甲型血友病携带者的PCR-RFLP检测

①目的　探讨甲型血友病携带者的基因诊断方法。②方法　应用聚合酶链反应（ Ｐ Ｃ Ｒ）结合限制性酶切片段长度多态（ Ｒ Ｆ Ｌ Ｐ）分析技术,对５ 个甲型血友病家系的 ２９ 名成员进行了 ＦⅧ基因外显子 １８ 和内含子 ２２ 两个多态位点的扩增片段限制酶切长度多态性连锁分析。并对其中的１ 个家系进行了产前基因诊断。③结果　５ 个家系中有 ５ 名女性被确定为携带者,１ 个家系的男性胎儿被确定为病人。④结论　 Ｐ Ｃ Ｒ Ｒ Ｆ Ｌ Ｐ方法可对多数甲型血友病进行基因诊断。     

RhD阴性伴M抗体阳性产妇产后大出血抢救一例

人类红细胞血型除ABO血型外,还分为MN血型、Rh血型等多达20多种血型系统。Rh阴性血俗称"熊猫血"。Rh血型系统重要性仅次于ABO血型系统,MN血型是继ABO血型、Rh血型之后在临床输血检验中出现问题较多的一类重要血型。血型不合的血液输注,可危及患者生命,在临床应用中应加强重视。本文报道1例RhD阴性伴抗M抗体阳性产妇产后大出血的抢救情况,供各位同道参考。     

一种新的乙型肝炎病毒全基因组克隆技术的建立

目的建立一种乙型肝炎病毒(HBV)全基因组扩增及克隆的新方法。方法设计含SalⅠ、NotⅠ酶切位点的引物,用一片段PCR法扩增HBV全基因组,经双酶切后将PCR产物克隆入pBlueScript-(SK-)载体,进行HBV全基因组序列测定。结果用此方法成功获得35例HBV全基因组DNA序列。同时以重组质粒为模板进行敏感性和保真性测定,其敏感性为102个初始模板,核苷酸的人为突变率为1.6bp/kb。结论此方法可用于大规模HBV全基因组扩增和序列分析,为HBV的基础和临床研究提供了一种新方法。     

一种新的G6PD基因突变型的鉴定

目的:鉴定1例葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症患者的基因突变。方法:用聚合酶链反应、限制性内切酶筛查葡萄糖-6-磷酸酶基因1388G→A、1376G→T、1360C→T、1024C→T、592C→T、517T→C、493A→G,487G→A、392G→T、95A→G突变,用单链构象多态性筛查葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因的所有外显子,用核苷酸序列测定确定基因突变。结果:该患者未存在1388G→A、1376G→T、1360C→T、1024C→T、592C→T、517T→C、493A→G、487G→A、392G→T、95A→G突变,但在外显子8发现了一种新的G6PD基因突变———835A→G突变,此突变导致第279位的苏氨酸被丙氨酸取代,将其命名为G6PD-海口,其酶活性约是正常的10%,比835A→T突变型的活性低,后者的酶活性约是正常的40%;分析人G6PD的三维结构模型表明,第279位苏氨酸残基的羟基对于维持G6PD亚基的相互作用具有非常重要的作用。结论:835A→G突变是一种新的G6PD基因突变型,G6PD的第279位苏氨酸残基的羟基是维持G6PD亚基相互作用及酶活性的必需基团。     

国人9号和17号染色体膀胱移行细胞癌相关微卫星位点的杂合性丢失

目的 探讨国人9号和17号染色体微卫星位点的杂合性丢失(LOH)与膀胱移行细胞癌(TCC)发生、发展的关系。方法 选取微卫星位点D9S156、D9S157、D17S786和TP53，对24例TCC组织和外周静脉血提取的DNA用特异引物进行PCR扩增，扩增产物进行6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染，并进行LOH分析。结果 至少有1个位点出现LOH的TCC组织为58．3％(14／24)，同一组织2个位点同时出现LOH的肿瘤为12．5％(3／24)。X^2检验和Fisher精确概率检验(P＞O．05)，4个位点LOH的发生在浅表性和浸润性TCC之间无显著性差异。结论 国人9号染色体上肿瘤抑制基因(TSG)的失活与TCC的发生有关，与TCC的浸润性生长无关。17号染色体上TSG的失活可能与TCC的浸润性生长有关。     

NADH-细胞色素b5还原酶基因Arg57Gln/Cys203Tyr复合杂合子鉴定

目的　调查中国人遗传性高铁血红蛋白血症 (RCM)患者 NADH-细胞色素 b5还原酶 (b5 R)基因突变情况 .方法　采用逆转录 -聚合酶链反应产物直接测序法 ,分析 RCM患者 b5 R基因的 c DNA全部编码序列 ;PCR结合限制性内切酶Msp I和 Rsa I酶切分析患者及其母亲的 b5 R基因组 DNA扩增片段 .结果　患者的 b5 R基因存在 Arg5 7Gln(CGG→CAG)和 Cys2 0 3Tyr(TGC→ TAC)复合杂合型突变 ;突变的等位基因位于不同染色体上 ,前者来源于母亲 ,后者来源于父亲 .结论　在国内外首次发现 I型 RCM患者的 b5 R基因存在复合杂合型突变     

一种新的人血管内皮生长因子基因的剪切形式

目的：检测人胚胎肺组织中新的血管内皮生长因子（VEGF）基因的可变剪切形式。方法：对胎儿肺组织的总RNA进行逆转录聚合酶链反应,克隆并测定扩增片段的序列。结果：用一对引物（引物5′端－21－7,3′端554－576）可扩增出3条片段,1条长度为正常的VEGF165（619bp) ,1条为正常的VEGF121（487bp),第3条为新的VEGF mRNA“异常”剪切片段,测序结果显示,此片段扩增长度为639bp,同样为VEGF165全长核苷酸序列,但在VEGF165的第三和第四外显子之间插入了长度为20bp的片段,经序列检索发现20bp的插入序列为滞留的第Ⅲ内含子终末序列,含内含子剪切信号,上述移码突变导致VEGF基因的阅读框架发生变化,在第四外显子中游出现终止密码子,结论：在一引产胎儿的肺组织中发现了新的VEGFmRNA可变剪切形式,其生物学意义有待进一步研究。     

全自动血型仪与手工试管法检测血型的比较研究

目的通过评价全自动血型仪在临床血型鉴定中应用的可靠性和准确性,探讨全自动血型仪取代传统手工法检测血型的临床意义。方法分别用全自动血型仪和传统手工试管法检测我院2009年1月～2011年12月1 861例有供血需求的患者的血液样本,统计分析两种方法对ABO血型及Rh（D）阴性检测结果的差异,分析血型判读错误的原因。结果全自动血型仪与手工试管法检测血型,其血型判读结果差异无统计学意义（P〉0.05）,但仪器法的准确性更高。结论仪器法对于ABO血型及Rh（D）阴性鉴定结果的可靠性及效率均较高,避免了人为差错,更适合临床推广。     

RHD gene polymorphism among RhD-negative Han Chinese

TheRhbloodgroupsystemwasfirstdescribed 60 yearsagointhecontextofacaseofhemolyticdiseaseinanewborn (HDN ) 1　ItisnowunderstoodthatthepathogenesisofHDNinvolvesmaternalalloimmunizationbyRhantigens TheRhbloodgroupsystemisthemostpolymorphicofhumanbloodgroupsconsistingofatleast45independentantigens.2 　ExceptfortheABOsystem ,Rhisthemostclinicallysignificantintransfusionmedicine Rhantigensareassociatedwithincompatiblehemolytictransfusionreactions,HDN ,andautoimmunehemolyticanemia Individualsa…     

探讨ABO、RhD血型调查与建立Rh表型库在安全输血中的临床意义

目的 调查河北省邯郸市峰峰矿区ABO、RhD血型在人群中的分布情况,分析患者不规则抗体筛查结果,探讨ABO、Rh血型调查与建立Rh表型库在安全输血中的临床意义。 方法 收集我院8 000例住院患者ABO血型及RhD血型的检测结果,对需输血的患者5 000例进行不规则抗体检测,阳性结果标本进一步行抗体特异性鉴定。随机选取3 000袋RhD阳性滤白红细胞悬液样本检测Rh表型,通过电脑建立献血者Rh表型数据库,探讨其在输血中的重要意义及价值。 结果 8 000例患者中ABO血型分布情况从多到少依次为B型血（32.02%）、O型血（28.98%）、A型血（27.01%）、AB型血（11.99%）。不同年龄组间ABO血型分布情况差异有统计学意义（P＜0.05）,不同性别组中ABO血型分布情况差异无统计学意义（P＞0.05）。8 000例患者中RhD阴性48例（0.60%）。男性和女性 Rh血型分布差异无统计学意义（P＞0.05）。5 000例需输血患者的血样标本中不规则抗体阳性者30例（0.60%）,Rh血型系统抗体阳性19例（63.33%）,抗-E检出率最高。不规则抗体的检出率女性显著高于男性,差异有统计学意义（P＜0.05）。3 000例RhD阳性献血者血样标本Rh血型表型共8种,其中CCDee检出率最多,其次为CcDEe,DcDEE和ccDee检出率较少。 结论 ABO血型的分布与地域及年龄有关;临床上除在患者输血前进行不规则抗体筛查,应进一步检测其抗体特异性;建立献血者Rh表型数据库有利于预防因Rh表型不符输血引起的溶血性输血反应,对于临床安全输血工作具有重大意义。     

一种新的同时定量检测乙型肝炎病毒前基因组RNA和DNA的检测方法

目的 设计并建立一种新的能够同时测定核酸提取物中乙型肝炎病毒（HBV）前基因组RNA（pgRNA）和DNA的检测方法。方法 建立检测HBV pgRNA和DNA的探针法双重荧光定量PCR体系,通过DNA凝胶电泳、定量PCR等实验考察该检测体系的特异性和灵敏度,验证以该方法测定HepG2.2.15细胞及其培养上清中HBV pgRNA和DNA的可行性及准确度。结果 建立的探针法双重荧光定量PCR体系具有较好的特异性和灵敏度,测定不同稀释倍数的细胞培养上清时,在稀释倍数和测定结果间具有较好的相关性。但该方法更适用于测定细胞培养上清中的HBV pgRNA和DNA,而不适用于测定细胞样本。结论 本实验建立的方法能够避免核酸提取物中由于HBV DNA污染造成HBV RNA定量不准的问题,并且在一管PCR反应中同时实现了HBV pgRNA和DNA的双重检测,极大提高了检测效率,具有潜在的临床应用价值。     

HLA-DR快速基因分型PCR-SSP方法的建立

目的：探讨应用于器官移植配型及疾病相关性分析的方法及基本数据,建立一种高分辨率、高特异性、简单、快速、方便的ＨＬＡＤＲ基因分析方法。方法：利用ＤＲ１～ＤＲ１８序列特异性引物及１对内对照引物,采用序列特异性引物聚合酶链式反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒｓ,ＰＣＰＳＳＰ）技术对２２份国际标准细胞株ＤＮＡ及２０例未知ＤＲ型别的临床血液标本进行ＨＬＡＤＲ基因分析,扩增条件为：变性９４℃,６０ｓ;退火６５℃,６０ｓ;延伸７２℃,６０ｓ。２５个循环后,７２℃保温７ｍｉｎ。结果：对各个标准ＤＮＡ的分型结果显示,准确率及重复率均为１００％,无假阳性及假阴性。结论：该方法快速、简便、灵敏、重复性好,结果易于判断,适合临床器官移植组织配型、疾病相关性分析、法医鉴定及人类学研究等。     

增强型荧光实时PCR——高灵敏度SARS冠状病毒检测方法

严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory sydrome,SARS)是由SARS冠状病毒(SARS-coronavirus,SARS-CoV)引起的传染性强、病死率高的疾病[1-4].其传播的主要途径是通过近距离呼吸道飞沫传播.     

Rh血型DEL表型RhD蛋白表达的研究

目的 探讨Del血型个体是否表达正常的RhD蛋白。方法采用逆转录-聚合酶链反应（Rt-PCR）技术和cDNA序列分析技术，检测不同Rh表型Del血型（CCD^elD^elee、CcD^eldee和CeD^elD^elee）个体的RhDmRNA，分析Del蛋白的表达。结果Del血型个体有复杂的RhD mRNA形式，检测到缺失第7至第9外显子（Del789）、缺失第7和第9外显子（Del79）、缺失第8和第9外显子（Del89）、缺失第9外显子（Del9）、缺失第8和第9外显子加第7内含子的170个碱基（Del89＋170）（917-1086，Genbank AB035194）、缺失第9外显子加第7内含子的170个碱基（Del9＋170）等共6种形式的RhD转录子。这些转录子均缺失第9外显子，其中转录子Del9与正常RhDmRNA最相似。结论Del血型不存在正常的RhD mRNA，不编码正常的RhD蛋白质。     

运用单细胞聚合酶链式反应进行植入前诊断的性别鉴定

目的 :建立一种高效、快速、可靠的植入前诊断的性别鉴定方法。方法 :取成人外周血单个淋巴细胞和人胚胎单卵裂球 ,采用多重荧光PCR和多重巢式PCR同时扩增性别识别位点Amelogenin和 5号染色体上的基因IL 3。结果 :男性单个淋巴细胞荧光PCR扩增效率为 72 % ,巢式PCR扩增效率为 6 4 .7% ;女性单个淋巴细胞荧光PCR扩增效率为 76 % ,巢式PCR扩增效率为 6 5 % ,两者与供体外周血gDNA扩增结果的一致性均达 10 0 %。单卵裂球荧光PCR扩增效率为 86 .9% ,巢式PCR扩增效率为 85 .7% ,来源于同一胚胎的不同单卵裂球扩增结果的一致性达 10 0 %。巢式PCR与荧光PCR的扩增效率比较无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论 :巢式PCR和荧光PCR各有优劣 ,但荧光PCR操作简便 ,耗时短、灵敏度高 ,为今后的发展方向     

乙型肝炎病毒S区和C区基因长片段扩增新方法的探讨

目的 :为HBV基因研究提供一个灵敏度和扩增效率均较佳的长片段PCR新方法 .方法 :应用自行设计的引物扩增血清中HBVS区和C区的 2 .5kb基因 ,并与HBV全长扩增方法进行比较 .结果 :HBV 2 .5kbPCR方法在HBsAg阳性患者血清中的阳性检出率明显高于全长PCR方法 (P <0 .0 5 ) ,相同反应条件下 2 .5kbPCR产物的平均A值和灰度总值也高于 3.2kb的全长基因组 (P <0 .0 5 ) .结论 :HBV2 .5kbPCR方法的灵敏度和扩增效率高于全长PCR方法 ,可作为HBV相关疾病研究中的一种新的技术手段     

PCR方法检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌

目的:建立一种快速准确检验食品中单核细胞增生李斯特氏菌的方法。方法:采用聚合酶链反应（PCR）特异性扩增单核细胞增生李斯特氏菌溶血素基因(hly A),用PCR方法检测80份长春地区的食品样品。结果:在706 bp处出现hlyA基因的目的片段,食品样品中单核细胞增生李斯特氏菌阳性检出12份,阳性率为15%,与吉林省疾病预防控制中心同步进行的国标法检测结果一致,二者符合率100%。结论:PCR方法检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌更简便、快速、敏感、特异性高,适用于基层单位开展食品中单核细胞增生李斯特氏菌污染的调查及监测。