检测层粘连蛋白夹心ELISA的建立

血清层粘连蛋白(LN)的水平与肝纤维化的程度密切相关,采用两株抗LN的单克隆抗体(mAb)建立了检测血清LN水平的双mAb夹心ELISA法.     

双抗夹心ELISA方法检测人布鲁氏菌抗原的研究及初步应用

目的建立一种高特异性、敏感性的ELISA方法检测人布鲁氏菌抗原。方法应用研制的针对羊布鲁氏菌O链M抗原的单克隆抗体2D10和牛布鲁氏菌O链A抗原的单克隆抗体488建立了用于检测人布鲁氏菌抗原的双抗夹心ELISA方法。结果经检验该方法不与大肠杆菌O157、小肠结肠炎耶尔森氏菌09A鼠伤寒沙门氏菌发生交叉反应,具有较好的重复性,对阳性样品的检测ELISA与SAT、分离培养的符合率均为100％。结论建立了高特异性、敏感性的检测人布鲁氏菌抗原的ELISA方法。     

卵清蛋白多克隆抗体的制备及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立

目的 建立卵清蛋白(ovalbumin,OVA)双抗体夹心ELISA检测方法并进行验证,用于定量检测鸡胚流感疫苗中的OVA含量。方法 建立双抗体夹心酶联免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA),对该方法的反应条件进行优化,确定定量范围及检测下限,并对重复性、特异性和准确度进行验证。结果 建立的方法最适包被抗体和酶标抗体浓度分别为2.5μg/ml和0.5μg/ml,最适封闭液配方为1%BSA+1%蔗糖。该方法的cut-off值为0.134,线性范围为0.313-20.000ng/ml,定量下限为0.078ng/ml。重复性好,板内变异系数为3.428%~25.953%,板间变异系数为5.375%~ 27.614%。特异性好,准确度高,检测结果与试剂盒检测结果符合率为91.43%~102.96%。稳定性好,预包被的酶标板冻存于-20℃,半年内检测样本变异系数为1.976%~14.409%。结论 建立了快速、简便、低成本的OVA定量检测方法,可用于鸡胚流感疫苗中OVA定量检测。     

双抗体夹心ELISA检测肺炎支原体抗原方法的建立及临床应用

目的　建立检测肺炎支原体抗原的双抗体夹心ELISA ,探讨其临床应用的可行性。方法　采用不同株Mp单抗 ,用双抗体夹心ELISA法检测Mp抗原 ,优化该方法检测Mp抗原的最佳实验条件。对Mp标准株及 14 7份临床标本进行测定 ,观察双抗体夹心ELISA方法的敏感度和特异度 ,以及该方法与聚合酶链反应 (PCR)检测法的符合率。结果　包被单抗量为 2 0 μg·ml-1,酶标记单抗 1∶2 0 0稀释时 ,阳性对照与阴性对照吸光度之比 (P/N值 )最大 ;检测Mp抗原敏感度达 2 μg·ml-1,和其它支原体没有交叉反应。 14 7份临床标本PCR检测阳性率为 13 .6% (2 0 /14 7) ;双抗体夹心ELISA法检测阳性率为 12 .2 % (18/14 7) ,两者符合率达 95 .9%。结论　建立的双抗体夹心ELISA法检测Mp抗原具有快速、简便、灵敏度高、特异性强等优点。     

定量检测ProMBP双抗体夹心ELISA方法的建立

目的:建立定量检测ProMBP的双抗体夹心ELISA方法.方法:采用Protein A亲和层析法纯化自制的抗ProMBP单克隆抗体(mAb),并行SDS-PAGE和Western blot对纯化抗体特性进行鉴定;利用简易过碘酸钠法对抗ProMBP mAb进行标记辣根过氧化物(HRP)后行抗体配对实验;通过方阵滴定法确定包被抗体和酶标抗体的最适工作浓度;以纯化的妊娠相关血浆蛋白A(PAPP-A)/ProMBP抗原为标准品建立标准曲线;以重复性、灵敏性和回收性实验评价ELISA方法,初步对人血清中的ProMBP水平进行检测.结果:最佳配对组合为抗ProMBP mAb 4C6E5B9和HRP标记的抗ProMBP mAb 9G4A6G10,最适工作浓度分别为2.5 μg/ml和1:3 000,该方法的批内、批间变异系数分别为4.6%～6.2%和4.6%～10.5%,灵敏度达2.0 ng/ml,回收率为92%～113%.正常非妊娠血清、9～11周妊娠血清、15～17周妊娠血清ProMBP水平分别为(26.37±2.90)ng/ml、(357.71±33.60)ng/ml和(1088.77±58.13)ng/ml.结论:建立了一种可用于检测ProMBP的双抗体夹心ELISA方法.     

建立ELISA夹心法检测霍乱毒素抗体的研究

用霍乱毒素Ｂ亚单位（ＣＴ－Ｂ）直接标记过氧化物酶，通过ＥＬＩＳＡ夹心法检测抗ＣＴ。该法与间接法通过测定巳知ＣＴ抗体的滴度进行比较时，间接法比夹心法高０．０５ＯＤ值，检查正常人血清时，夹心法比间接法阳性率及滴度低。取ＣＴ阳性血清各３２份，经三次重复实验结果完全一致，说明重复性较好。夹心法检测霍乱毒素抗体，具有较好的特异性和重复性，结果可靠，操作简便，可用于大规模的流行病调查及疫苗的考核。     

双抗体夹心ELISA定量检测血清Cap43蛋白方法的建立与评价

目的建立定量检测血清Cap43蛋白表达双抗体夹心ELISA法。并初步探讨血清Cap43蛋白表达水平在肺癌患者与正常人群间有无差异，以及该蛋白表达水平的高低与肺癌组织学分型间的关系。方法建立双抗体夹心ELISA方法对肺癌患者与正常人群血清中Cap43蛋白的含量进行定量检测。结果双抗夹心ELISA包被Ⅰ抗羊抗人NDRGl多克隆抗体（PcAb）、Ⅰ抗兔抗人Cap43PcAb以及辣根酶（HRP）标记的羊抗兔Ⅱ抗的最佳工作浓度分别为1：750，1：1200，1：350，标准蛋白曲线的回归方程为：y=0．53566＋0．00046x，R2=0．9939，P〈0．0001。应用该方法初步检测结果显示：肺癌组血清标本Cap43蛋白含量明显高于正常对照组（P〈0．01），且肺腺癌组病人血清Cap43含量高于肺鳞癌组（P〈0．01）。该方法的敏感度（SE）为84．51％，特异度（SP）为35．00％。结论建立了一种敏感度高，重复性好的定量检测血清中Cap43蛋白的双抗体夹心ELISA方法；Cap43蛋白在肺癌患者血清中呈现高表达，且在肺腺癌组病人血清中表达水平高于肺鳞癌组。     

建立ELISA夹心法检测霍乱毒素抗体的研究

用霍乱毒素Ｂ亚单位直接标记过氧化物酶，通过ＥＬＩＳＡ夹心法检测抗ＣＴ。该法与间接法通过测定已知ＣＴ抗体的滴度进行比较时，间接法比夹心法高０．０５ＯＤ值。检查正常人血清时，夹心法比间接法阳性率及滴度低。取ＣＴ阳性血清各３２份，经三次重复实验结果完全一致，说明重复性较好。     

ELISA双抗夹心法间接法检测血清抗—HIV结果比较

目的 通过ELISA双抗夹心法和间接法检测血清抗-HIV，选择临床检测抗-HIV实验方法。方法 用两种实验方法对阴性和阳性标本进行对照。并用蛋白印迹法确证。结果 ELISA双抗夹心法检测抗-HIV是大量标本初筛实验时的首选方法。     

氧氟沙星ELISA检测方法的建立

目的:建立氧氟沙星(OFL)的ELISA快速检测方法。方法:在制备抗OFL单克隆抗体基础上,采用间接竞争酶联免疫吸附方法(ciELISA)检测OFL的含量。结果:筛选得到特异性分泌抗OFL的单克隆抗体细胞株3G3和3D9,应用3G3所制备腹水建立的ciELISA工作曲线的线性范围为0.5-128 ng/mL(r2=0.985 8),最低检出浓度为0.5 ng/mL,半数抑制浓度IC50为7.0 ng/mL,样品加样回收率为84%~120%,批内变异系数和批间变异系数均小于15%。结论:本文建立的氧氟沙星ELISA检测法可满足OFL残留检测的需要。     

双抗体夹心ELISA定量检测IL-2-HSA融合蛋白

以抗人IL-2多克隆抗体为包被抗体,以IL-2-HSA融合蛋白为夹心抗原,以辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗HSA单克隆抗体为检测抗体,建立了一种定量测定完整的IL-2-HSA融合蛋白的双抗体夹心ELISA方法。包被抗体和检测抗体的最佳工作浓度分别为为2 μg/mL和0.5 μg/mL,方法的线性检测范围39.06~1250 ng/mL,标准曲线回归方程为y=0.442 9 x-1.143 3,r=0.996 6,灵敏度可达10.25 ng/mL,批内、批间变异系数分别为6.40%和7.81%,发酵上清液中回收率为98.13%~102.94 %,与IL-2、HSA基本无交叉反应,健全性分析表明发酵液及小鼠血清组分及稀释倍数对该方法无影响。该方法可用于该融合蛋白的发酵过程优化、分离纯化工艺、后期药动学、临床研究等的定量检测。     

检测DR5双抗体夹心 ELISA方法的建立及应用

目的:建立检测DR5双抗体夹心ELISA方法,通过检测慢性乙型肝炎患者血清可溶性DR5水平,探讨其在肝炎发病机理中的作用。方法:采用本室制备的鼠抗DR5的单抗YM366ED作为包被抗体,鼠抗DR5的单抗YM366EC标记HRP,建立检测sDR5的ELISA,并测定52例慢性乙型肝炎和30例正常人血清sDR5浓度。结果:建立了检测人sDR5的夹心ELISA法,方法的变异系数小于5%,回收率85%以上。慢性乙型肝炎患者血清sDR5浓度明显高于正常对照组。结论:成功地建立了一种可用于检测血清sDR5的双抗体夹心ELISA,为判定某些相关疾病患者的病情、疗效及预后提供有用的工具。血中sDR5在慢性乙型肝炎发病过程中可能起着重要作用,检测病人血中sDR5水平可作为慢性乙型肝炎疾病活动性指标。     

白念珠菌Csa2蛋白双抗原夹心ELISA方法的建立及诊断价值

目的 建立以白念珠菌Csa2蛋白抗体为靶标的双抗原夹心ELISA,初步评价其鉴别诊断白念珠菌尿道感染的应用价值。方法 通过间接免疫荧光染色定位Csa2蛋白在白念珠菌菌体分布情况;应用棋盘滴度法优化反应条件,建立双抗原夹心ELISA并进行方法学评价;检测324例健康体检者血清,确定该方法的cutoff值;检测120例健康体检者及30例念珠菌属尿路感染患者血清,分析其诊断的灵敏性、特异性、阳性预测值、阴性预测值。结果 Csa2蛋白是一种特异性分布在白念珠菌菌丝态表面的蛋白;以0.1 μg/mL的rCsa2蛋白为包被抗原,1∶1 000稀释的rCsa2-HRP蛋白为检测抗原,建立双抗原夹心ELISA,可最低检测1∶16 000稀释的rCsa2蛋白免疫兔血清并不与正常兔血清发生反应;该方法的cutoff值为0.072,诊断白念珠菌尿路感染敏感性为65.2% (15/23),特异性为98.4% (125/127),阳性预测值88.2%（15/17）,阴性预测值为94.0%（125/133）。结论 成功建立检测白念珠菌特异性Csa2蛋白抗体双抗原夹心ELISA;初步评价该方法对诊断白念珠菌尿路感染具有较高的特异性,得出较高阳性预测值和阴性预测值;Csa2抗体靶标对区分白念珠菌感染和定植具有一定价值。     

异体脱蛋白松质骨复合骨唾液酸蛋白修复兔桡骨缺损

目的探讨骨唾液酸蛋白（Bone sialoprotein,BSP）在修复新西兰大白兔桡骨缺损中对骨形成和骨改建的作用,本实验拟评价骨唾液酸蛋白在兔体内的成骨活性,并为临床治疗骨缺损提供理论基础。方法采选用合适龄新西兰大白兔36只,前肢中段外侧骨段（连同骨膜）15mm,建立兔桡骨缺损模型,随机分为脱蛋白松质骨复合骨唾液酸蛋白组（A组）,脱蛋白松质骨组（B组）,自体骨移植组（C组）,分别于骨缺损处植入蛋白松质骨复合骨唾液酸蛋白,脱蛋白松质骨,自体骨移植,并在术后第4、8、10、12周,ABC三组各组随机选择3只动物,处死后游离桡骨标本备检。分别观察各组动物桡骨愈合X线片正侧位片情况,肉眼观察标本愈合情况,组织学观察。结果①脱蛋白松质骨复合骨唾液酸蛋白组肉眼观察,X线检查,HE染色均显示骨愈合均快于脱蛋白松质骨组,②脱蛋白松质骨复合骨唾液酸蛋白组肉眼观察,X线检查,HE染色均显示骨愈合均稍慢于自体骨移植组。结论脱蛋白松质骨复合骨唾液酸蛋白组与脱蛋白松质骨组相比,成骨活性增加,具有一定程度成骨活性,但较自体骨仍有差异。     

骨唾液酸蛋白表达和女性乳腺癌骨转移的关系

目的 探讨骨唾液酸蛋白(BSP)在乳腺癌组织中表达和乳腺癌骨转移的关系.方法 回顾性分析840例女性乳腺癌术后患者,根据治疗后随访是否有骨转移分为乳腺癌骨转移组和无骨转移组,用免疫组织化染色法测定840例原发性乳腺癌石蜡标本中BSP的表达,采用X2检验和COX生存分析乳腺癌治疗后骨转移和生存的影响因素.结果 840例病例单因素分析显示:年龄、原发病灶大小、TNM临床分期、分子分型表达情况与乳腺癌术后骨转移的发生差异有统计学意义(P＜0.05);BSP在骨转移组表达明显高于无骨转移组(无转移组+骨外转移组)(P＜0.05);乳腺癌术后骨转移与淋巴是否转移、CerbB-2情况、是否绝经、病理类型、细胞分级无关.多因素分析显示年龄越小、肿瘤体积越大、临床分期越晚、三阴性乳腺癌、BPS高表达是乳腺癌术后骨转移的危险因素.COX生存分析提示:乳腺癌组织标本中BSP高表达和低表达术后5年生存率差异有统计学意义(P＜0.05).结论 初诊时临床分期、年龄、原发病灶大小、分子分型是乳腺癌术后发生骨转移的主要危险因素,BSP表达可能和乳腺癌术后骨转移及疾病进展相关.     

The development and optimization of ELISA for the determination of tetrodotoxin

Objective： To optimize the ELISA for the determination of tetrodotoxin. Methods： A competitive enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was used. In the ELISA, 100 μl antigen （1. 0 μg/ml） was coated on the microtiter plate for 60 min at 37 C or over night at 4 C. The plate was then washed 3 times with PBS-T for 3-5 s each time. The optimal incubation time for monoclonal antibody （mAb）, goat anti-mice IgG peroxidase conjugate and OPD were 30 min, 20 min and 10 min at 37 C, re- spectively. Results.. The detection limit is 0. 05 ng in each well. The curve was linear for TTX doses be- tween 5-5 000 ng/ml （0. 25-250 ng for every assay）. The linear regress equation was Y = 0. 30 88X-0.17 41 （R=0.99 01）. The average callback for TTX of muscles and gonads were 99.74% and 100.30%, respectively. The sensitivity of optimization ELISA was 5 times than traditional method and the time of 1.8 h were saved. Conclusion： The optimized ELISA is an ideal method for the determination of tetrodotoxin.