收集孵育96h细胞,以Westernblot和免疫细胞化学染色法检测原代HSCCTGF及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)基因表达。结果转染siRNA的原代HSCCTGF及α-SMA基因表达显著下调,与对照相比,CTGF蛋白下调(92±5)%(P<0.01);α-SMA蛋白表达分别下调(62±9)%(P<0.01,Westemblot方法)和(58±6)%(P<0.01,免疫细胞化学染色法)。结论siRNA能显著下调大鼠原代HSCCTGF基因表达,明显阻抑原代HSC培养激活,提示针对CTGF基因化学合成的siRNA具有防治肝纤维化的潜力。     

抗结缔组织生长因子小干扰RNA对鼠原代肝星状细胞增殖的影响

细胞外基质（ECM）积聚与活化肝星状细胞（HSC）数量密切相关，增殖是活化HSC的重要生物学特性之一，也是调控活化HSC数量的一种重要方式，结缔组织生长因子（CTGF）主要由活化HSC产生，是HSC增殖的一个重要刺激因子。     

沉默结缔组织生长因子表达对肝星状细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察靶向沉默结缔组织生长因子(CTGF)表达对肝星状细胞(HSC)-T6增殖、凋亡的影响。方法将HSC-T6细胞随机分为3组,A、B组分别转染CTGF siRNA及无义序列4~6 h,C组不转染;培养24 h,采用RTPCR法检测CTGF mRNA,MTT法检测细胞增殖速度,Annexin V/PI双染色法测算细胞凋亡率,Western blot法检测细胞中Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白。结果 A组CTGF mRNA表达量(0.12±0.03)明显低于B组(0.87±0.07)和C组(0.85±0.09),细胞增殖速度(0.21±0.05)明显慢于B组(0.38±0.04)和C组(0.39±0.05),细胞凋亡率(37.5%±0.6%)高于B组(0.9%±0.3%)和C组(1.1%±0.2%),Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达量(29.2±0.8,26.4±2.7)均低于B组(66.7±1.7,64.7±0.9)和C组(68.4±1.7,66.1±2.2),P均<0.05。结论 靶向沉默CTGF基因可抑制HSC-T6细胞增殖,促进其凋亡,并显著减少Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的合成和分泌。     

IGFBPrP1 siRNA诱导的大鼠肝星状细胞凋亡及其机制

目的研究IGFBPrP1 siRNA对大鼠肝星状细胞凋亡的影响,并探讨其可能的机制。方法体外培养大鼠肝星状细胞株（HSC-T6）,分别设立：正常对照组,阴性对照组,IGFBPrP1 siRNA转染组。IGFBPrP1 siRNA转染大鼠肝星状细胞,转染不同时间后,用CCK-8试剂盒检测肝星状细胞增殖的变化,AnnexinV/PI双标法流式细胞术检测肝星状细胞凋亡的变化,免疫细胞化学染色法检测P53及Bcl-2蛋白表达的变化。结果 （1）IGFBPrP1 siRNA转染大鼠肝星状细胞不同时间（24、48、72 h）后,转染组细胞增殖受到抑制且凋亡率明显增高,与正常对照组及阴性对照组相比,差异均有统计学意义（P〈0.01）;（2）IGFBPrP1 siRNA转染大鼠肝星状细胞48 h后,与正常对照组及阴性对照组相比,转染组P53蛋白的表达量显著增高（P〈0.01）;Bcl-2蛋白的表达明显降低（P〈0.01）。结论 IGFBPrP1 siRNA能显著抑制大鼠肝星状细胞增殖且能促进其凋亡;上调P53的表达,下调Bcl-2的表达可能是IGFBPrP1 siRNA诱导大鼠肝星状细胞凋亡的途径之一;推测抑制IGFBPrP1的表达有可能成为治疗肝纤维化的新靶点。     

半乳糖凝集素-3对肝星状细胞增殖及凋亡的影响

目的 观察半乳糖凝集素-3(galectin-3)表达与肝星状细胞增殖和凋亡的关系.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测大鼠肝星状细胞中galectin-3 mRNA和蛋白的表达,设计合成galectin-3小干扰片段,筛选有效片段构建质粒,转染大鼠肝星状细胞系rHSC-99,并设立对照组和空质粒转染组,RT-PCR及Western blot检测RNA干扰后galectin-3的表达.活细胞计数法观察干扰后24、48,72 h各组细胞增殖情况;Annexin-V/PI染色,流式细胞仪检测转染72 h后各组细胞凋亡情况.组间比较用LSD法t检验进行统计学分析.结果 rHSC-99细胞表达galectin-3;成功构建pG Csilencer U6/Neo/GFP/shRNA,并经测序验证正确.转染效率为40%～50%,RT-PCR结果显示:RNA干扰组galectin-3 mRNA表达量较对照组下降了52.4%(F=136.432,P＜0.01),Western blot显示RNA干扰组galectin-3蛋白表达量较对照组下降了69.2%(F=144.842,P＜0.01).干扰后48 h和72 h时,galectin-3 RNA干扰组细胞增殖较对照组分别下降38.1%(F=4.425,P=0.010)和37.5%(F=4.415,P=0.018);干扰72 h时,galectin-3 RNA干扰组细胞凋亡率显著高于对照组:早期凋亡率增加155.2%,与对照组比较,F=27.588,P＜0.01;晚期凋亡率增加56.9%与对照组比较,F=12.798,P＜0.01.结论 rHSC-99细胞表达galecitn-3;RNA干扰rHSC-99细胞galectin-3的表达能抑制rHSC-99的增殖并促进其凋亡.     

熊果酸对肝星状细胞增殖与凋亡的影响

目的 体外观察熊果酸对肝星状细胞增殖与凋亡的影响,探讨熊果酸诱导肝星状细胞凋亡的可能作用机制. 方法 将不同浓度熊果酸作用于肝星状细胞HSC-T6及肝细胞L02,分别在药物作用24、48、72 h后用四甲基偶氮唑盐法检测熊果酸对HSC-T6及L02细胞增殖的影响;流式细胞仪检测熊果酸对HSC-T6凋亡的影响;光学显微镜观察熊果酸作用后细胞形态学变化情况;免疫细胞化学法检测HSC-T6中Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的表达情况. 结果 各种浓度的熊果酸均可抑制HSC-T6细胞的增殖,且呈剂量-时间依赖性;当熊果酸浓度为25、50、75μmol/L时可促进L02细胞增殖,浓度＞75μmol/L则表现为抑制L02细胞增殖.在病理形态学方面,熊果酸作用HSC-T6细胞48 h后,光学显微镜下可见细胞缩小变圆、核浓缩等.25、50、75 μmol/L熊果酸作用HSC-T6细胞48 h后,流式细胞仪检测显示细胞凋亡率分别为10.30%±3.85%、21.87%±4.46%、31.33%±6.18%,比对照组(2.93%±1.60%)明显升高(P＜0.01).免疫细胞化学显示Bax及Caspase-3蛋白表达较对照组升高(P＜0.05),且呈剂量依赖性,而Bcl-2蛋白表达水平与对照组无明显差异(P＞0.05).结论 在体外熊果酸可较明显地抑制HSC-T6细胞增殖,诱导其凋亡;对L02细胞的生长具有双向调节作用.熊果酸诱导HSC-T6细胞凋亡可能与降低Bcl-2/Bax比值、激活Caspase-3蛋白有关.     

半乳糖凝集素-3对肝星状细胞增殖及凋亡的影响

目的 观察半乳糖凝集素-3(galectin-3)表达与肝星状细胞增殖和凋亡的关系.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测大鼠肝星状细胞中galectin-3 mRNA和蛋白的表达,设计合成galectin-3小干扰片段,筛选有效片段构建质粒,转染大鼠肝星状细胞系rHSC-99,并设立对照组和空质粒转染组,RT-PCR及Western blot检测RNA干扰后galectin-3的表达.活细胞计数法观察干扰后24、48,72 h各组细胞增殖情况;Annexin-V/PI染色,流式细胞仪检测转染72 h后各组细胞凋亡情况.组间比较用LSD法t检验进行统计学分析.结果 rHSC-99细胞表达galectin-3;成功构建pG Csilencer U6/Neo/GFP/shRNA,并经测序验证正确.转染效率为40%～50%,RT-PCR结果显示:RNA干扰组galectin-3 mRNA表达量较对照组下降了52.4%(F=136.432,P＜0.01),Western blot显示RNA干扰组galectin-3蛋白表达量较对照组下降了69.2%(F=144.842,P＜0.01).干扰后48 h和72 h时,galectin-3 RNA干扰组细胞增殖较对照组分别下降38.1%(F=4.425,P=0.010)和37.5%(F=4.415,P=0.018);干扰72 h时,galectin-3 RNA干扰组细胞凋亡率显著高于对照组:早期凋亡率增加155.2%,与对照组比较,F=27.588,P＜0.01;晚期凋亡率增加56.9%与对照组比较,F=12.798,P＜0.01.结论 rHSC-99细胞表达galecitn-3;RNA干扰rHSC-99细胞galectin-3的表达能抑制rHSC-99的增殖并促进其凋亡.     

苦参碱对大鼠肝星状细胞增殖和凋亡的影响

目的研究苦参碱对体外培养肝星状细胞(HSC)增殖与凋亡的影响,探讨苦参碱抗肝纤维化作用机制。方法用0.125、0.25、0.5mgml的苦参碱分别处理HSC细胞系rHSC99和肝细胞株HL770224h后,MTT比色法检测细胞增殖,AnnexinVFITCPI双染色流式细胞分析法检测早期细胞凋亡,TUNEL法原位检测DNA断裂,透射电镜观察形态改变。结果①苦参碱对HSC增殖有明显的抑制作用,且作用呈剂量依赖性;苦参碱对肝细胞增殖有促进作用,但促增殖作用不随浓度增加而增强。②AnnexinVFITCPI双染色流式细胞分析:对照组、苦参碱0.125mgml组、0.25mgml组、0.5mgml组凋亡率分别为0.99%±0.45%、5.00%±0.98%、13.6%±2.19%、17.2%±2.17%,差异有显著性(F=63.14,P<0.05)。苦参碱处理组细胞TUNEL检测发现DNA断裂,透射电镜下见核仁消失,染色质浓缩并凝聚成团块状,沿核膜排列。结论苦参碱可抑制HSC增殖、诱导HSC凋亡,可能是其抗肝纤维化机制之一。     

特异性小干扰RNA对晚期糖基化终产物受体介导肝星状细胞激活和胶原生成的抑制作用

目的 探讨特异性小分子干扰RNA对晚期糖基化终产物受体（RAGE）介导肝星状细胞（HSC）激活和胶原生成的影响。方法 构建RAGE特异性siRNA表达载体，经脂质体转染入HSC—T6细胞，以空白和转染非特异性siRNA表达载体pGCsi-C为对照，分别用实时荧光定量PCR和Western印迹法检测各组HSC—T6细胞RAGE、α平滑肌肌动蛋白（α—SMA）和Ⅰ型胶原基因及蛋白的表达。结果 与空白对照组和pGCsi—C组相比，转染特异性siRNA表达载体pGCsi—R1的HSC—T6细胞RAGE mRNA和相对分子质量50×10^3、46×10^3的RAGE蛋白表达分别下调79．65％、78．04％（F=26．005，P〈0．01），56．09％、54．93％（F=365．185，P〈0．01）和63．67％、59．67％（F=386．07，P〈0．01），同时α—SMAmRNA和蛋白、Ⅰ型胶原mRNA和蛋白的表达也受到明显抑制，分别为空白对照组和pGCsi—C组的57．53％、65．50％（F=20．913，P〈0．05）、58．48％、62．80％（F=56．592，P〈0．05）、71．16％、74．23％（F=18．091，P〈0．05）和71．91％、76．09％（F=17．299，P〈0．05）。结论 RAGE特异性siRNA可在细胞内稳定表达，并能有效抑制HSC的激活和Ⅰ型胶原生成。     

姜黄素对肝星状细胞增殖与凋亡的影响

肝星状细胞(HSC)在肝纤维化的发生中起重要作用，我们应用体外HSC培养技术，初步研究了姜黄素对HSC增殖与凋亡的影响，探讨姜黄素用于肝纤维化治疗的可能性。     

甘油三酯和极低密度脂蛋白对肝星状细胞增殖的影响

目的:探讨甘油三酯和极低密度脂蛋白对大鼠肝星状细胞增殖的影响。方法:用链霉蛋白酶和胶原酶原位灌流,Nycodenz密度梯度离心分离大鼠肝星状细胞,并以MTT比色法观察甘油三酯和极低密度脂蛋白对肝星状细胞增殖效应。结果:甘油三酯和极低密度脂蛋白可影响肝星状细胞的增殖,甘油三酯和极低密度脂蛋白浓度分别在12.5μg/ml和25～100μg/ml时对肝星状细胞增殖有促进作用(P<0.05或P<0.01)。结论:体外细胞培养表明,甘油三酯和极低密度脂蛋白可促进肝星状细胞增殖,其与脂肪肝纤维化的发生可能有关。     

甘油三酯和极低密度脂蛋白对肝星状细胞增殖的影响

目的探讨甘油三酯（ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ，ＴＧ）和极低密度脂蛋白（ｖｅｒｙｌｏｗ－ｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｉｏｎ，ＶＬＤＬ）对大鼠肝星状细胞（ｈｅｐａｔｉｃｓｔｅｌａｔｅｃｅｌ，ＨＳＣ）增殖的影响。方法用链霉蛋白酶和胶原酶原位灌流，Ｎｙｃｏｄｅｎｚ密度梯度离心分离大鼠ＨＳＣ，并以ＭＴＴ比色法观察ＴＧ和ＶＬＤＬ对ＨＳＣ增殖效应。结果ＴＧ和ＶＬＤＬ可影响ＨＳＣ的增殖，ＴＧ和ＶＬＤＬ浓度分别在１２５ｍｇ／Ｌ和（２５～１００）ｍｇ／Ｌ时对ＨＳＣ增殖有促进作用（Ｐ＜００５或Ｐ＜００１）。结论体外细胞培养表明，ＴＧ和ＶＬＤＬ可促进ＨＳＣ增殖，其与脂肪肝肝纤维化的发生可能有关。     

牛磺酸对离体肝星状细胞增殖及凋亡的影响

目的　观察牛磺酸对肝星状细胞增殖及凋亡的影响 ,并探讨其作用的可能机制。方法　用噻唑蓝 (MTT)法检测细胞增殖 ,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡 ,丫啶噔活体染色观察细胞凋亡形态 ,免疫细胞化学结合计算机图像分析系统检测c jun、c fos表达。 结果　在 5～ 5 0mmol/L浓度范围内 ,牛磺酸能剂量依赖性地抑制肝星状细胞增殖 ,可使G0 /G1期细胞增多 ,S期细胞减少 ,并能明显抑制c jun、c fos的表达 (P <0 .0 1)。此外 ,牛磺酸尚可抑制血小板源生长因子BB对肝星状细胞的促增殖作用 ,而牛磺酸对肝星状细胞凋亡无诱导作用。结论　牛磺酸可显著抑制肝星状细胞增殖 ,使肝星状细胞阻滞于G0 ～G1期 ;牛磺酸对肝星状细胞增殖的抑制作用与其抑制c jun、c fos的表达有关 ;牛磺酸不能诱导肝星状细胞凋亡。     

氧化苦参碱对肝星状细胞增殖抑制和促凋亡作用的影响

[目的]研究氧化苦参碱对体外乙醛造模后的肝星状细胞（HSC）增殖抑制及促凋亡作用的影响,探讨该药抗酒精性肝纤维化的作用机制。[方法]选取乙醛造模后HSC-T6为体外模型,以四甲基固氮唑盐（MTT）法分别检测800、400、200、100ug／ml浓度氧化苦参碱药物血清对HSC-T6作用48h后的抑制情况,找出最佳含药浓度;根据以上结果,以流式细胞仪检测HSC-T6的促凋亡作用。[结果]800ug/ml氧化苦参碱对HSC-T6细胞生长的抑制率最高,达到51．31％,与模型组比较差异有统计学意义（P〈0．01）。碘化丙啶染色流式细胞分析：800ug／ml药物血清作用HSC-T6,其在G0／G1、apop期细胞比例较模型组明显上升,S期细胞明显下降。[结论]氧化苦参碱可明显抑制HSC-T6增殖和诱导其调亡。     

阻断Wnt/β-catenin信号通路对活化肝星状细胞凋亡的影响

HSC的活化是肝纤维化的中心环节,参与HSC活化的多种因素如生长因子、细胞因子、氧化应激产物等,需通过HSC细胞内的信号转导才能发挥作用。Wnt／β-catenin信号通路是调控细胞生长、增殖和凋亡的关键通路,在胚胎发育和肿瘤发生中起着重要作用。近年来发现该信号通路与肺及肾纤维化的形成密切相关。