拉米夫定耐药毒株的P基因序列特点

目的探讨拉米夫定耐药毒株P基因序列特点。方法分析247例慢性乙型肝炎患者血清标本,利用PCR-RFLP筛检YMDD变异株,对YMDD变异阳性的部分患者标本进行P基因测序。结果应用PCR-RFLP筛检发现了42例感染YMDD变异株的患者,对其中的19例患者进行测序分析有10例除发生YMDD变异外还有P基因A-E区其他部位氨基酸的突变,有4种点突变同时在2个以上的患者中发生,包括rtL80I,rtG172E,rtG174C和rtG172E/rtG174C联合突变。结论拉米夫定耐药毒株除了常见的C区YMDD变异和B区rtL180M变异之外,还可以发生其他位点的突变,但这些位点的突变是否与拉米夫定耐药有直接关系还有待进一步证实。     

应用RNA干扰技术抑制乙型肝炎病毒抗原表达的实验研究

目的 构建针对乙型肝炎病毒(HBV)核心区的siRNA表达载体pSIHBV／C,观察其对HBV复制和表达的影响。方法 将构建成功的pSIHBV／C与1．3倍HBV真核表达质粒pHBV1．3共转染HepG2细胞,转染后24、48、72h,用Abbott试剂检测细胞上清中HBsAg和HBeAg,并用免疫荧光染色法观察细胞内病毒核心抗原和表面抗原的表达。结果 成功构建了针对HBV核心区的siRNA表达载体pSIHBV／C,并发现它能明显抑制HBsAg和HBeAg的分泌,转染后第2天抑制率达高峰,分别为92％、85％,而随机序列的siRNA无此作用。免疫荧光染色结果也证实转染24b后,随pSIHBV／C比例的升高,其对HBV抗原表达的抑制作用也随之增加,当pSIRNA／C与pHBV1．3比例为1：20时,pSIHBV／C对细胞内HBsAg和HBcAg表达的抑制作用最强。结论 乙型肝炎病毒核心区的siRNA具有显著和特异的抗HBV复制和表达的作用。     

乙型肝炎病毒复制表达载体的构建与表达

目的构建乙型肝炎病毒(HBV)复制表达载体,验证其在HepG2细胞系中的复制和表达。方法通过引物设计合成,以实验室构建的HBV C1亚型质粒通过PCR、酶切、克隆等分子生物学技术,构建HBV复制表达载体。利用转染试剂(Fugene HD Transfection Reagent)将载体质粒导入HepG2细胞,分别检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)和HBV DNA在不同时间点的表达。结果酶切和测序结果均证实载体构建成功,通过瞬时转染细胞证实培养上清液中可检测到HBsAg、HBeAg和HBV DNA。结论利用分子克隆技术成功构建了HBV复制表达载体,可以在HepG2细胞系中复制表达。通过进一步改造,可以为HBV表型耐药以及复制活性研究提供支持。     

HBV全基因组克隆转染细胞系的建立

目的:建立HBV体外细胞培养体系. 方法:构建HBV全基因克隆质粒pcDNA3-3HBV,稳定转染HepG2细胞,G418筛选. ELISA检测细胞上清液HBsAg,HBeAg的表达,免疫组化检测细胞内HBcAg的表达,RT-PCR检测细胞S基因mRNA的表达,PCR检测细胞上清液DNA. 结果:成功构建了HBV全基因克隆质粒pcDNA3-3HBV,稳定转染HepG2后,培养上清HBsAg,HBeAg阳性,细胞内HBcAg呈核浆型分布,且以浆型分布为主. RT-PCR证实有HBV S基因 mRNA 的表达,上清中HBV S及前S基因阳性,荧光定量PCR检测显示培养上清中HBV 滴度达1×108拷贝/L. 结论:重组质粒pcDNA3-3HBV能在HepG2细胞中表达、转录、复制,该细胞培养体系能产生较高水平的HBV.     

K83A变异MxA蛋白抑制HBV复制体外研究

目的研究K83A变异MxA蛋白抑制HBV复制活性。方法将pcDNA3.1-MxA(wild-type)重组质粒(WT组)、pcDNA3.1-MxA-K83A重组质粒(K83A组)和pcDNA3.1空质粒(对照组)分别与pU19-1.24HBV重组质粒按2∶1比例瞬时共转染HepG2细胞,转染3d后western blot检测MxA蛋白表达,Abbott检测各组细胞上清HBsAg和HBeAg表达,定量PCR检测上清和细胞内HBV DNA水平,统计学分析结果。结果MxA、K83A组有较好的MxA蛋白表达;与对照组相比,K83A组和MxA组上清HBeAg分别下降73%和71%(P<0.05),上清HBV DNA水平分别下降2.22lg和2.11lg(P<0.01),细胞内HBV DNA水平下降1.89lg和1.78lg(P<0.01)。结论K83A变异不影响MxA蛋白抑制HBV复制活性。     

乙型肝炎病毒adr型全基因组C区突变株的构建及其生物学活性检测

目的 构建乙型肝炎病毒（HBV）全基因组C区L97和V60突变质粒，并检测其生物学活性。方法 采用定点突变技术将HBVadr1．2拷贝基因组质粒p3．8Ⅱ进行C区点突变，构建L97和V60两个突变株。质粒经脂质体介导转染HepG2细胞，Southern杂交分析细胞内HBVDNA复制，ELISA检测培养上清中HBsAg和HBeAg。结果 测序结果表明所构建的突变质粒p3．8L97和p3．8V60分别为nt2189A→C和nt2086→G，突变质粒均可在宿主细胞内复制和表达。结论 所构建HBV（adr型）全基因组C区L97和V60突变质粒具有生物活性。     

HBV混合感染中前C／cp区变异与HBeAg的相关性研究

目的 研究慢性乙型病毒性肝炎患者血清HBeAg表达与HBV混合感染中前C/C基因启动子cp变异的关系.方法 采用聚合酶链反应扩增HBV-前C/cp基因,以PUC18为载体构建质粒,并进行DNA序列测定后用DNAStar软件包进行序列分析.结果 9例患者体内共构建356份HBV-前C/cp质粒;测序结果显示同一患者体内均存在多种变异形式的HBV-前C/cp基因,HBeAg阳性患者体内多为野生株,而HBeAg阴性患者多为突变株;发现13种热点突变形式,其中12种在HBeAg阴性和HBeAg阳性患者体内分布有显著性差异.结论 HBV前C/cp区基因变异是导致HBeAg阴转的重要原因之一;HBV感染者体内同时存在多种变异形式的病毒株,野生株/突变株的比例波动在一定程度上决定血清HBeAg的水平.     

siRNA抑制乙型肝炎病毒在HepG2.2.15细胞中的复制与表达

目的 探讨靶向HBV S基因的siRNA表达质粒在HepG2.2.15细胞中对HBV病毒的复制与表达的抑制效应及其抗病毒活性.方法 设计并构建了两个靶向HBV S基因的siRNA表达质粒S1和S2,随机设计的用于对照的非同源siRNA表达质粒S3.首先在HepG2.2.15细胞中通过实时荧光定量PCR评估该siRNA表达质粒对HBV mRNA表达的抑制效应,接着在HepG2.2.15细胞中通过ELISA方法进一步枪测它们的抗病毒活性细胞上清液中HBV标志性蛋白HBsAg、HBeAg的表达水平.结果 在siRNA表达质粒转染HepG2.2.15细胞后48 h,HBV S基因mRNA表达量下降64%～88%,HBsAg和HBeAg的表达水平分别降低了60%～82%和56%～78%.S1+S2联合使用转染细胞中显著抑制HBV病毒的复制与表达的效率,而对照组S3无抑制效果.结论 发现靶向HBV S基因的siRNA表达质粒能够在HepG2.2.15细胞中有效的抑制HBV病毒的复制与表达,并能够降低细胞上清液中HBsAg和HBeAg的表达水平.S1+S2联合使用转染细胞中可以显著抑制HBV的复制与表达的效率.RNAi可能成为防治HBV感染有效的全新的抗病毒防御策略.     

乙型肝炎病毒adr型全基因组C区突变株的构建及其生物学活性检测

目的构建乙型肝炎病毒(HBV)全基因组C区L97和V60突变质粒,并检测其生物学活性。方法采用定点突变技术将HBVadr1.2拷贝基因组质粒p3.8Ⅱ进行C区点突变,构建L97和V60两个突变株。质粒经脂质体介导转染HepG2细胞,Southern杂交分析细胞内HBVDNA复制,ELISA检测培养上清中HBsAg和HBeAg。结果测序结果表明所构建的突变质粒p3.8L97和p3.8V60分别为nt2189A→C和nt2086C→G,突变质粒均可在宿主细胞内复制和表达。结论所构建HBV(adr型)全基因组C区L97和V60突变质粒具有生物活性。     

MXA蛋白抑制HBV复制的体外研究

目的 研究MXA蛋白抑制HBV复制的活性.方法 将pcDNA3.1-MXA重组质粒和PU19-1.24 HBV重组质粒分别按1:1、2:1共转染HepG2细胞(MXA组),对照组使用空pcDNA3.1、Salon DNA和PU19-1.24 HBV重组质粒共转染,3 d后Western blot检测MXA蛋白表达,Abbott法检测细胞上清HBeAg和HBsAg分泌量,定量PCR检测上清和胞内HBV DNA水平,统计学分析结果 .pcDNA3.1-MXA与PU19-1.24HBV重组质粒共转染HepG2细胞,对照组为pcDNA3.1-MXA重组质粒、PU19空质粒和Salon DNA共转染,3 d后裂解细胞Western blot检测MXA蛋白表达.结果 Western blot显示MXA组有MXA蛋白表达;与对照组相比,pcDNA3.1-MXA和PU19-1.24 HBV重组质粒按1:1转染时,MXA组HBeAg下降27%,上清HBV DNA和细胞内HBV DNA分别下降1个log值和0.6个log值;按2:1比例转染时MXA组HBeAg较对照组下降66%,上清HBV DNA和细胞内HBV DNA水平分别下降1.9个和1.7个log值,差异均具有统计学意义(P＜0.05).Western blot检测显示MXA蛋白抑制HBV组与对照组MXA蛋白表达没有明显差别.结论 MXA蛋白在HepG2细胞具有抑制HBV复制活性,抑制活性与蛋白的表达量相关;在抑制HBV复制过程中MXA蛋白自身可能不发生降解.     

Construction and biological activity assessment of core mutants of hepatitis B virus adr subtype.]

OBJECTIVE: To construct the core mutant (L97 and V60) plasmids of hepatitis B virus (HBV) and assess their biological activity. METHODS: Site-directed mutagenesis was performed to induce specific core point mutations in HBV adr suhtype 1.2 copy genome plasmid p3.8 II. The plasmids were transfected into HepG2 cells via liposome, and intracellular HBV DNA was analyzed by Southern hybridization, while extracellular HBV antigens (HBsAg and HBeAg) in the culture supernatant were assayed by enzyme-linked immunosorbent assay. RESULTS: Sequence analysis of the constructed mutant plasmids p3.8 L97 and p3.8 V60 demonstrated mutations at 2 189 A C and 2 086 C HBV adr subtype genome core mutant (L97 and V60) plasmids we have constructed possess biological activity.G respectively. These mutant plasmids exhibited HBV DNA replication activity and gene expression in host cells. CONCLUSION: HBV adr subtype genome core mutant (L97 and V60) plasmids we have constructed possess biological activity.     

靶向La的外源性microRNA抑制HBV复制和表达的实验研究

目的 设计并构建靶向La的microRNA表达载体,观察其对La基因的抑制作用,探讨其在HBV感染基因治疗中的应用价值.方法 以La为靶基因,设计并构建3个针对La不同位点的microRNA表达载体,通过脂质体方法转染HepG2.2.15细胞,RT-PCR和Western blot检测其对La mRNA和蛋白的抑制作用...     

RNA干涉对乙型肝炎病毒复制和表达的影响

目的：观察HBV S区和C区特异性的小发夹RNA（shRNA）表达载体对HepG2.2.15细胞中HBV复制和表达的影响。方法：采用含有pol Ⅲ启动子的真核表达载体pSilenceCircle-U6构建针对HBV S区和C区的特异性shRNA表达质粒SC-S和SC-C。实验设立SC-S组、SC-C组、无关对照SC-N组和空白对照组,采用不同浓度的重组载体转染HepG2.2.15细胞,并作用不同时间。应用ELISA方法检测细胞上清液中的HBeAg和HBsAg,用斑点杂交方法检测细胞上清中的HBV DNA。结果：成功构建了含目的序列的重组质粒SC-S和SC-C。SC-S对HBeAg和HBsAg表达的抑制率明显高于SC-C;随着给药浓度的增加,SC-S对HBeAg和HBsAg表达的抑制率逐渐增强;SC-S转染HepG2.2.15细胞后第3天产生明显抑制效应,对HBeAg及HBsAg表达的抑制率在第6天达高峰,第9天抑制率仍较高。斑点杂交结果显示,SC-S对HBV复制的抑制效应强于SC-C。结论：构建的HBV S区和C区特异性shRNA表达质粒有明显、高效抑制HBV复制和表达的作用。     

利用重叠延伸PCR快速构建中国株乙型肝炎病毒的感染性克隆

目的：体外扩增中国株乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）的基因组全长序列,快速构建中国株HBV感染性克隆,建立中国株HBV体外复制细胞模型。方法：设计保守引物,扩增HBV全长基因组序列。对扩增到的HBV基因组进行DNA测序及计算机辅助分析,确定病毒的基因型。通过重叠延伸PCR（splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR）技术,构建1.3倍基因组长度的HBV感染性克隆质粒pHBV1.3。将pHBV1.3质粒转染人肝癌细胞系HepG2,采用Western Blot、酶联免疫吸附试验及Real-PCR检测病毒复制及表达情况。检测该感染性克隆对临床抗病毒药物阿德福韦的敏感性。结果：成功扩增到1株C基因型HBV全长基因组,其GenBank登陆号为KF495606。构建了中国株HBV感染性克隆pHBV1.3（C）质粒,该质粒能在肝癌细胞株中进行有效的复制、转录和表达。阿德福韦能在体外抑制该HBV感染性克隆的复制,抑制程度依赖于药物浓度。结论：利用SOE-PCR可快速构建HBV感染性克隆,所构建的感染性克隆能介导高水平病毒复制,可用于HBV复制机制和抗病毒等方面的研究。     

利用纳米和RNA干扰技术抑制HBV-DNA 在HepG2 2.2.15细胞中的复制和表达

目的：通过RNA干扰和纳米技术抑制HBV-DNA在体外的复制和HBV核心抗原的表达。方法：制备靶向HBV核心抗原（HBcAg）的纳米小干扰RNA（siRNA）,利用U6启动子质粒转染入HepG2 2.2.15细胞;RT-PCR和Western印迹检测转染细胞HBV核心抗原在mRNA和蛋白水平的表达情况;real-time PCR 检测上清液HBV-DNA,放射免疫法检测细胞HBV表面抗原（HBsAg）、e抗原（HBeAg）、核心抗原（HBcAg）。结果：成功构建了含磁性纳米的siRNA质粒;多种方法检测均显示转染后的细胞HBV核心抗原表达明显下降;其表面抗原、e抗原和HBV-DNA值均较对照组降低。结论：RNA干扰联合纳米技术可明显下调HBV核心抗原的表达,抑制HBV-DNA复制。     

靶向X基因shRNA特异抑制HBV基因表达和复制

目的:研究针对HBV X基因小发夹RNA(shRNA)对HBV基因表达和复制的抑制作用。方法:利用分子克隆方法构建了4个HBV X基因特异性shRNA的表达质粒pshHBx1-4,与HBV复制性质粒共转染HepG2细胞,Northern和Southern印迹法检测HBV的mRNA和病毒复制中间体,化学发光微粒免疫分析方法检测细胞培养上清中的HBsAg和HBeAg,免疫荧光染色分析细胞HBcAg的表达水平。结果:共转染pshHBx1-4显著抑制HBV mRNA表达、降低细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的水平和细胞内HBcAg的表达水平、并有效抑制HBV的病毒复制中间体的合成。结论:HBV X基因特异性的shRNA可以有效抑制HBV的基因表达和病毒复制,有可能发展成为新的抗HBV制剂。     

APOBEC3G真核表达载体构建及抗HBV复制的初步研究

目的构建人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G（APOBEC3G）真核表达载体,并探讨其抗乙型肝炎病毒（HBV）复制的作用。方法采用RT-PCR法从健康人外周血单个核细胞中克隆APOBEC3G基因编码区片段,构建pcDNA3.1-A3G真核表达载体,利用脂质体转染法将pcDNA3.1-A3G转染HepG2.2.15细胞,分别于转染后第24、48、72 h收集细胞培养上清液和细胞总蛋白,Western blot检测HBx蛋白表达情况,ELISA法检测细胞上清液中HBsAg和HBeAg表达情况。结果测序结果显示pcDNA3.1-A3G真核表达载体中APOBEC3G编码区序列存在1处碱基同义突变;HepG2.2.15细胞经APOBEC3G蛋白干扰后,HBx、HBsAg和HBeAg表达量逐渐降低,于72h表达量显著降低。结论成功构建了APOBEC3G真核表达载体pcDNA3.1-A3G;APOBEC3G在体外可以抑制HBV复制,为深入研究APOBEC3G作为抗HBV药物提供了实验基础。     

表达A3C的HBV载体质粒抑制HBV的研究

目的 观察表达人类载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽3C(A3C)的复制缺损型HBV载体质粒抑制乙型肝炎病毒(HBV)的作用.方法 利用PCR技术和基因重组方法构建表达A3C和人绿色荧光蛋白(hrGFP)的FIBV载体质粒pcH-LJ3-A3C、pCH-LJ3-hrGFP.分别与野生型HBV质粒pCH-3093共转染HepG2细胞,提取细胞裂解液及细胞培养上清液中病毒颗粒DNA进行Southern blot检测;提取细胞裂解液中核心蛋白相关的HBV DNA,PCR扩增,克隆,测序.结果 pCH-LJ3-A3C对细胞浆及细胞培养上清液中病毒颗粒DNA具有抑制作用,使细胞浆内HBV DNA减少31%,使上清液中子代病毒颗粒HBV DNA减少40%;对HBV DNA具有编辑作用,50个克隆测定HBV DNA序列,36克隆出现G-A突变,G-A突变总数量982位点.结论 pCH-LJ3-A3C可以抑制HBV复制,pCH-LJ3-A3C对HBV DNA的编辑作用是其发挥作用的主要原因,pCH-LJ3-A3C可以作为一种新型的抗病毒制剂治疗HBV感染.

Abstract：

Objective To observe the inhibitory effect of a replication-defective hepatitis B virus (HBV) vector plasmid expressing A3C on HBV replication in vitro. Methods The HBV vector plasmisd pCH-LJ3-A3C and pCH-LJ3-hrGFP expressing A3C and hrGFP were constructed using PCR and gene recombination technique. The two recombinant plasmids were separately cotranfected into HepG2 cells along with the wild-type HBV plasmid pCH-3093. The HBV DNA in the cell cytoplasmic lysates and in the cell culture supernatant was extracted for Southern blotting, and the nucleocapsid-associated HBV DNA were amplified by PCR, cloned and sequenced. Results pCH-LJ3-A3C showed obvious inhibitory effect on HBV DNA in the cytoplasmic lysates and cell culture supernatant, causing a reduction of the HBV DNA by 31% and 40%, respectively. The pCH-LJ3-A3C plasmid was capable of editing the HBV DNA. Among the 50 sequenced clones, 36 clones had G-A mutations, with a total of 982 such mutations. Conclusion pCH-LJ3-A3C can inhibit the replication of HBV primarily by editing HBV DNA. The pCH-LJ3-A3C plasmid may serve as a new antiviral agent against human HBV infection.