新生鼠下丘脑结节乳头核组胺能神经细胞的原代培养

目的 探讨新生鼠下丘脑结节乳头核(TM)组胺能神经细胞的体外培养方法。方法 从新生鼠(24h内)下丘脑后部分离出TM神经细胞，采用含有B27的Neurobasal Medium培养液进行体外原代培养。应用免疫细胞化学染色对培养的细胞进行鉴定。结果 从新生鼠下丘脑中分离的TM神经细胞，在本实验条件下生长良好。原代培养7～9d的神经细胞在形态上趋向成熟。免疫细胞化学染色结果表明培养的神经细胞呈组胺免疫反应阳性。为组胺能神经细胞。结论 新生鼠下丘脑TM神经细胞可进行体外原代培养，它可作为研究中枢组胺神经系统的体外细胞模型。     

新生小牛血清对人胎脑海马组织神经干细胞分化的影响

目的 探讨新生小牛血清对人胎脑海马组织神经干细胞分化的影响。方法 采用细胞培养和免疫细胞组化技术,观察不同浓度新生小牛血清对人胎脑海马组织神经干细胞分化的影响。结果 新生小牛血清能诱导人神经干细胞分化为神经细胞及神经胶质细胞,在无血清培养基与含不同浓度新生小牛血清培养基中培养的神经干细胞分化为神经细胞和神经胶质细胞的数目在发生变化,并且随着新生小牛血清浓度的增加,神经干细胞分化为神经细胞的数量在减少,分化为神经胶质细胞的数量增加。结论 新生小牛血清影响人神经干细胞分化为神经细胞和神经胶质细胞的比例,并与新生小牛血清的浓度有一定的关系。     

吗啡长时程作用对新生鼠TM神经细胞cAMP和cGMP的影响以及青藤碱的干预作用

目的观察体外原代培养的新生鼠下丘脑结节乳头核(TM)神经细胞在吗啡长时程作用下胞内cAMP及cGMP水平的变化以及青藤碱对它的影响。方法采用原代培养7d的TM神经细胞,加入含100μmol/L吗啡的培养液培养48h,形成类吗啡依赖神经细胞,经100μmol/L纳洛酮戒断后,用EIA法测定细胞内cAMP和cGMP含量。不同剂量的组胺或青藤碱在纳洛酮戒断前30min作用于细胞,同时测定药物对正常TM细胞内cAMP和cGMP水平的影响。结果以100μmol/L吗啡作用于新生鼠TM细胞48h后,胞内cAMP及cGMP含量明显升高,经100μmol/L纳洛酮戒断后,胞内cAMP含量出现反弹性超高现象,而cGMP含量则明显下降,cAMP与cGMP比值明显增大。30、100μmol/L青藤碱及40μmol/L组胺对正常TM神经细胞的cAMP及cGMP含量无明显影响,300μmol/L青藤碱及80μmol/L组胺可使正常细胞内cAMP含量明显升高。三个剂量的青藤碱及40μmol/L组胺预先作用可明显降低吗啡依赖的TM细胞经纳洛酮戒断时的cAMP超高水平,同时明显升高cGMP水平,使细胞内增大的cAMP与cGMP比值减小。结论在吗啡(100μmol/L)长时程(48h)作用下,TM神经细胞内cAMP及cGMP水平发生了明显的变化,中枢组胺能神经系统可能参与了吗啡依赖的形成与戒断过程。青藤碱可显著降低吗啡依赖细胞戒断时的cAMP超高水平,同时升高cGMP水平,使两者比值趋于正常。     

大鼠海马神经干细胞的分离、培养及鉴定

目的 探寻出生后1~3d和成年大鼠海马分离、培养并鉴定神经干细胞(NSC)的可行性。方法 向培养基添加碱性成纤维细胞生长因子、脑源性神经营养因子及其他生长因子,采用单细胞克隆技术,分离出生后1~3d和成年SD大鼠海马组织并分别无血清培养;以免疫细胞化学方法对原代和传代培养形成的克隆细胞,以及其分化后的细胞进行鉴定。结果 上述条件下培养可形成悬浮生长的表达巢蛋白的神经球,且具有连续克隆的能力;分化后可得到具有网状联系的、分别呈神经元特异性烯醇化酶阳性和胶质纤维酸性蛋白阳性的神经元及胶质细胞。结论 新生及成年SD大鼠海马存在神经干细胞。     

成年大鼠纹状体神经干细胞的体外培养及分化

目的 探讨成年大鼠纹状体神经干细胞多向分化的可能性。方法 分离成年大鼠纹状体神经干细胞,单克隆连续传代培养并诱导分化,将分化产物进行免疫细胞化学染色及RT-PCR检测分析。结果 无血清单克隆培养时期可见大量的细胞团出现,以血清诱导分化后出现多种细胞类型,免疫细胞染色发现分化细胞中有Nestin阳性、NSE阳性、GFAP阳性细胞,RT-PCR法分析mRNA水平有脑因子-1、γ-氨基丁酸α-受体γ-亚单位、酪氨酸羟化酶及色氨酸羟化酶等基因的表达。结论 成年大鼠纹状体内分离出的干细胞样细胞具有自我增殖和多向分化潜能。     

吗啡长时程作用对新生鼠TM神经细胞cAMP和cGMP的影响以及青藤碱的干预作用

目的观察体外原代培养的新生鼠下丘脑结节乳头核（TM）神经细胞在吗啡长时程作用下胞内cAMP及cGMP水平的变化以及青藤碱对它的影响。方法采用原代培养7d的TM神经细胞，加入含100μmol／L吗啡的培养液培养48h，形成类吗啡依赖神经细胞，经100μmol／L纳洛酮戒断后，用EIA法测定细胞内cAMP和cGMP含量。不同剂量的组胺或青藤碱存纳洛戒成断前30min作用于细胞，同时测定药物对正常TM细胞内cAMP和cGMP水平的影响。结果以100μmol／L吗啡作用于新生鼠TM细胞48h后，胞内cAMP及cGMP含量明显升高，经100μmol／L纳洛酮戒断后．胞内cAMP含量出现反弹性超高现象，而cGMP含量则明显下降，cAMP与cGMP比值明显增大。30、100μmol／L青藤碱及40μmol／L组胺对正常TM神经细胞的cAMP及cGMP含量无明显影响，300μmol／L青藤碱及80μmol/L组胺可使正常细胞内cAMP含量明显升高。三个剂量的青藤碱及40μmol／L组胺预先作用可明显降低吗啡依赖的TM细胞经纳洛酮戒断时的cAMP超高水平，同时明显升高cGMP水平，使细胞内增大的cAMP与cGMP比值减小。结论在吗啡（100μmol／L）长时程（48h）作用下，TM神经细胞内cAMP及cGMP水平发生了明显的变化，中枢组胺能神经系统可能参与了吗啡依赖的形成与戒断过程，青藤碱可显著降低吗啡依赖细胞戒断时的cAMP超高水平，同时升高cGMP水平，使两者比值趋于正常。     

原代海马神经细胞体外培养的纯化与鉴定

目的 建立原代海马神经细胞体外培养纯化及鉴定的优选方法.方法 取新生Wistar乳鼠,分离海马后在体外采用含血清结合无血清法进行培养,并用NSE、GAP-43、MAP2等海马神经细胞特异抗体经免疫细胞化学方法鉴定细胞性质及纯度.结果 接种24 h后细胞全部贴壁,并长出突起,随时间增加,突起延长并交错形成网络,至第7～8天神经元形态最为成熟饱满,随后逐渐出现细胞老化,神经元最长可生存4周.经鉴定,海马神经元纯度达96%以上.结论 体外采用含血清和无血清法相结合进行原代海马神经细胞培养,细胞纯度高,杂细胞少,可为神经疾病体外研究提供必要细胞基础.     

神经膜细胞与人发角蛋白复合培养构建人工神经桥接体的实验研究

目的 探索神经膜(旧称许旺细胞)与人发角蛋白复合培养构建人工神经桥接体。方法 用10μmol/mlBrdU标记体外培养纯化的许旺细胞与ECM凝胶修饰的人发角蛋白进行三维方向的共培养而构建成人工神经桥接体,移植入SD大鼠坐骨神经缺损处、皮下、骨骼肌中。S-100蛋白免疫组化染色鉴定许旺细胞,倒置显微镜和扫描电镜下观察许旺细胞与人发角蛋白的共培养,石蜡切片抗BrdU免疫组化染色观察体外培养纯化的许旺细胞在体内的生长情况。结果 体外培养的许旺细胞能黏附于人发角蛋白上进行良好的生长,移植入神经缺损处4周后,坐骨神经缺损处、皮下、骨骼肌中的桥接体内的人发角蛋白开始降解,黏附于该人发角蛋白上的许旺细胞均见成活并分裂增殖。结论 许旺细胞可与人发角蛋白进行三维培养,构建成人工神经桥接体,填补神经缺损。     

体外培养的人牙囊细胞矿化相关标志物的表达

目的 体外培养人牙囊细胞,探讨牙囊细胞是否具成骨、成牙骨质细胞表型特征,是否可作为牙骨质再生的种子细胞。方法 酶消化联合组织块法获得人牙囊细胞,免疫酶细胞化学染色技术检测其Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、骨桥蛋白、骨粘连蛋白的表达,RT-PCR技术检测细胞的骨涎蛋白、骨钙素、碱性磷酸酶的表达。矿化诱导并连续培养牙囊细胞,行Von kossa染色检测体外矿化形成情况。结果 免疫组化结果:牙囊细胞中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、骨桥蛋白、骨粘连蛋白呈不同程度的阳性表达;RT-PCR结果显示骨涎蛋白、骨钙素、碱性磷酸酶表达。经矿化诱导后的牙囊细胞在20d时可形成矿化结节,von Kossa染色阳性。结论 牙囊细胞具有成骨细胞、成牙骨质细胞的部分特性,体外培养的人牙囊细胞具有分泌合成矿化组织的能力,可试将其作为牙周组织再生的种子细胞。     

脊髓神经细胞的培养及鉴定

目的:探索体外培养原代脊髓神经细胞的方法,为研究脊髓损伤及修复的分子机制、药物作用机制提供前提条件。方法:将妊娠15 d的孕鼠处死后取出胎鼠脊髓,分离出神经细胞作为原代细胞进行培养,观察神经元细胞形态学特征,并采用DAPI和NSE双重染色对所培养细胞进行鉴定。结果:胎鼠脊髓神经细胞在体外培养生长好,纯度高,经免疫荧光鉴定,所培养细胞荧光染色符合神经细胞特点。结论:采用该实验方法进行脊髓神经细胞培养方法简便,纯度高,能满足各种神经科学研究的需要。     

大鼠皮层神经元原代培养及毒胡萝卜素干预后的表现

目的探讨离体大鼠皮层神经元原代培养方法及毒胡萝卜素诱导大鼠皮层神经元内质网应激的作用特点。方法体外培养SD乳鼠皮层神经元细胞,免疫组织化学、免疫荧光染色鉴定神经元纯度,Hoechst33258单染法观察凋亡细胞核的形态变化及测出细胞凋亡率,透射电子显微镜观察神经元的亚细胞结构。结果 SD乳鼠皮层神经元可纯化体外培养,对培养7d后的神经元进行NSE免疫荧光染色显示计数NSE阳性细胞数占细胞总数的百分数为（95±3）%,在TG浓度为2μmol/L作用时间为24h时离体培养原代神经元细胞凋亡率最高为19%±0.54%,P〈0.05。神经元细胞在2μmol/LTG作用24h后神经元呈现典型凋亡形态学改变,核周内质网,线粒体结构模糊不清,包膜破损,且出现染色质浓集、核固缩、细胞皱缩、核碎裂。结论体外改良的培养方法可以获得较高纯度的神经元,在毒胡萝卜素诱导的神经元内质网应激时,线粒体改变引起的变化可能是下游事件。     

大鼠脊髓神经元的分离、培养与鉴定

目的通过对新生大鼠脊髓神经元分离、培养过程中细节的探讨,建立一种高效、稳定的大鼠脊髓神经元培养方法,为研究脊髓损伤相关的病理生理及其治疗提供种子细胞。方法取新生SD大鼠的脊髓组织,通过木瓜酶消化制成单细胞悬液,经差速贴壁后种于12孔细胞培养板内,用无血清培养基培养,倒置显微镜观察细胞生长状态,免疫细胞化学对神经元β-ⅢTubulin行特异性荧光素染色,结合DAPI核染色鉴定神经细胞及其含量。结果该方法培养的脊髓神经元生长状态良好、密度适中,纯度较高,约83%。结论采用木瓜酶消化、差速贴壁及无血清培养的新生大鼠脊髓神经元符合体外实验的要求,为进一步进行相关实验提供目的细胞。     

新生大鼠前扣带皮层神经元的原代培养

目的建立新生大鼠前扣带皮层(ACC)神经元的体外培养方法,并进行纯度和生长状态检测。方法从新生鼠ACC分离出神经元,采用低浓度胰酶长时间消化、阿糖胞苷处理、差速培养等方法进行体外原代培养。在培养的第7天,应用兔抗大鼠微管相关蛋白2(MAP2)对培养的神经元进行纯度鉴定,利用微量滴定(MTT)法测定培养第7~12天ACC神经元的生长状态。结果从新生大鼠ACC分离的神经元,培养至第5天,可见多数细胞长出2个以上突起且呈多极形态并交织成网;第7天神经元有多种形式的接触,互相迁移靠拢,部分神经元聚集成团。MAP2细胞免疫荧光染色结果表明,ACC神经元阳性率大于80%,MTT结果显示,培养第7~9天的ACC神经元可保持较好的生长状态,之后细胞活性降低。结论新生大鼠ACC神经元可进行体外原代培养,纯度和活力检测表明,培养第7~9天的神经元可作为ACC神经元相关研究的体外细胞模型。     

新生大鼠神经干细胞的分离、培养和鉴定

目的获得新生大鼠神经干细胞,为深入研究其增殖分化奠定基础。方法从新生24小时内大鼠端脑及中脑部位分离NSC,采用体外无血清悬浮培养,以获得能在体外长期生存的NSC;通过单细胞克隆实验检测其自我更新能力,免疫细胞化学检测NSC标志物nestin表达及分化为神经元和胶质细胞的能力;用细胞计数法研究其生长特点并绘制生长曲线。结果获得的NSC能在体外长期生存,具有很强的增殖能力、自我更新能力,能分化为神经元和胶质细胞,具有多向分化能力,表达nestin,体外传代至10代细胞数量扩增了40倍。结论成功地从新生大鼠端脑和中脑中分离得到了能在体外长期培养的NSC。     

L-精氨酸对大鼠尾核一氧化氮合酶基因表达的影响

目的 研究尾核中一氧化氮在痛觉调制中的作用机制.方法 大鼠尾核内微量注射L-精氨酸、Nω-硝基-L-精氨酸甲酯、生理盐水,应用逆转录-聚合酶链反应测定4,8,12,24和48 h大鼠尾核nNOS mRNA表达的变化;新生Wistar大鼠尾核神经元原代培养液中加入L-精氨酸、Nω-硝基-L-精氨酸甲酯、生理盐水,观察给药12 h尾核nNOS mRNA表达的变化.结果 大鼠尾核给药24 h内L-精氨酸组nNOS mRNA表达较正常增强(P＜0.05),而Nω-硝基-L-精氨酸甲酯组nNOS mRNA表达较正常减弱(P＜0.05),48 h恢复正常.体外尾核原代神经元培养,nNOS mRNA表达的变化趋势和在体实验相一致.结论 中枢神经系统尤其是尾核中NOS活性是一氧化氮作为神经递质或调质参与中枢痛觉调制的关键因素之一.     

胎鼠前角运动神经元的取材与培养研究

目的 探讨脊髓前角运动神经元的取材时间、方法和体外培养.方法 取胎龄为14～18 d的SD大鼠胚胎及新生鼠脊髓腹侧半,分别采用DMEM/F12和Neurobasal-A培养基进行培养,观察前角运动神经元的生长状态.结果 胎龄15～16 d的胎鼠易取材,联合Neurobasal-A + 2% B27培养基培养的前角运动神经元细胞状态好、纯度高.结论 采用胎龄15～16 d的胎鼠脊髓腹侧半,联合Neurobasal-A+2%B27培养基培养细胞能获得高纯度的前角运动神经元,为研究运动神经元疾病打下实验基础.     

体外培养新生大鼠海马神经元的图象分析

目的：研究体外培养海马神经元不同时期的形态学变化。方法：用图象分析方法，研究体外培养的新生Wistar大鼠海马神经元在不同时间的形态、细胞数密度、面数密度、长度密度以及分支数密度的发育性变化情况。结果：体外培养的海马神经元呈梭形、锥体形、多角形多形性生长。随着培养时间的延长，细胞数密度和面数密度保持不变，突起长度密度和分支密度逐渐增加，突起上膨体样结构数密度增加。结论：体外培养的新生大鼠海马神经元在离体1-14d，随着培养时间的延长，细胞突起、分支数目以及膨体样结构逐渐增多，细胞间连接增加，呈现形态和功能成熟过程。     

食欲肽及其对睡眠-觉醒的调节

食欲肽是一种神经肽,在下丘脑分布有大量的食欲肽A和食欲肽B神经元.食欲肽受体有2种亚型OX1R和OX2R,OX2R是2种食欲肽的非选择性受体,OX1R仅对食欲肽A有选择性.食欲肽神经元在人脑的分布与鼠类似.食欲肽除调控摄食行为外,对睡眠与觉醒有重要的调控作用.在调节睡眠-觉醒的相关区域,存在大量的食欲肽受体OX1R和OX2R与高表达的OX1R和OX2R的前体mRNA.食欲肽还与调控觉醒和快波睡眠的神经位点LC、乳结节神经核(TMN)、DR与基底前脑(BF)有复杂的联系,这些区域的食欲肽神经元在觉醒与快波睡眠状态时都异常活跃.食欲肽增多可促进睡眠,食欲肽缺失能诱发发作性睡病.损毁下丘脑某些区域以致食欲肽神经元胞体减少,则可引起睡眠-觉醒功能障碍(如原发发作性睡病等).