蛋白磷酸酶1在D-半乳糖诱导老化小鼠耳蜗中的表达

目的 观察D-半乳糖诱导老化小鼠耳蜗中蛋白磷酸酶1(protein phosphatase 1,PP1)的定位表达及作用.方法 40只昆明小鼠随机分为对照组和D-半乳糖组,每组20只.D-半乳糖组颈背部皮下注射D-半乳糖(800mg·kg-1·d-1),对照组每日皮下注射等量生理盐水,连续给药8w;停药后检测血浆总超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)水平;免疫荧光法定位PP1在耳蜗的表达,re-al-time PCR法检测耳蜗中PP1 mRNA水平,Western blot法检测小鼠蛋白磷酸酶1核目标亚基(protein phos-phates 1 nuclear targeting subunit,PNUTS)、PP1及caspase-3的表达.结果 与对照组比较,D-半乳糖组小鼠总SOD活力降低而MDA水平升高(均为P<0.01);PP1主要定位表达于小鼠耳蜗毛细胞、螺旋神经节细胞及血管纹细胞的胞核和胞浆中,且给予D-半乳糖后,小鼠耳蜗中PP1 mRNA及其蛋白表达水平显著升高,而PNUTS表达减少,caspase-3表达增加(均为P<0.05).结论 PP1在D-半乳糖诱导老化小鼠耳蜗毛细胞、螺旋神经节及血管纹细胞中表达,且参与了其耳蜗老化过程.     

银杏内酯B调控E2f1/Cdk1抑制妥布霉素诱导的HEI-OC1细胞凋亡

目的 探究银杏内酯B对妥布霉素诱导的House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1)细胞凋亡的影响及其作用机制。方法 研究选用HEI-OC1小鼠耳蜗毛细胞,使用妥布霉素或妥布霉素联合银杏内酯B处理细胞,通过EdU实验检测对细胞增殖的影响,流式细胞术检测对细胞凋亡的影响,Western blot检测凋亡相关蛋白的表达及对E2f1/Cdk1通路的调节作用。结果 妥布霉素处理细胞后,HEI-OC1细胞增殖能力降低（P<0.001）,凋亡率升高（P<0.001）,细胞Bcl2表达降低,而Bax、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9表达升高（P<0.001）。妥布霉素联合银杏内酯B处理细胞后,E2f1和Cdk1蛋白的表达水平显著降低;银杏内酯B可降低妥布霉素对HEI-OC1细胞增殖、凋亡的影响（P<0.050）。结论 银杏内酯B通过调控E2f1/Cdk1通路抑制妥布霉素诱导的HEI-OC1内耳细胞凋亡。     

依达拉奉对抗化学性缺氧诱导的HEI-OC1听细胞内质网应激性凋亡

目的探讨依达拉奉(edaravone,EDA)能否保护HEI-OC1(House Ear Institute-organ of Corti 1)听细胞对抗氯化钴(CoCl2)诱导的内质网应激性凋亡。方法用CoCl2处理HEI-OC1听细胞,建立化学性缺氧损伤HEI-OC1听细胞的体外模型。EDA在CoCl2处理细胞前1h加入培养基中作为预处理。细胞计数试剂盒-8(cell count kit 8,CCK-8)比色法检测细胞存活率;试剂盒法检测细胞内丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的含量;Western blot法(蛋白印迹法)检测葡萄糖调节蛋白78(glucose regulating protein 78,GRP78;或称内质网应激蛋白)及裂解型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12(cleaved caspase-12,活化形式)的表达。结果 CoCl2在100～400μmol/L浓度范围内处理HEI-OC1听细胞24h,可浓度依赖性地降低细胞活力;300μmol/LCoCl2处理HEI-OC1听细胞,可以上调内质网应激蛋白GRP78的表达、增加细胞内MDA的含量及活化caspase-12。在300μmol/LCoCl2作用HEI-OC1听细胞前,用10～40μmol/LEDA预处理1h可以浓度依赖性地抑制CoCl2诱导的毒性损伤作用,40μmol/LEDA预处理1h可抑制CoCl2对GRP78表达的上调和对caspase-12的活化作用,以及CoCl2引起的MDA含量增加。结论 EDA可通过抗氧化及抗内质网应激引起的凋亡以保护HEI-OC1听细胞对抗CoCl2诱导的细胞损伤。     

七氟烷对甲状腺癌细胞AMPK-SIRT1-PGC-1α信号通路的调控作用研究CSCD

目的探究七氟烷对甲状腺癌细胞能量代谢信号通路AMPK-SIRT1-PGC-1α的调控作用。方法将人甲状腺癌细胞株(TPC-1)分为对照组、NC组、七氟烷组和七氟烷+AICAR组,MTT检测各组TPC-1细胞在24、48、72 h细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞存活、早期凋亡及晚期凋亡水平,q PCR检测细胞AMP依赖蛋白激酶(adenosine5’-monophosphate(AMP)-activated protein kinase,AMPK)、AMPK/AD-依赖性去乙酰化酶Sirtuin-1(NAD-dependent deacetylase sirtuin-1,SIRT1)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子(peroxisome proliferator-activated receptorgamma coactivator,PGC-1α)mRNA表达水平,Western blot检测细胞AMPK、SIRT1和PGC-1α蛋白表达水平。结果与对照组相比,七氟烷组细胞在24、48、72 h细胞增殖水平显著下降,分别为70.42±1.51、62.16±1.73、55.21±1.22,且有时间依赖效应,差异有统计学意义(P<0.01);七氟烷组细胞存活比例显著降低,早期凋亡和晚期凋亡比例显著增加,分别为(62.71±2.73)%、(16.21±0.22)%、(22.49±2.32)%,差异有统计学意义(P<0.01);q PCR和Western blot实验表明七氟烷组AMPK、SIRT1、PGC-1αmRNA和蛋白表达水平均显著降低,差异有统计学意义(P<0.01);NC组与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。与七氟烷组相比,七氟烷+AICAR组细胞在24、48、72 h细胞增殖显著升高,分别为86.11±1.33、78.28±1.41、62.24±1.24,差异有统计学意义(P<0.01);七氟烷+AICAR组细胞存活比例显著升高,早期凋亡和晚期凋亡比例显著降低,分别为(72.25±2.33)%、(12.21±1.01)%、(14.21±2.01)%,差异有统计学意义(P<0.01);q PCR和Western blot实验表明七氟烷+AICAR组AMPK、SIRT1、PGC-1αmRNA和蛋白表达水平均显著升高,差异有统计学意义(P<0.01)。结论七氟烷可以抑制甲状腺癌细胞的增殖,诱导细胞凋亡,此过程与抑制能量信号通路AMPK-SIRT1-PGC-1α的激活有关。     

Bax在D-半乳糖诱导的老化大鼠耳蜗中的作用

目的研究Bax介导的细胞凋亡在D-半乳糖诱导的老化大鼠耳蜗中的作用,探讨老年性耳聋外周听觉系统细胞凋亡的发生机制。方法 36只1月龄雄性Spragua-Dawley大鼠随机分成2组(各18只):1 D-半乳糖组:每日颈背部皮下注射D-半乳糖(500mg/kg),连续8周;2对照组:每日颈背部皮下注射同体积的生理盐水,连续8周。造模完成后,取两组大鼠耳蜗,利用实时定量PCR检测线粒体DNA(mitochondrial DNA,mt DNA)普遍缺失(common deletion,CD)的累积;利用western blot检测Bax蛋白的表达;利用免疫组织化学检测Cleaved caspase-3蛋白的表达;利用原位末端转移酶标记(terminal deoxynucleotidyl transferase(Td T)-mediated deoxyuridine triphosphate(d UTP)nick-endlabelling,TUNEL)染色检测大鼠耳蜗细胞凋亡发生的情况。所有实验数据采用两样本的t检验进行分析。结果和对照组的大鼠相比较,D-半乳糖诱导的老化大鼠mt DNA CD的累积在耳蜗组织中明显增多,差异有统计学意义(t值为6.631,P值<0.01);Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表达在耳蜗组织中明显增强,差异有统计学意义(t值分别为20.914、20.043,P值均<0.01)。对照组的大鼠耳蜗没有检测到凋亡细胞,而D-半乳糖诱导的老化大鼠耳蜗底回血管纹检测到少量凋亡细胞。结论 Bax介导的细胞凋亡参与了D-半乳糖诱导的耳蜗老化过程,可能是导致老年性耳聋外周听觉系统细胞凋亡发生的重要原因。     

微小RNA-548c-3p通过靶向调控PCNA基因表达对喉癌细胞增殖及凋亡影响的研究[论著]

目的　探讨微小RNA-548c-3p（miR-548c-3p）对喉癌细胞增殖及凋亡的影响及其作用机制。方法　用miR-548c-3p mimic、增殖细胞核抗原（PCNA）-siRNA及其阴性对照分别或同时转染喉癌TU686和M4e细胞,用qRT-PCR与Western blot法检测miR-548c-3p和PCNA的表达;MTT法和流式细胞术分别检测转染细胞的增殖和凋亡;双荧光素酶报告基因实验观察miR-548c-3p和PCNA的靶向关系。Western blot法检测PCNA、细胞周期蛋白1（CyclinD1）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白（Bax）的表达。结果　miR-548c-3p的表达量在癌旁组织（0.74±0.10）、喉癌组织（1.94±0.16）,TU686细胞（0.35±0.07）和M4e细胞（0.41±0.03）中均呈低表达,而PCNA mRNA和蛋白均呈高表达,差异有统计学意义（P 均＜0.05）。证实PCNA上存在miR-548c-3p的结合位点。上调miR-548c-3p可抑制细胞增殖及CyclinD1、Bcl-2的表达,并可促进细胞凋亡及Bax的表达,差异有统计学意义（P 均＜0.05）;上调miR-548c-3与抑制PCNA对细胞增殖及凋亡的作用相似。pcDNA-PCNA显著减弱miR-548c-3p mimic对细胞增殖和凋亡的作用。结论　miR-548c-3p通过抑制PCNA表达而降低喉癌细胞增殖能力并诱导细胞凋亡。     

miR-30-5p通过下调FOXG1表达抑制视网膜母细胞瘤细胞增殖

目的 探讨miR-30-5p对视网膜母细胞瘤细胞增殖的影响及作用机制。 方法 采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测miR-30-5p在视网膜母细胞瘤细胞系和人视网膜内皮细胞(HRECs)中的表达。利用TargetScan数据库进行生物信息学分析并预测miR-30-5p靶基因,双荧光素酶报告基因实验验证miR-30-5p与FOXG1的3'UTR结合能力及靶向关系,qRT-PCR和Western blotting分别检测miR-30-5p对FOXG1的mRNA与蛋白表达影响。瞬时转染Y79细胞后,通过CCK8法检测各组Y79细胞的增殖。 结果 与HRECs比较,miR-30-5p在视网膜母细胞瘤细胞中表达降低,FOXG1在视网膜母细胞瘤细胞中表达升高。生物信息学预测结果显示miR-30-5p与FOXG1存在结合位点,qRT-PCR和Western blotting显示miR-30-5p可负调控FOXG1的mRNA和蛋白的表达,双荧光素酶实验结果证实miR-30-5p与FOXG1 3'UTR存在靶向关系。瞬时转染miR-30-5p可升高Y79细胞中miR-30-5p的表达水平,抑制Y79细胞的增殖活力。过表达FOXG1可逆转miR-30-5p上调对Y79细胞增殖的影响。 结论 miR-30-5p通过下调FOXG1表达抑制视网膜母细胞瘤Y79细胞的增殖。     

长链非编码RNA核富集转录体1促进喉鳞状细胞癌细胞迁移和侵袭的机制研究

目的 探究长链非编码RNA(lncRNA)核富集转录体1(NEAT1)NEAT1对喉鳞状细胞癌(LSCC)细胞迁移和侵袭的影响,并进一步分析miR-429/锌指E-盒结合同源异形盒1(ZEB1)轴在其中发挥的作用。方法 慢病毒转染建立稳定敲减lncRNA NEAT1的LSCC细胞,通过RT-qPCR检测细胞lncRNA NEAT1表达以验证转染效率,通过Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力,通过Western blot检测细胞上皮-间充质转化(EMT)相关蛋白N-cadherin、Vimentin、Slug和Snail表达。通过生物信息学分析miR-429与lncRNA NEAT1和ZEB1 mRNA间的潜在结合位点,并通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-429与lncRNA NEAT1以及miR-429与ZEB1 mRNA结合。将miR-429抑制剂转染敲减lncRNA NEAT1的LSCC细胞,通过Western blot检测细胞ZEB1表达。进一步检查敲减ZEB1对抑制miR-429的敲减lncRNA NEAT1的LSCC细胞迁移、侵袭和EMT的影响。结果 敲减lncRNA NEAT1降低LSCC细胞lncRNA NEAT1表达,抑制细胞迁移和侵袭并下调细胞N-cadherin、Vimentin、Slug和Snail表达。miR-429与lncRNA NEAT1和ZEB1 mRNA间存在潜在结合位点,且miR-429与lncRNA NEAT1以及miR-429与ZEB1 mRNA结合。抑制miR-429逆转了敲减lncRNA NEAT1对LSCC细胞ZEB1表达的抑制作用。此外,敲减ZEB1逆转了抑制miR-429对敲减lncRNA NEAT1的LSCC细胞迁移和侵袭的促进作用及EMT相关蛋白N-cadherin、Vimentin、Slug和Snail表达的上调作用。结论 lncRNA NEAT1促进LSCC细胞迁移和侵袭,其机制可能与海绵化miR-429上调ZEB1表达促进LSCC细胞EMT有关。     

肌醇需求酶1对顺铂所致小鼠耳蜗毛细胞凋亡的作用研究

目的 研究肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme 1,IRE1)对顺铂所致小鼠耳蜗毛细胞凋亡的作用。方法 分离生后3～5 d的健康昆明小鼠(500只)耳蜗基底膜并进行体外培养,24 h后随机分为对照组和不同浓度顺铂组(4、8、16和32μg/ml)(每组200条),再培养24 h。应用异硫氰酸荧光素(FITC)染色观察小鼠耳蜗毛细胞的缺失;应用Hoechst 33258和四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)标记的鬼笔环肽双重荧光染色观察小鼠耳蜗毛细胞的凋亡;并用Western blot检测小鼠耳蜗中p-IRE1α、p-JNK、Bax及caspase-3的蛋白水平。结果 与对照组比较,顺铂组小鼠耳蜗毛细胞缺失、细胞凋亡率以及p-IRE1α、p-JNK、Bax、caspase-3等蛋白水平显著增高(P<0.01),并且p-IRE1α与Bax、caspase-3表达和细胞凋亡率呈正相关(P<0.05)。结论 IRE1可能参与调控顺铂所致小鼠耳蜗毛细胞凋亡。     

H2O2诱导类毛细胞HEI-OC1氧化应激损伤模型建立

目的 建立H₂O₂诱导HEI-OC1细胞凋亡模型,以噪声性聋小鼠耳蜗内氧化应激水平为依据,模拟病理状态毛细胞(hair cell)氧化应激损伤,为大规模抗氧化药物筛选建立体外氧化应激介导细胞损伤实验模型。方法 体外培养HEI-OC1细胞系,采用不同浓度H₂O₂处理不同时间构建氧化应激损伤细胞模型,进行细胞活性检测,并统计分析半抑制浓度(IC50);同时结合120dB白噪声处理4h后致聋小鼠耳蜗内氧化应激水平,共同确定体外细胞模型最适诱导条件。免疫荧光检测1 mM H₂O₂诱导12h下线粒体ROS及细胞凋亡过程中关键性半胱氨酸死亡蛋白酶Caspase 3激活情况;用Western blot检测各组细胞中Caspase 3、4-HNE、线粒体途径促凋亡蛋白信号分子Bax及凋亡抑制因子Bcl-2的表达情况。结果 不同浓度H₂O₂作用12h条件下,HEI-OC1细胞系随着H₂O₂     

LMP1诱导鼻咽癌细胞发生TRAIL抵抗的体外实验

 目的探讨EBV膜潜伏蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)基因过表达后对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF related apoptosis inducing ligand,TRAIL)凋亡诱导作用和凋亡信号传导的影响。方法利用脂质体介导的pGL6 LMP1上调LMP1低表达的TRAIL抵抗性鼻咽癌细胞CNE 1中LMP1的表达;通过MTT比色法、流式细胞术观察LMP1过表达后对CNE 1细胞TRAIL敏感性的影响;流式细胞术、Western blot、线粒体膜电位检测观察LMP1过表达后对死亡受体表达、细胞内外凋亡信号通路激活、线粒体膜电位改变的影响。结果死亡受体荧光标记后流式细胞术检测发现CNE 1和CNE 1 LMP1之间细胞膜蛋白死亡受体4（death receptor 4,DR4）,死亡受体5（death receptor,DR5）表达差异无统计学意义（P>0.05）。Western blot结果显示TRAIL(100 ng/ml)分别作用2、4、6、12 h后,CNE 1细胞中caspase 8 p43/p41,p18亚单位蛋白和caspase 3 p17,p10亚单位蛋白表达明显高于CNE 1 LMP1细胞,而Bcl 2相互作用域死亡激动蛋白的截短形式（truncated form of Bid,tBid）和caspase 9 p35亚单位蛋白表达无明显改变,且两个细胞株间也无明显区别。JC 1线粒体膜电位检测法结果显示TRAIL干预后,线粒体膜电位无明显改变,且两个细胞株间也无明显区别。结论LMP1过表达抑制TRAIL对鼻咽癌细胞的凋亡诱导作用和其细胞外凋亡信号的传导,提示LMP1是通过抑制细胞外信号通路激活诱导鼻咽癌细胞发生TRAIL抵抗。     

顺铂增加BCL-2蛋白高表达的鼻咽癌细胞凋亡

目的:通过对3种不同鼻咽癌细胞的BCL-2蛋白表达、细胞存活率和凋亡率的观察,探讨提高顺铂治疗鼻咽癌疗效的新方法。方法:采用Western blot技术检测3种不同鼻咽癌细胞CNE1、C666-1及SUNE1的BCL-2蛋白的表达情况;采用MTT法及流式细胞技术,检测并比较顺铂对3种鼻咽癌细胞的细胞存活率和凋亡率的影响。结果:BCL-2蛋白在CNE1及C666-1细胞上高表达,在SUNE1上几乎无表达(P<0.05);经顺铂干预后,CNE1及C666-1细胞的细胞凋亡率明显升高,存活率明显低于对照组(P<0.05);SUNE1细胞的细胞凋亡作用较弱(P<0.05)。结论:BCL-2蛋白在不同类型的鼻咽癌细胞上表达量不同,提示顺铂对BCL-2蛋白高表达的鼻咽癌细胞的杀伤作用更强。     

Hsa-miR-15a/16-1靶向抑制Bcl-2基因对鼻咽癌CNE-2细胞的抑制作用

目的观察Hsa-miR-15a/16-1靶向抑制B细胞淋巴瘤/白血病-2基因（B-cell lymphoma gene 2,Bcl-2gene）表达对鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）CNE-2细胞的生长抑制作用。方法将构建成功的重组质粒pENTR-CMV-EGFP-hsa-mir-15a/16-1经Lipofectamine 2000转染CNE-2细胞,RT-qPCR检测miR-15a/16-1、Bcl-2 mRNA表达水平,流式细胞术和WesternBlot检测Bcl-2、caspase-3蛋白表达水平,CCK-8法分析细胞生长抑制情况,4,6-二脒基-2-苯基吲哚（4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）染色观察细胞凋亡状况。结果转染后miR-15a表达增高（F=547.525,P均〈0.001）;miR-16-1表达增高（F=99.979,P均〈0.001）;Bcl-2 mRNA表达无明显差别（F=0.220,P〉0.05）;Bcl-2蛋白表达下调,caspase-3蛋白表达增高;细胞在体外凋亡明显;细胞增殖受到抑制,作用呈明显的时效关系。结论 Hsa-miR-15a/16-1对Bcl-2基因的靶向抑制,可体外对CNE-2细胞产生增殖抑制和促进凋亡作用。     

Beclin1对喉鳞癌细胞Hep-2紫杉醇敏感性影响的体外研究

目的:通过检测不同Beclin1表达水平对喉癌细胞紫杉醇敏感性的影响。方法:本研究利用以喉癌细胞株Hep-2、稳定转染pcDNA3.1-Beclin1质粒的喉癌细胞株Hep-2-Beclin1、稳定转染pcDNA3.1质粒载体的喉癌细胞株Hep-2-pcDNA3.1为研究对象,对3组细胞施加不同浓度的化疗药物紫杉醇(1、2、5、10、20μg/L)干预24h,利用MTT法及流式细胞术检测紫杉醇对3组细胞增殖和凋亡的影响。利用Western blot检测3组细胞Akt和p-Akt蛋白表达水平。结果:不同浓度的紫杉醇处理后的3组喉癌细胞与药物终浓度正相关地出现生长抑制率提高。当紫杉醇浓度大于5μg/L时,紫杉醇对Hep-2-Beclin1的生长抑制率高于对另两株细胞的生长抑制率。以终浓度为10、20μg/L的紫杉醇处理3株喉癌细胞24h后,流式细胞术检测结果显示:各组细胞20μg/L紫杉醇处理后细胞的凋亡率均高于10μg/L紫杉醇处理后细胞的凋亡率(P<0.05)。紫杉醇处理后Hep-2-Beclin1组细胞凋亡率均高于Hep-2组和Hep-2-pcDNA3.1组(P<0.05)。Western blot结果显示:Hep-2、Hep-2-pcDNA3.1、Hep-2-Beclin1细胞Akt相对蛋白表达量分别为:1.24±0.03、1.25±0.05、1.27±0.09,3组细胞间Akt相对蛋白表达量差异无统计学意义(P>0.05);Hep-2、Hep-2-pcDNA3.1、Hep-2-Beclin1细胞p-Akt即活化型Akt相对蛋白表达量分别为:0.98±0.09、1.03±0.04、0.54±0.03,Hep-2-Beclin1细胞p-Akt相对蛋白表达量低于Hep-2、Hep-2-pcDNA3.1组细胞(P<0.05)。结论:Beclin1可能通过抑制PI3K/Akt信号通路的活化上调喉癌细胞对紫杉醇的敏感性。     

miR-182-5p调控FHIT对喉鳞癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响

目的探讨miR-182-5p调控脆性组氨酸三联体(fragile histidine triad,FHIT)对喉鳞癌细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响及其作用机制。方法选取喉鳞癌组织和癌旁正常组织标本各39例,将anti-miR-NC、anti-miR-182-5p、miR-NC、miR-182-5p载体质粒分别转染至FD-LSC-1喉鳞癌细胞中,分别记为anti-miR-NC组、anti-miR-182-5p组、miR-NC组、miR-182-5p组;将anti-miR-182-5p质粒分别与si-NC、si-FHIT载体质粒共转染至FD-LSC-1细胞中,分别记为anti-miR-182-5p+si-NC组、anti-miR-182-5p+si-FHIT组;转染均采用脂质体法。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测喉癌组织、癌旁组织中的FHIT及miR-182-5p表达水平;蛋白质印迹(Western Blot)法检测FHIT、细胞周期素D1(CyclinD1)、p21、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、上皮钙黏蛋白(E-cadherin)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)的表达;四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞活性;流式细胞术检测细胞凋亡;Transwell检测细胞迁移和侵袭;双荧光素酶报告基因检测miR-182-5p和FHIT的靶向关系。结果与癌旁组织相比,喉鳞癌组织中miR-182-5p表达水平显著升高,FHIT表达水平显著降低。抑制miR-182-5p表达可降低细胞活性和迁移、侵袭数量,提高细胞凋亡率,降低CyclinD1、Bcl-2、MMP-2表达水平,提高p21、Bax、E-cadherin表达水平。miR-182-5p可靶向调控FHIT,抑制FHIT能逆转抑制miR-182-5p对喉鳞癌细胞FD-LSC-1增殖、迁移、侵袭的抑制和凋亡促进作用。结论抑制miR-182-5p表达可抑制喉鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡,其机制可能与FHIT表达相关。     

miR-129-5p靶向调节果蝇形态同系物2基因抑制喉鳞癌细胞增殖和诱导凋亡的体外研究

目的　探讨miR-129-5p对喉鳞癌细胞增殖、凋亡的调控机制。方法　运用实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time f luorescence quantification polymerase chain reaction,qRT-PCR）法检测人支气管上皮细胞HBE、喉鳞状细胞癌细胞HN4、TU177中miR-129-5p、DIAPH2的表达;将miR-NC组（转染miR-NC）、miR-129-5p组 （转染miR-129-5p mimics）、anti-miR-NC组（转染antimiR-NC）、anti-miR-129-5p组（转染anti-miR-129-5p）、si-NC组（转染si-NC）、si-DIAPH2（果蝇形态同系物2,Drosophila Homologue of Diaphanous2,DIAPH2）组（转染si-DIAPH2）、miR-129-5p+pc DNA组（共转染miR-129-5p和pc DNA）、miR-129-5p+pc DNA-DIAPH2组（共转染miR-129-5p和pc DNA-DIAPH2）,用脂质体法转染HN4、TU177细胞;Western blot检测细胞中DIAPH2、细胞周期蛋白依赖激酶1（cyclinD1）、剪切的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved-caspase-3）、剪切的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（cleaved-caspase-9）的蛋白表达;MTT法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;双荧光素酶报告基因检测实验检测细胞中miR-129-5p与DIAPH2的结合力。结果　与人支气管上皮HBE相比,喉鳞癌细胞HN4、TU177中miR-129-5p 表达均显著降低,DIAPH2表达显著升高（P <0.05）;过表达miR-129-5p、敲减DIAPH2均可显著抑制HN4、TU177细胞增殖、促进凋亡、下调cyclinD1、上调cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9;miR-129-5p可抑制野生型DIAPH2细胞的荧光活性,并负向调控DIAPH2的表达;过表达DIAPH2可逆转miR-129-5p对Hep-2细胞的增殖抑制和凋亡促进作用。结论　miR-129-5p可抑制喉鳞状细胞癌的增殖,促进凋亡,其机制可能与靶向DIAPH2相关,将可为miR-129-5p靶向治疗喉鳞状细胞癌提供新的依据。     

miR-204通过内质网应激抑制视网膜母细胞瘤生长作用及机制的研究

目的 探讨miR-204在视网膜母细胞瘤中的表达、对其生长的作用及其分子机制。 方法 通过RT-PCR检测miR204 在视网膜母细胞瘤(Y79)及正常视网膜细胞(ARPE-19)中的表达,并用miR-204 模拟物及抑制物转染Y79 细胞,CCK-8 及流式细胞仪检测Y79 细胞的生存率及凋亡情况, Western blot 法检测GRP78蛋白的表达。 结果 miR-204在视网膜母细胞瘤Y79细胞中呈现低表达,可显著抑制视网膜母细胞瘤的增殖,促进其凋亡,可上调 GRP78蛋白的表达,激活内质网应激途径。 结论 miR-204在视网膜母细胞瘤细胞中表达下调,miR-204可能通过激活内质网应激介导的调亡途径诱导视网膜母细胞瘤细胞发生凋亡。     

miR-218-5p靶向聚腺苷二磷酸核糖聚合酶9对喉鳞状细胞癌细胞增殖和凋亡影响

目的　探讨miR-218-5p对喉鳞状细胞癌（简称喉鳞癌）细胞的增殖和凋亡的影响及其作用机制。方法  实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和蛋白质印记（Western blot）检测人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞和正常喉上皮细胞NPEC中miR-218-5p和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶9（Poly ADP-Ribose polymerase 9,PARP9）的表达水平。构建过表达miR-218-5p或敲减PARP9的Hep-2细胞株,MTT法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡。双荧光素酶报告基因实验和Western blot验证miR-218-5p和PARP9的靶向 调控关系。结果　与NPEC细胞相比,Hep-2细胞中miR-218-5p的表达水平显著降低（t =19.540,P <0.05）,PARP9的表达水平显著升高（t =25.381,P <0.05）。与miR-con组比较,miR-218-5p组Hep-2细胞存活率显著降低（F =37.167,P <0.05）,凋亡率显著升高（F =670.506,P <0.05）。与si-con组比较,si-PARP9组Hep-2细胞存活显著降低（F =61.813,P <0.05）,凋亡率显著升高（F =650.225,P <0.05）。miR-218-5p靶向负性调控PARP9表达。与miR-218-5p+pcDNA-con组比较,miR-218-5p+pcDNA-PARP9组Hep-2细胞存活显著升高（F =44.216,P <0.05）,凋亡率显著降低（F =329.517,P <0.05）。结论　miR-218-5p通过靶向PARP9抑制喉鳞癌 细胞增殖,诱导细胞凋亡。     

瞬时受体电位锚蛋白1通道调节慢性鼻窦炎上皮细胞自噬及细胞间黏附分子表达的作用探究

目的　探究瞬时受体电位锚蛋白1（t ransient receptor potential ankyrin1,TRPA1）对慢性鼻窦炎（CRS）上皮细胞自噬与细胞间黏附分子（intercellular adhesion moleclar-1,ICAM-1）表达的影响。方法　通过免疫组织化学染色、实时荧光定量PCR及Western blot检测TRPA1在对照组、慢性鼻窦炎不伴鼻息肉（chronic nasal-sinusitis without nasal polyps,CRSsNP）及慢性鼻窦炎伴鼻息肉 （chronic rhinosinusitis with nasal polyps,CRSwNP）患者鼻黏膜组织中的表达水平,并采用免疫组织化学染色和Western blot观察各组患者鼻黏膜组织内自噬水平;分离培养鼻黏膜上皮细胞,利用细胞角蛋白AE1进行免疫荧光染色鉴定上皮细胞;将鼻黏膜上皮细胞随机分为对照组、脂多糖（LPS）组、LPS+TRPA1抑制剂组,实时荧光定量PCR和Western blot检测各组细胞TRPA1在mRNA和蛋白上的表达水平,以自噬双标腺病毒mRFP-GFP-LC3感染细胞并通过荧光显微镜观察各组细胞自噬情况,并使用透射电镜观测各组细胞自噬小体形成,实时荧光定量PCR和Western blot检测各组细胞ICAM-1在mRNA和蛋白上的表达水平。结果　相较于对照组,CRSsNP与CRSwNP患者鼻黏膜上TRPA1平均光密度值升高,其mRNA相对表达量和蛋白相对表达量均上调（P<0.05）,且LC3-II平均光密度值升高,LC3-II/LC3-I比值升高,Beclin-1蛋白相对表达量上调而p62蛋白相对表达量下调（P<0.05）,组织内自噬水平升 高。成功分离到生长密集、形状为梭形或多边形以及AE1呈阳性表达的鼻黏膜上皮细胞;与LPS组比较,经过LPS与TRPA1抑制剂共处理的鼻黏膜上皮细胞TRPA1 mRNA相对表达量与蛋白相对表达量均下调（P <0.05）,自噬溶酶体红色荧光减弱,自噬小体也明显减少,同时,ICAM-1mRNA相对表达量与蛋白相对表达量均下调（P<0.05）。结论  CRS中TRPA1表达异常增加,自噬水平也升高,靶向抑制TRPA1能够抑制CRS上皮细胞自噬以及ICAM-1表达的升高。