胰腺癌阿霉素耐药细胞株SW1990/ADM的建立及其耐药机理研究

目的　建立人胰腺癌阿霉素 (ADM )耐药细胞株SW 1990 /ADM ,探讨其耐药机理。方法　采用ADM体外浓度梯度倍增法诱导培养人胰腺癌细胞株SW 1990 10个月 ,获得耐药细胞株SW 1990 /ADM ,脱药培养 2个月后检测其生物学性状、药物敏感性及多药耐药基因mdr1的功能及表达情况。结果　与亲本细胞株SW 1990相比 ,SW1990 /ADM在形态学上发生了一系列变化 ;对包括ADM在内的多种化疗药物均表现出一定的耐药性 ,其对ADM、丝裂霉素、氟尿嘧啶和健择的耐药指数分别达到 4 9.6 0、7.2 5、3.80和 1.2 5 ;其mdr1mRNA的表达亦明显高于亲本细胞株SW 1990 (P<0 .0 1)。结论　体外浓度梯度倍增法可建立稳定传代的人胰腺癌耐药细胞株SW1990 /ADM。其耐药性与mdr1的表达呈正相关。     

Hedgehog信号通路相关蛋白在人胰腺癌SW1990耐药株中的表达及意义

目的:探讨Hedgehog信号通路蛋白在人胰腺癌吉西他滨耐药细胞株SW1990中的表达,为克服胰腺癌获得性耐药提供实验基础。方法:采用浓度梯度递增法建立人胰腺癌SW1990耐药株,采用噻唑蓝法测定SW1990亲代与耐药细胞IC50。实时荧光定量PCR检测亲代与耐药细胞mRNA中hedgehog信号通路成员Shh、SMO、Gli-1的表达差异。Western印迹法检测亲代与耐药细胞中上述蛋白质的表达。结果:人胰腺癌耐药株SW1990的IC50从亲代的(3.1±0.2)μmol/L提高到(232.2±12.3)μmol/L。荧光定量PCR结果显示耐药株中Shh、Gli-1的表达提高了(12.07±1.71)倍和(4.15±0.42)倍。亲代SW1990中未检测到SMO表达,而耐药细胞中却可以检测到SMO的表达。Western印迹结果同样显示,人胰腺癌SW1990耐药细胞株中高表达上述蛋白质。结论:人胰腺癌耐药株中高表达部分hedgehog信号通路蛋白。针对hedgehog信号通路的靶向治疗可能为克服胰腺癌耐药提供新的理论基础。     

耐药相关基因拓扑异构酶-Ⅱα在人胰腺癌细胞株中的表达

目的：探讨耐药相关基因拓扑异构酶－Ⅱα（TOPO－Ⅱα）在人胰腺癌细胞株中的表达。方法：通过逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）和Western-blot方法测定6株人胰腺癌细胞株（SW1990、Capan-2、AsPC-1、MiAPaCa-2、PANC－1、P3）中的TOPO－Ⅱα在基因和蛋白水平上的表达。结果：（1）TOPO－Ⅱα基因的表达以SW1990最高，PANC－1最低，与其他细胞株相比均具有显著性差异（P＜0．05）；（2）TOPO－Ⅱα蛋白的表达以SW1990、Capan-2较高，AsPC-1较低。SW1990，Capan-2与其余4株之间存在着显著性差异（P＜0．05），而SW1990与Capan-2之间无显著性差异（P＞0．05）；AsPC-1、MiAPaCa-2、PANC－1、P3之间均无显著性差异（P＞0．05）。结论：胰腺癌细胞对TOPO－Ⅱα抑制剂的低敏感性与TOPO－Ⅱα蛋白的低水平表达有关，TOPO－Ⅱα可能参与了胰腺癌对化疗的耐药。     

胰腺癌细胞对5-氟尿嘧啶和健择产生获得性耐药的分子生物学机制初探

目的　探索胰腺癌细胞对 5 氟尿嘧啶 ( 5 FU)和健择产生获得性耐药的机制 ,分析这种耐药与凋亡的调控基因———bcl 2家族之间的关系。方法　 5 FU和健择的细胞毒性作用通过磺酰罗丹明B蛋白染色法 (SRB)来检测 ,应用RNA酶保护分析法来检测化疗药物作用前后bcl 2家族mRNA表达水平。结果　 5 FU和健择对 3株胰腺癌细胞均产生了细胞毒性作用 ,5 FU长期作用后 ,Capan 1细胞 5 0 %抑制浓度 (IC50 )上升了 2 .1倍 (P <0 .0 5 )。健择长期作用后 ,Capan 1细胞IC50 上升了 1.8倍 (P <0 .0 5 )。RNA酶保护分析结果提示 ,bcl xL 和mcl 1上调的细胞产生了获得性耐药。结论　化疗药物长期作用后 ,抑凋亡基因bcl xL 和mcl 1上调 ,胰腺癌细胞产生了获得性耐药。阻断这些抑凋亡基因的表达可能提高胰腺癌细胞对 5 FU和健择的敏感性 ,从而产生治疗作用。     

人脑胶质瘤U251耐药细胞株的建立及耐药相关蛋白的筛选

我们通过模拟模拟临床给药方法。以阿霉素为诱导剂，建立理想的多药耐药细胞模型。并对已建立的耐药细胞株进行了多药耐药基因1（MDR-1）编码蛋白P-gp以及其它的耐药基因表达的蛋白如多药耐药蛋白耐药相关蛋白（MRP）、肺耐药蛋白（LRP）、谷光甘肽转移酶，π（GST-π）和DNA拓扑异构酶Ⅱ（TOPOⅡ）进行了定量研究，为阐明胶质瘤多药耐药机制并逆转耐药奠定基础。     

胰岛素促进胰腺癌细胞SW1990吸收钠离子机制的研究

目的为解释新发糖尿病合并胰腺癌预后差的现象,本研究拟探讨胰岛素影响胰腺癌细胞钠代谢的分子机制。方法在高糖DMEM中培养胰腺癌细胞SW1990,用不同浓度胰岛素刺激细胞,在不同时间检测培养上清中Na＋浓度,分析Na＋随胰岛素浓度和时间变化的规律。同时检测胰岛素对血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶1（SGK1）的影响,并分析其中的信号通路。结果胰岛素刺激SW1990细胞后,培养上清中Na＋浓度下降（P〈0.05）,SGK1蛋白表达量增加（P〈0.05）,且Na＋浓度的下降幅度与SGK1蛋白水平相关（r=0.715,P〈0.01）;胰岛素处理后乙酰化修饰关键基因CREBBP和EP300表达明显上调（P〈0.05）。结论胰岛素可促进胰腺癌细胞吸收钠离子,与SGK1基因的表达水平相关,其中乙酰化修饰可能发挥一定作用。     

丙戊酸钠对胰腺癌细胞株SW1990增殖和凋亡的影响及机制

目的 观察丙戊酸钠(VPA)对胰腺癌细胞株SW1990增殖、凋亡的影响,探讨丙戊酸钠诱导SW1990凋亡的机制.方法 应用1、2、3、4、5 mmol/L的丙戊酸钠干预SW1990细胞,以未干预的细胞作为对照组.采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖;取3 mmol/L丙戊酸钠干预SW1990细胞24、48、72 h,流式细胞仪检测细胞凋亡;实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)法检测SurvivinmRNA的表达.结果 丙戊酸钠对SW1990细胞有明显的生长抑制作用,呈现明显的浓度依赖性和时间依赖性,不同浓度组、不同时间组间生长抑制率差异有统计学意义(P＜0.05).3 mmol/L丙戊酸钠干预SW1990细胞不同时间的凋亡率分别为(15.79 ±2.18)％、(26.73±2.36)％、(38.74±1.83)％,与对照组早期凋亡率[(2.99±0.87)％]比较,不同时间比较差异有统计学意义(P＜0.05).未经丙戊酸钠干预的SW1990细胞高表达Survivin基因(5.152±1.835),在经3 mmol/L丙戊酸钠干预24、48、72 h后,Survivin基因的表达水平分别为3.977±1.531、2.639±1.017、1.034±0.239,随药物干预时间的延长Survivin基因的表达水平逐渐下降,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 丙戊酸钠可抑制胰腺癌细胞SW1990的增殖、诱导凋亡,其机制可能与激活线粒体内源性凋亡途径,下调Survivin基因有关.     

胰腺癌细胞对5氟脲嘧啶和健择的获得性耐药机制的研究

目的探讨胰腺癌细胞对 5氟脲嘧啶 (5 FU)和健择产生获得性耐药的机制。方法用磺酰罗丹明B蛋白染色法检测细胞毒性作用 ,根据药物剂量与细胞生存的关系计算 5 0 %抑制浓度(IC50 ) ;用RNA酶保护分析和Westernblot法来检测Bcl xL和mcl 1的表达水平。结果 5 FU和健择对 3株胰腺癌细胞均产生了细胞毒性作用。 5 FU长期作用后 ,Capan 1细胞IC50 上升了 2 1倍 (P <0 0 5 ) ;健择长期作用后 ,Capan 1细胞IC50 上升了 1 8倍 (P <0 0 5 ) ;而Mia Paca 2细胞在 5 FU和健择作用前后IC50 明显降低 (P <0 0 5 )。产生获得性耐药细胞的Bcl xL 和mcl 1的表达均上调。结论胰腺癌细胞对 5 FU相对耐药 ,而对健择较为敏感。化疗药物长期作用后 ,抑凋亡基因Bcl xL和mcl 1的表达上调 ,胰腺癌细胞产生了获得性耐药。     

多药耐药蛋白、P-糖蛋白及DNA拓扑异构酶Ⅱ与胰腺癌化疗耐药的相关影响因素分析

目的研究胰腺癌组织中多药耐药蛋白（MRP）、P-糖蛋白（P-gp）及DNA拓扑异构酶Ⅱ（TopoⅡ）三种多药耐药相关蛋白的表达及其化疗耐药相关影响因素的分析。方法收集51例病理证实的胰腺癌组织标本,以7例正常胰腺组织标本作对照,采用免疫组化技术检测MRP、P-gp及TopoⅡ三种蛋白在胰腺癌组织中的表达情况,并结合患者临床病理资料、生存情况进行分析。结果 P-gp、MRP在胰腺癌组织中的阳性表达率分别为70.6%、81.3%,与在正常胰腺组织中的阳性表达差异有统计学意义（P〈0.05）,TopoⅡ不同组织表达差异无统计学意义。在有淋巴结转移的患者中P-gp的表达具有更高的阳性率。TopoⅡ的阳性表达率与分化程度有关。胰腺癌组织中,P-gp与MRP表达相关;P-gp、MRP与TopoⅡ之间蛋白表达水平不具有相关性。MRP、P-gp及TopoⅡ共表达阳性者生存期明显短于阴性者。结论 MRP、P-gp及TopoⅡ在多药耐药现象中占有重要地位,同时也可作为判断胰腺癌患者预后的指标之一。     

胰腺癌多药耐药细胞株BxPC-3/ADM的建立及耐药机制的初步探讨

目的 构建胰腺癌多药耐药细胞株BxPC-3/ADM,通过动态监测诱导耐药过程,探讨其耐药的可能机制.方法 逐步增加阿霉素浓度对BxPC-3细胞进行诱导,在不同的阿霉素诱导浓度,MTT法检测细胞对多种化疗药物的耐药指数,RT-PCR和Western印迹法检测细胞MDR1和MRP mRNA和蛋白的表达.结果 成功构建多药耐药细胞株BxPC-3/ADM;在0.05 μg/ml至8 μg/ml阿霉素诱导浓度,细胞对5-Fu、MMC和Gem的耐药指数无明显增加;在16 μg/ml浓度3种化疗药物的耐药指数有较明显上升,同时伴有MDR1 mRNA表达的明显增加;至32 μg/ml 5-Fu和Gem的耐药指数未再有继续上升,而MMC的耐药指数则继续上升,同时MDR1 mRNA表达未再增加,而MRP mRNA表达则明显增加.Western印迹实验显示MDR1和MRP蛋白表达变化与mRNA表达变化趋势一致.结论 MDR1基因在诱导早期的耐药中起主导作用,在后期则和MRP基因协同发挥作用.     

丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶1与胰腺癌细胞获得性耐药的关系

目的 探讨丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸酶1（MKP-1）在介导胰腺癌耐药细胞株SWl990／Fu产生获得性耐药过程中的可能机制。方法 采用Northern印迹杂交和Western蛋白免疫印迹杂交方法,检测MKP-1在体外诱导建立的人胰腺癌耐药细胞株SWl990／Fu、亲本细胞株SWl990和胰腺癌细胞株MiaPaCa-2中的表达,分析MKP-1在SW1990／Fu产生获得性耐药前后的变化。结果 Northern印迹杂交结果显示,在SWl990／Fu、SWl990和MiaPaCa~细胞株中均检测到2400bp的MKP-1mRNA,MKP-1在SWl990／Fu的表达水平明显低于SWl990和MiaPaCa-2。在蛋白水平上,Western蛋白免疫印迹杂交结果也表明,与SWl990和MiaPaCa4相比,MKP-1蛋白在SWl990／Fu细胞中的表达水平明显降低。结论 MAPK家族的关键调节酶MKP-1可能参与SWl990／Fu获得性耐药的产生,推测细胞信号转导系统的改变可能是导致胰腺癌细胞产生获得性耐药的机制之一。     

吉西他滨耐药人胰腺癌细胞株的建立及其与肿瘤干细胞的相关性研究

目的 建立吉西他滨耐药人胰腺癌细胞株SW1990/GZ,并探讨SW1990/GZ和胰腺癌肿瘤干细胞的相关性.方法 应用间歇浓度梯度倍增法建立吉西他滨耐药人胰腺癌细胞株SW1990/GZ;倒置显微镜下观察细胞形态;MTT法计算耐药指数(RI);荧光定量PCR检测ABCB1、ABCC1及ABCG2基因的表达水平;裸鼠皮下种植瘤试验观察SW1990和SW1990/GZ的成瘤能力;流式细胞仪通过侧群细胞(SP)法和表面特异抗原标记法(CIM4+CD24+)检测肿瘤干细胞含量.结果 在形态学上,SW1990/GZ较SW1990发生明显改变;SW1990/GZ的耐药指数是亲代SW1990的77.2倍;与亲代SW1990相比,耐药株SW1990/GZ中ABCB1、ABCC1及ABCG2的表达水平明显增高(P<0.01),裸鼠皮下成瘤能力增强(P<0.01);耐药株SW1990/GZ中SP细胞比例为(11.0±1.0)%,亲代SW1990中SP细胞比例为(4.6±0.9)%,CD44+CD24+细胞在两者中的比例分别为(8.7±0.8)%和(1.1±0.4)%(P<0.01).结论 吉西他滨耐药胰腺癌细胞株SW1990/GZ能高效富集胰腺癌肿瘤干细胞,CD44与胰腺癌获得性耐药关系密切,可能为克服胰腺癌获得性耐药提供新的治疗靶点.     

吉西他滨耐药人胰腺癌细胞株的建立及其与肿瘤干细胞的相关性研究

Objectives To establish a gemcitabine-resistant pancreatic cancer cell line SW1990/ GZ,and to explore the relationship between drug-resistant cell line SW1990/GZ and pancreatic cancer stem cell. Methods Gemcitabine-resistant pancreatic cancer cell line SW1990/GZ was obtained by treating parental cell line SW1990 in vitro with increasing dosage of gemcitabine in culture medium intermittently for 24 weeks. Stable cultures were obtained which were 77. 2-fold increased in resistance relative to parental cells. Gene expressions of ABCB1/MDR1, ABCC1/MRP and ABCG2/BCRP were determined by real-time PCR. Tumorigenic potential was performed by nude mice xenograft transplant experiments. Side population analysis and CD24CD44 positive cells explore were determined by flow cytometry to examine cancer stem cell proportion. Results Gemcitabine-resistant cell line SW1990/GZ underwent obvious morphological and functional changes. Compared with the parental cell line,SW1990/GZ cell was small and turned into round shape. SW1990/GZ had a higher gene expression level of ABCB1/MDR1, ABCC1/MRP and ABCG2/BCRP than SW1990(P <0. 01). Nude mice xenograft transplant experiments showed that only 1 x 105 SW1990/GZ cells were sufficient for tumor formation, whereas an injection of 1 x 105 SW1990 cells did not initiate tumors. Flow cytometry analysis showed that SP proportion in SW1990/GZ was (11.0±1.0)%, whereas in parental SW1990 it was ( 4. 6 ± 0. 9 ) % , CD44CD24 positive cells was (8. 73±0. 81) % in SW1990/GZ, whereas (1.1±0. 4)% in SW1990. Conclusions Gemcitabine-resistant cell line SW1990/GZ has a higher proportion of pancreatic cancer stem cells compared to its parental cell line SW1990. CD44 is mainly responsible for acquired drug resistance,which can be a potential target to overcome acquired drug resistance in pancreatic cancer.     

吉西他滨耐药人胰腺癌细胞株的建立及其与肿瘤干细胞的相关性研究

Objectives To establish a gemcitabine-resistant pancreatic cancer cell line SW1990/ GZ,and to explore the relationship between drug-resistant cell line SW1990/GZ and pancreatic cancer stem cell. Methods Gemcitabine-resistant pancreatic cancer cell line SW1990/GZ was obtained by treating parental cell line SW1990 in vitro with increasing dosage of gemcitabine in culture medium intermittently for 24 weeks. Stable cultures were obtained which were 77. 2-fold increased in resistance relative to parental cells. Gene expressions of ABCB1/MDR1, ABCC1/MRP and ABCG2/BCRP were determined by real-time PCR. Tumorigenic potential was performed by nude mice xenograft transplant experiments. Side population analysis and CD24CD44 positive cells explore were determined by flow cytometry to examine cancer stem cell proportion. Results Gemcitabine-resistant cell line SW1990/GZ underwent obvious morphological and functional changes. Compared with the parental cell line,SW1990/GZ cell was small and turned into round shape. SW1990/GZ had a higher gene expression level of ABCB1/MDR1, ABCC1/MRP and ABCG2/BCRP than SW1990(P <0. 01). Nude mice xenograft transplant experiments showed that only 1 x 105 SW1990/GZ cells were sufficient for tumor formation, whereas an injection of 1 x 105 SW1990 cells did not initiate tumors. Flow cytometry analysis showed that SP proportion in SW1990/GZ was (11.0±1.0)%, whereas in parental SW1990 it was ( 4. 6 ± 0. 9 ) % , CD44CD24 positive cells was (8. 73±0. 81) % in SW1990/GZ, whereas (1.1±0. 4)% in SW1990. Conclusions Gemcitabine-resistant cell line SW1990/GZ has a higher proportion of pancreatic cancer stem cells compared to its parental cell line SW1990. CD44 is mainly responsible for acquired drug resistance,which can be a potential target to overcome acquired drug resistance in pancreatic cancer.     

人胆囊癌细胞系GBC-SD的多药耐药机制

目的 探讨人胆囊癌细胞系GBG-SD耐药性产生的机制,建立先天性耐药的人胆囊癌细胞模型。方法 用逆转录-聚合酶链反应(RT—PCR)检测GBC-SD细胞多药耐药相关蛋白(MDR1)、多药耐药相关蛋白(MRP)和肺耐药蛋白(LRP)基因扩增;免疫细胞化学染色检测该细胞系P-糖蛋白(P-gp)、MRP和LRP蛋白表达;流式细胞术测定P-gp、谷胱甘肽-S-转移酶(GST-π)和DNA拓扑异构酶Ⅱ(TOPOⅡ)表达水平;用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测该细胞对8种抗癌药物的敏感性。结果 人胆囊癌GBC-SD细胞中MDR1、MRP和L,RP基因呈阳性扩增,P-gp、MRP、LRP蛋白表达阳性;GST-π和TOPOⅡ的表达水平与对照组细胞差异无显著性。四唑盐比色结果显示,GBC-SD细胞对8种抗肿瘤药物均有程度不同的耐受性。耐药倍数从5．3倍到42倍不等。结论 人胆囊癌细胞系GBC-SD是一株先天性耐药的恶性肿瘤细胞系,其耐药性的产生与MDR1、MRP、LRP基因扩增有关。     

反义核酸对膀胱癌细胞系多药耐药性的逆转效应

目的 探讨多药耐药性逆转的新方法。方法 应用基因重组方法构建能转录出ｍｄｒ１ ｍＲＮＡ反义ＲＮＡ的逆转录病毒质粒,然后将该质粒导入膀胱癌耐药细胞系中,测定转染细胞对不同药物的耐药性,观察反义核酸对ＭＤＲ的逆转效应。结果 耐药细胞经导入反义核酸逆转录病毒质粒后,对阿霉素（ＡＤＭ）、秋水仙素（ＣＯＬ）的ＩＣ５０显著降低（Ｐ〈０．０１）;细胞膜上Ｐ－糖蛋白（Ｐ－ＧＰ）染色信号显著减弱。结论 反义核酸是逆     

MBD1甲基化调控胰腺癌BxPC-3细胞株mdr1转录及其表达的研究

目的 观察MBD1通过对mdr1转录区域结合位点甲基化影响,在转录水平间接调控胰腺癌mdr1基因表达.方法 应用RNA干扰技术对人胰腺癌细胞株BxPC-3中MBD1基因进行抑制;应用定量荧光聚合酶链式反应(FQ-PCR)技术、MSP(甲基化专用聚合酶链式反应)方法分别检测转染前后细胞株中的mdr1 mRNA的表达差异和转录区域结合位点甲基化变化.结果 成功构建并转染MBDI siRNAs至人原位胰腺腺癌细胞BxPC-3(BxPC-3)细胞中,证实MBDI mRNA水平明显下调(下调幅度为93.19%).MBD1下调后,mdr1 DNA转录区域(-110GC和-50GC)甲基化分别上调(上调幅度分别为181.98%和409.57%);mdr1 mRNA表达明显下调(下调幅度为97.79%).结论 MBD1可通过对mdr1转录区域结合位点甲基化的影响,在转录水平间接调控胰腺癌mdr1基因表达.     

阿霉素免疫毫微粒对肝癌细胞多药耐药的逆转

目的 探讨阿霉素免疫毫微粒对多药耐药(multidrug resistance,MDR)的逆转作用.方法 检测载阿霉素的免疫毫微粒对耐阿霉素人肝癌细胞株SMMC-7721/ADM的体外杀伤作用及与SMMC-7721/ADM的结合活性.结果 阿霉素免疫毫微粒具有比普通阿霉素毫微粒更强的体外逆转MDR的功能,与SMMC-7721/ADM紧密结合.结论 阿霉素免疫毫微粒有体外逆转MDR的功能,其原因可能是免疫毫微粒与肿瘤细胞紧密结合,所载药物释放后形成膜内外的药物浓度梯度差而使药物进入细胞内.     

耐药相关蛋白在肾癌中的表达

为探讨耐药相关蛋白（ＭＲＰ）在肾癌中表达的意义，应用免疫组化ＬＳＡＢ法检测２０例肾癌组织中ＭＲＰ表达。结果：ＭＲＰ阳性表达率为６０％，在胞浆和胞膜上均见表达，但以胞浆中（粗颗粒状）更显著。晚期肾癌（Ⅲ、Ⅳ期）阳性表达率为８９％，明显高于早期肾癌（Ⅰ、Ⅱ期）的３６％，Ｐ＜００５。结果认为ＭＲＰ与肾癌浸润转移相关，并可能是其内源性耐药的重要机制之一