葡萄糖神经酰胺合成酶基因在人耐多柔比星乳腺癌细胞株MCF-7/ADR中的表达及意义

背景与目的:多药耐药是肿瘤化疗失败的主要原因,近年来神经酰胺的糖基化水平增高与多药耐药的关系引起了广泛关注.本研究旨在探讨葡萄糖神经酰胺合成酶(GCS)基因在人乳腺癌细胞株MCF-7和人耐多柔比星(阿霉素)乳腺癌细胞株MCF-7/ADR中的表达及意义.方法:采用四氮唑盐(MTT)法检测多柔比星对MCF-7/ADR和MCF-7的抑制率和IC50,用浓度为5、10、20μmol/L的GCS抑制剂D,L-threo-1-phenyl-2-decanoyl-amino-3-morpholino-1-propanol(PDMP)预处理MCF-7/ADR 24、48 h后检测抑制率和IC50;应用实时荧光定量PCR(real time PCR)检测MCF-7、MCF-7/ADR以及PDMP预处理后MCF-7/ADR中GCS mRNA的表达.结果:MCF-7/ADR 对MCF-7的耐药倍数为22.69倍,PDMP作用后多柔比星对MCF-7/ADR的抑制率升高,IC50从(19.0±0.5)μg/ml 下降到(5.6±0.6)μg/ml.MCF-7/ADR中GCS mRNA的表达高于MCF-7(P<0.01),PDMP使MCF-7/ADR中GCS mRNA的表达水平GCSN(48±17)下降到(21±4).结论:GCS可能参与乳腺癌的发生过程,并在MCF-7/ADR多药耐药中起重要作用.     

MiR-34a对乳腺癌Mcf-7／ADR细胞株多柔比星敏感性影响研究

目的：探讨乳腺癌细胞株MCF7和耐药株MCF7／ADR中miR-34a的表达差异及miR-34a对于多柔比星化疗敏感性的影响。方法：采用实时定量PCR技术检测MCF-7细胞及MCF-7／ADR细胞中miR-34a的表达差异。采用转染技术,以脂质体为载体,在MCF_7／ADR细胞株中过表达miR-34a后,检测其对于多柔比星耐药活性的影响,同时采用实时定量PCR技术和蛋白质印迹法技术检测靶基因的表达变化。结果：MCF-7细胞株和耐药株MCF-7／ADR中miR-34a的相对表达量分别为1．01±0．03和0．76±0．04,在耐药细胞株中呈现下调表达,P=0．007。MTT结果显示,MCF7及其耐药株MCF-7／ADR细胞多柔比星半数抑制浓度Ic5。分剐为（0,22±0．02）和（18．7±0．09）ftmol／L。对耐药株MCF-7／ADR过表达miR34a后,MCF-7／ADR细胞对多柔比星的ICso降低为（10．7士0．11）mol／L,明显增强此细胞株对于多柔比星的耐药敏感性。实时定量PCR结果显示,与转染阴性对照RNA相比,于耐药株MCF7／ADR细胞中转染miR--34a后耐药相关靶基因Bcl-2和CCNDl的mRNA水平分别降低了0．46±0．02（P=0．002）和0．33±0．02（P=0．008）。蛋白质印迹结果显示,过表达miR-34a后,可明显下调靶基因Bcl-2和CCNDl的表达。结论：上调表达miR34a可以增加耐药细胞株MCF-7／ADR对于多柔比星的耐药敏感性。     

miR-130a靶向调节PTEN基因对人乳腺癌细胞多柔比星敏感性影响的观察

目的:探讨miR-130a对PTEN基因表达的调控,及其与乳腺癌MCF-7细胞株多柔比星耐药的关系。方法:利用miRNA芯片结合RT-qPCR的方法筛选到miR-130a在亲代敏感MCF-7/S细胞与多柔比星耐药细胞(MCF-7/Adr)中表达差异;通过靶基因预测软件预测PTEN与miR-130a基因的关系;通过miR-130a模拟物和抑制物转染实验结合四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、RT-qPCR和蛋白质印迹法观察miR-130a的表达变化对乳腺癌细胞多柔比星耐药性的影响及其与PTEN基因表达间的关系。结果:与MCF-7/S相比,miR-130a在MCF-7/Adr中的表达水平明显增高(116 834.70±4 728.32)倍,t=19.035,P=0.000;但在多西紫杉醇耐药株MCF-7/Doc中的表达差异无统计学意义,t=0.703,P=0.521。MCF-7/S细胞转染miR-130amimics后,与阴性对照组相比,其miR-130a表达水平明显增高(17.686±1.057)倍,t=8.360,P=0.001;MCF-7/S空白对照组、阴性对照组和实验组对Adr的IC50分别为(0.240±0.099)、(0.181±0.060)和(0.606±0.164)mg/L;与阴性对照相比,转染miR-130amimics后细胞的IC50显著增高,t=5.200,P=0.007。同时PTEN mRNA和蛋白表达水平明显下调,PTEN mRNA水平是阴性对照组的(0.362±0.076)倍,t=2.927,P=0.043;蛋白表达水平是阴性对照组的(0.386±0.020)倍,t=20.713,P=0.000 3;而MCF-7/Adr转染miR-130ainhibi-tors后,其miR-130a表达水平是阴性对照组的(0.169±0.035)倍,t=12.036,P=0.000 2;MCF-7/Adr空白对照组、阴性对照组和实验组对Adr的IC50分别为(50.793±3.970)、(46.206±1.963)和(23.366±1.304)mg/L;与阴性对照相比,转染miR-130ainhibitors后细胞的IC50显著降低,t=16.784,P=0.000 7;同时PTEN mRNA和蛋白表达水平均明显上调,PTEN mRNA水平是阴性对照组的(3.564±0.336)倍,t=4.122,P=0.015;蛋白表达水平是阴性对照组的(2.019±0.268)倍,t=8.999,P=0.000 8。结论:miR130a可能通过靶定PTEN基因来增强乳腺癌细胞对多柔比星的耐药性。     

乳腺癌多药耐药DEDD作用及机制研究

目的 死亡效应结构域DNA结合蛋白(death effector domain DNA-binging protein,DEDD)可抑制乳腺癌的生长和转移,但在乳腺癌多药耐药中的作用尚不明确.本研究将探讨DEDD在人乳腺癌多药耐药中的作用及机制.方法 通过转染DEDD-shRNA建立稳定敲低DEDD表达的MCF-7人乳腺癌细胞株,MTS实验检测多柔比星、紫杉醇对MCF-7 WT(Wild type,野生型)、MCF-7 control shRNA和MCF-7 DEDD-shRNA细胞活力的影响,Annexin-V和碘化丙啶(propidium iodide,PI)双染后流式细胞仪检测细胞凋亡.蛋白质印迹法检测乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein,BCRP)在药物干预后的蛋白表达水平.结果 多柔比星干预后,半数抑制浓度IC50的多因素方差分析结果显示,不同处理(F=89.49,P＜0.001)、不同时间(F=50.81,P＜0.001)组间比较差异有统计学意义.多柔比星干预24或48 h后,MCF-7 DEDD-shRNA的半数抑制浓度IC50分别为(0.97±0.15)和(0.62±0.09) μmol/L,明显高于MCF-7 WT(0.46±0.05)和(0.26±0.03) μmol/L和MCF-7 control shRNA细胞(0.39±0.05)和(0.25±0.03)μmol/L,P＜0.001.紫杉醇干预后,半数抑制浓度IC50的多因素方差分析结果显示,不同处理(F=15.94,P＜0.001)、不同时间组间(F=129.70,P＜0.001)比较差异有统计学意义.紫杉醇干预24或48 h后,MCF-7 DEDD-shRNA的半数抑制浓度IC50为(16.74±2.26)和(9.88±1.47) μmol/L,明显高于MCF-7 WT(13.39±1.44)和(7.69±0.92) μmol/L(P=0.001)和MCF-7 control shRNA细胞(12.58±1.15)和(7.17±1.12) μmol/L(P＜0.001).多柔比星干预后24 h后流式细胞凋亡结果显示,不同处理(F=131.46,P＜0.001)、不同浓度组间(F=160.95,P＜0.001)比较差异有统计学意义.正常培养状态下,MCF-7 control shRNA细胞和MCF-7 DEDD-shRNA细胞的凋亡率分别为(14.32±1.47)％和(11.58±1.63)％,而给予0.5μmol/L和1 μmol/L多柔比星作用24 h后,M[CF-7DEDD-shRNA细胞的凋亡率分别为(21.62±1.97)％和(24.39±2.36)％,明显低于MCF-7 control shRNA细的(36.26±1.87)％和(38.23±1.46)％,P＜0.001.同样,紫杉醇干预后24 h,不同处理(F=124.81,P＜0.001)、不同浓度组问(F=172.56,P＜0.001)细胞凋亡率比较差异有统计学意义.给予9.37和18.74 μmol/L紫杉醇作用24 h后,MCF-7DEDD-shRNA细胞的凋亡率分别为(30.26±1.63)％和(32.18±2.16)％,明显低于MCF-7 control shRNA组的(53.84±2.17)％和(58.27±2.16)％,P＜0.001.多柔比星作用后不同时间BCRP蛋白质印迹检测统计分析结果显示,不同处理(F=14.67,P＜0.001)、不同时间(F=6.39,P=0.006)组间BCRP蛋白表达比较差异有统计学意义.给予0.5 μmol/L多柔比星作用24 h后,3组细胞的BCRP相对表达水平分别为0.87±0.04、1.06±0.02和5.25±0.18.MCF-7 DEDD-shRNA细胞组BCRP蛋白的表达水平显著高于MCF-7 WT和MCF-7 control shRNA细胞组,P＜0.001.多柔比星作用48 h后,3组细胞的BCRP相对表达水平分别为1.06±0.01、0.97±0.04和2.98±0.13.MCF-7 DEDD-shRNA细胞组BCRP蛋白的表达水平出现回落,但仍显著高于MCF-7 WT和MCF-7 control shRNA细胞组,P＜0.001.同样,紫杉醇作用后不同时间BCRP蛋白质印迹检测统计分析结果显示,不同处理(F=7.26,P=0.004)、不同时间(F=8.32,P=0.002)组间BCRP蛋白表达比较差异有统计学意义.给予9.37 μmol/L紫杉醇作用24 h后,3组细胞的BCRP相对表达水平分别为0.81±0.05、2.25±0.10和1.78±0.14.其中MCF-7 control shRNA组细胞BCRP表达水平高于MCF-7 WT (P＜0.001)和MCF-7 DEDD-shRNA (P=0.002)组.而紫杉醇作用48 h后,3组细胞的BCRP相对表达水平分别为0.73±0.04、1.73±0.05和3.12±0.12,MCF-7 DEDD-shRNA细胞组BCRP蛋白的表达水平继续增高,且显著高于MCF-7 WT和MCF-7 control shRNA细胞组,P＜0.001.结论 敲低DEDD表达可增强乳腺癌细胞的抗肿瘤药耐药性,BCRP的表达增加可能是低表达DEDD乳腺癌细胞多药耐药的机制之一.     

Ad-p53逆转乳腺癌细胞株多药耐药性及其对P-gp、TOPOⅡ和GST-π表达的影响

背景与目的肿瘤细胞对抗癌药物产生耐受性是化疗失败的主要原因,突变型p53基因与肿瘤多药耐药密切相关.本研究旨在探讨腺病毒介导的p53基因(Ad-p53)对人乳腺癌多柔比星(阿霉素)耐药细胞株MCF-7/Adr多药耐药的逆转作用及其对耐药相关蛋白P-gp、TOPOⅡ和GST-π表达的影响.方法以人乳腺癌MCF-7细胞及其多柔比星耐药株MCF-7/Adr为实验对象,cck-8法观察Ad-p53对多药耐药的逆转作用,Western blot检测P-gp、TOPOⅡ和GST-π蛋白表达的变化.结果50 MOI Ad-p53能使多柔比星对MCF-7/Adr细胞IC50由(4.54±0.91) μg/ml降到(0.26±0.11) μg/ml,逆转耐药倍数为18.1倍(P〈0.001);P-gp、GST-π蛋白表达量下降,TOPOⅡ未见明显变化.结论Ad-p53能够逆转MCF-7/Adr多药耐药,下调P-gp和GST-π表达.     

腺苷酸活化蛋白激酶增强乳腺癌对多柔比星化疗敏感性的机制

背景与目的：腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)在调控细胞代谢和能量平衡方面起着重要作用,并与细胞增殖、生存和多种信号通路密切相关。近年来发现AMPK参与肿瘤的抑制和耐药。该研究旨在探讨AMPK对多柔比星抑制乳腺癌作用的影响及其机制。方法：采用四甲基偶氮唑蓝(meth-ylthiazolyl tetrazolium,MTT)法检测多柔比星作用后对MCF-7/adr、MCF-7/adr-vector及MCF-7/adr-AMPKα细胞增殖的影响;Hoechst染色法观察各组细胞凋亡形态;流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测各组细胞凋亡率;荧光酶标仪检测3组细胞多柔比星累积量;蛋白[质]印迹法(Western blot)检测各组细胞中耐药蛋白及凋亡相关蛋白的表达。结果：多柔比星对MCF-7/adr细胞增殖抑制作用呈剂量和时间依赖性,其作用24、48 h的IC50值分别为(36.8±2.1)和(28.8±1.3)μg/mL。过表达AMPKα可增加多柔比星对MCF-7/adr细胞的生长抑制作用,呈剂量和时间依赖性,其作用24、48 h的IC50值分别为(16.0±0.7)和(4.2±0.2)μg/mL。荧光形态分析发现多柔比星联合AMPKα能诱导MCF-7/adr细胞凋亡。1.0μg/mL多柔比星作用48 h后,MCF-7/adr、MCF-7/adr-vector及MCF-7/adr-AMPKα细胞的凋亡率分别为(12.0±1.4)%、(12.7±1.6)%和(32.0±4.2)%,MCF-7/adr细胞中AMPKα过表达明显提高MCF-7/adr细胞对多柔比星的敏感性。荧光酶标仪检测显示,过表达AMPKα能明显提高细胞内多柔比星的累积量,具有浓度依赖性。Western blot实验结果显示,与MCF-7/adr和MCF-7/adr-vector细胞比较,MCF-7/adr-AMPKα细胞中Bax、细胞色素c(Cyto c)的释放、caspase-3和多聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶降解产物(cleaved PARP)蛋白表达明显增加,而细胞外排泵P-糖蛋白(P-gp)和Bcl-2蛋白表达降低。结论：AMPKα可通过抑制耐药细胞外排泵以及调控凋亡相关蛋白的表达,从而增强乳腺癌耐药细胞对多柔比星的化疗敏感性。     

塞来昔布预防MCF-7细胞获得性耐药发生

目的:观察环氧合酶-2 (cyclooxygenase-2, Cox-2) 抑制剂塞来昔布(celecoxib)对乳腺癌细胞株MCF-7获得性耐药的预防作用,并对其机制进行初步探讨.方法:采用小剂量多柔比星 (doxorubicin, Doxo) 对MCF-7细胞进行诱导,建立获得性耐药诱导模型,同时以此模型,联合应用塞来昔布进行耐药预防研究.MTT法检测多柔比星对MCF-7细胞的生长抑制效应及半数抑制浓度(half inhibition concentration,IC50)值; RT-PCR方法检测MDR1、MRP1、GST及TopoⅡ等多药耐药相关基因的变化;Western印迹法检测蛋白的变化; FCM法检测细胞膜P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的表达及功能. 结果:多柔比星(0.05 μg/mL)作用7 d,MCF-7细胞内MDR1及MRP1在mRNA及蛋白水平均上调,而GST及TopoⅡ未见明显变化;联合塞来昔布(10 和20 μmol/L)进行干预,可有效抑制多柔比星诱导的MDR1及MRP1在mRNA及蛋白水平的上调,细胞膜P-gp功能均降低.多柔比星与塞来昔布(10 μmol/L)联合作用组,MCF-7细胞对多柔比星的IC50值为(0.38±0.04) μg/mL与多柔比星单药组的 (0.67±0.03) μg/mL相比,差异有统计学意义(P<0.01). 结论:选择性Cox-2抑制剂塞来昔布可有效预防MCF-7细胞获得性耐药的发生, 且具有明显的化疗增敏作用,其初步作用机制部分涉及塞来昔布抑制多柔比星引起的P-gp及MRP1的上调.     

PHⅡ-7对人乳腺癌多药耐药细胞MCF-7/ADR体外杀伤活性和逆转耐药作用

背景与目的:多药耐药(multidrug resistance,MDR)是恶性乳腺癌化疗失败的主要原因,而ABC转运蛋白家族的P-glycoprotein(P-gp)高表达是MDR的主要机制之一.因此研制能抑制P-gp表达及其功能的新型抗癌药是目前研究的热点.本研究旨在研究PH Ⅱ-7对人乳腺癌多药耐药细胞MCF-7/ADR体外抗瘤活性及逆转耐药的作用.方法:采用MTT法检测PHⅡ-7、多柔比星(adriamycin,ADR)及二者联合应用对人乳腺癌细胞MCF-7和耐药细胞株MCF-7/ADR的IC50值;采用流式细胞仪测定PH Ⅱ-7对MCF-7及MCF-7/ADR细胞凋亡的诱导作用;采用逆转录PCR和实时荧光定量PCR方法检测PHⅡ-7对多药耐药基因1(multidrug resistance gene 1,mdr1)表达水平的影响;通过流式细胞仪观察PHⅡ-7处理前后,MCF-7/ADR细胞内Rhodamine123浓度的改变,分析PHⅡ-7对p-gp外排功能的影响.结果:PH Ⅱ-7对MCF-7和MCF-7/ADR细胞均有生长抑制作用,IC50值分别为(6.07±0.85)和(5.51±1.22)μmol/L;低浓度PHⅡ-7与ADR联合应用能增强其细胞毒作用,二者具有协同作用.PHⅡ-7可诱导MCF-7和MCF-7/ADR细胞凋亡;在诱导凋亡过程中,PHⅡ-7可降低MCF-7/ADR细胞内mdrl基因的表达,抑制p-gp外排功能.结论:PHⅡ-7可诱导MCF-7/ADR凋亡,并具有对MCF-7相同的体外杀伤活性.PHⅡ-7可通过抑制P-gp的表达和功能逆转MCF-7/ADR耐药性.     

Tautomycetin诱导乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR的凋亡及其机制

目的:研究tautomycetin对乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR增殖及凋亡的影响及其机制.方法:MTr法检测tautomycetin对MCF-7/ADR细胞增殖的影响,流式细胞术检测MCF-7/ADR细胞的凋亡,Western blotting法检测tautomycetin对MCF-7/ADR细胞caspase相关蛋白、Bcl-2、Cyto-C、P53蛋白表达和Akt磷酸化的影响.结果:Tautomycetin可剂量(0.01～100μmol/L)依赖性地抑制MCF-7/ADR细胞的增殖(P＜0.05),IC50值为(1.26±0.12)μmol/L;与对照组相比,tautomycetin (1 μmol/L)可诱导MCF-7/ADR细胞凋亡,早期凋亡比例由(0.67±0.18)％升高至(17.2±3.8)％,晚期凋亡比例由(0.96±0.23)％升高至(28.4±5.7)％(P＜0.05).Tautomycetin可活化MCF-7/ADR细胞中caspase-7和caspase-9,降低Bcl-2蛋白的表达,促进线粒体释放Cyto-C,降低p-Akt的水平,但对caspase-8和P53的表达没有影响.结论:Tautomycetin可阻断Akt活化,以P53非依赖的方式通过Cyto-C介导的通路诱导MCF-7/ADR细胞凋亡.     

米非司酮逆转人乳腺癌细胞MCF-7/ADR耐多柔比星机制的探讨

目的 探讨米非司酮对乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR的逆转耐药作用.方法 以亲本乳腺癌细胞MCF-7和耐多柔比星(阿霉素)乳腺癌细胞MCF-7/ADR为研究对象,分别应用MIF进行干预后,流式细胞仪检测MIF作用前后瘤细胞P-gp的表达、细胞内阿霉素蓄积量的变化以及细胞周期的分布.结果 (1)10 μmol/L MIF作用72小时后,MCF-7/ADR细胞P-gp表达率[(23.21±1.80)％]明显高于MCF-7细胞[(19.37±2.37)％,P＜0.05].(2)5 μmol/L ADR处理后,MCF-7/ADR细胞内ADR蓄积量为(47.13±4.11)％,低于MCF-7细胞[(60.24±2.61)％,P＜0.05].(3) 10 μmol/L MIF联合5 μmol/L ADR处理细胞,MCF-7/ADR和MCF-7细胞内ADR的蓄积量分别为(82.72±2.42)％及(88.63±2.75)％ (P ＞0.05);但均较单用ADR时升高(均P＜0.01).(4) MIF作用前,MCF-7/ADR细胞G0/G1期比例[(77.21±3.10)％]高于MCF-7细胞G0/G1期比例[(59.05±2.16)％,P＜0.05];MCF-7/ADR细胞S期比例明显低于MCF-7细胞(P＜0.05).经10 μmol/L MIF作用后,MCF-7细胞G0/G1期比例(75.28±2.53)％较MIF作用前明显升高(P＜0.05);S期比例则较MIF作用前显著降低(P＜0.05);MCF-7/ADR细胞G0/G1期比例和S期比例分别为(80.13±2.72)％及(13.52±1.03)％,与MIF作用前比较差异均无统计学意义(均P＞0.05);两种瘤细胞的G2/M期比例与MIF作用无关(P＞0.05).结论 (1)MIF可以逆转MCF-7/ADR的耐药性,其作用机制与降低细胞P-gp含量、增加细胞内ADR蓄积量有关.(2) 10 μmol/L浓度的MIF对MCF-7/ADR细胞周期分布影响不大.     

基因RNA干扰载体的构建及其对乳腺癌细胞耐药性的影响

目的:构建针对CIAPIN1基因的慢病毒siRNA表达载体并稳定转染人乳腺癌多柔比星耐药细胞MCF-7/ADM,观察该基因对乳腺癌细胞耐药性的影响。方法:设计合成针对CIAPIN1的siRNA重组质粒表达载体,并筛选出最有效的干扰序列,使用病毒包装系统进行慢病毒颗粒的包装和生产,获取ADM-CIAPIN1 RNAi稳定表达细胞株;MTT法检测CIAPIN1基因干扰前后细胞对于不同化疗药物IC50值的变化。结果:测序验证针对CIAPIN1的siRNA重组质粒构建成功,并筛选CIAP-IN1-siRNA1为最佳干扰序列;以慢病毒为载体将干扰表达质粒稳定转染入乳腺癌细胞MCF-7/ADM后,抑制CIAPIN1表达水平超过88%。RNA干扰后紫杉醇、多柔比星及吉西他滨3种抗肿瘤药物对于MCF-7/ADM细胞的IC50值均显著下降[(7.12±0.31)、(11.21±1.79)、(49.72±4.52)vs(1.13±0.06)、(4.51±0.20)、(18.30±1.27)μg/ml,P<0.01],说明该细胞的耐药性明显减弱。结论:针对CIAPIN1基因的慢病毒siRNA表达载体可以有效抑制MCF-7/ADM细胞中该基因的表达,CIAPIN1基因表达下调可使乳腺癌细胞的多药耐药性发生逆转。     

miR-490-3p逆转MCF-7／ADM细胞对阿霉素耐药性的影响

【摘 要】目的 探讨miR-490-3p在阿霉素（ADM）耐药乳腺癌细胞系MCF-7／ADM中的表达情况及其对MCF-7／ADM细胞增殖、凋亡和ADM耐药的影响。方法 以野生型人乳腺癌细胞系MCF-7及其耐药型细胞系MCF-7／ADM为研究对象,用实时荧光定量PCR（qPCR）比较两种细胞中miR-490-3p的表达水平,将miR-490-3p的过表达载体pcDNA1（+）miR-490-3p瞬时转染至MCF-7／ADM细胞（过表达组）后采用qPCR检测转染效果,同时设pcDNA3.1（-）空载体对照组和空白对照组;采用MTT法测定转染pcDNA3.1（+）miR-490-3p对各组MCF-7/ADM细胞增殖能力的影响,测定ADM对MCF-7／ADM细胞的增殖抑制率并计算半数抑制浓度（IC50）及逆转倍数以评价对ADM敏感性的变化;分别于瞬时转染48 h后用Annexin V／FITC流式细胞术检测各组MCF-7/ADM细胞的凋亡率,Western blotting检测耐药蛋白P-糖蛋白（P-gp）,乳腺癌耐药蛋白（BCRP）和多药耐药相关蛋白1（MRP1）的表达,荧光分光光度计检测胞内ADM药物浓度,流式细胞仪检测P-gp活性。结果 MCF-7／ADM细胞中miR-490-3p的表达水平为0.24±0.07,显著低于野生型MCF-7细胞的1.02±0.03（P＜0.05）;过表达组瞬时转染24～96 h的miR-490-3p水平持续升高,均高于空载体对照组和空白对照组（P＜0.05）;过表达组的增殖抑制率随转染时间的延长而增加,转染24、48、72和96 h的增殖抑制率依次为（17.52±1.87）％、（31.67±2.79）％、（45.09±1.88）％和（61.82±2.52）％,高于空载体对照组（P＜0.05）;ADM对过表达组的IC50值为（11.27±2.34）μg／ml,低于空白对照组的和空载体对照组（P＜0.05）,且过表达组相对于空白对照组和空载体对照组的逆转倍数分别为3.35倍和3.39倍;与其余两组相比,过表达组的MCF-7/ADM细胞早、晚期凋亡率和细胞内药物浓度均升高,P-gp、BCRP和MRP1表达及P-gp活性均降低,差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论 上调miR-490-3p可逆转MCF-7／ADM细胞对ADM的耐药性,可能通过降低耐药蛋白表达及抑制P-gp活性有关,且升高其水平可抑制细胞增殖并诱导凋亡。     

Down-regulation of microRNA-200c is associated with drug resistance in human breast cancer

Drug resistance remains a major clinical obstacle to successful treatment in breast cancer patients, and the evidence of microRNAs involvement in cancer drug resistance has been emerging recently. However, the role of microRNA-200c (miR-200c) in modulating chemoresistance of breast cancer remains largely unexplored. Here, we investigated the miR-200c expression in tumor specimens obtained from thirty-nine breast cancer patients who received neoadjuvent chemotherapy by quantitative real-time PCR. Down-regulated miR-200c was observed in non-responders as compared to responders. In addition, miR-200c expression was observed to be down-regulated over 800-fold in human breast cancer cells resistant to doxorubicin MCF-7/ADR as compared to the parental MCF-7 cells. Up-regulation of miR-200c with transfection of miR-200c mimics in breast cancer cells could enhance the chemosensitivity to epirubicin and reduce expression of multidrug resistance 1 mRNA and P-glycoprotein. Moreover, our study demonstrated that restoration of miR-200c in MCF-7/ADR cells could increase intracellular doxorubicin accumulation determined by flow cytometry. Taken together, our findings suggest that miR-200c may act as a promising therapeutic target for improvement of responsiveness to chemotherapy in breast cancer.     

钠氢交换蛋白抑制剂Cariporide对MCF-7/ADR细胞化疗敏感性影响机制研究

目的 肿瘤细胞膜内外pH值的改变对于肿瘤的侵袭、转移密切相关,通过细胞内外的H+/Na+交换维持细胞内环境的稳态,细胞的凋亡水平与化疗药物耐药的发生密切相关.本研究观察钠氢交换蛋白1(sodium hydrogen exchange 1,NHE-1)抑制剂 Cariporide(CP)对人乳腺癌细胞MCF-7/ADR增殖、凋亡和对多柔比星(adriamycin,ADR)敏感性影响,并探讨其相关作用机制.方法 以终浓度分别为3、6、9、12、60和100 μg/mL的CP处理MCF-7和MCF-7/ADR细胞48 h,以终浓度分别为1、5、50和100 μg/mL的ADR以及2种药物联用分别处理MCF-7/ADR细胞24、48 h,CCK8法检测其对细胞的增殖影响,Graphpad prism 5分别计算单用及药物联用时的IC50,CompuSyn软件计算2种药物的联用指数(CI);采用流式细胞术检测药物单用及联用后对细胞凋亡率的影响;RT-PCR法检测MDR-1、NF-κB等相关核转录因子的表达;蛋白质印迹法检测CD44、MDR-1、NF-κB p65、Caspase-3/9和Bcl-2的表达.结果 CP对乳腺癌细胞有增殖抑制作用,呈剂量及时间依赖性,CP与ADR联用可以明显降低ADR对MCF-7/ADR细胞的IC50值,其值由(82.45±5.86) μg/mL下降至(42.2±2.03) μg/mL,t=7.57,P<0.05.流式细胞术检测结果显示,对照组、单用ADR组、单用CP组、药物联用组细胞的凋亡率分别为(4.02±0.19)%、(6.34±0.39)%、(9.55±0.47)%和(15.12±0.65)%,F=666.2,P<0.001.荧光定量PCR结果表明,单用CP及CP联用ADR组MDR-1、NF-κB mRNA 表达均下降.蛋白质印迹法结果显示,单用CP及CP联用ADR耐药相关蛋白CD44、MDR-1表达下调,NF-κB p65表达下调,抑凋亡蛋白Bcl-2表达下降,凋亡相关蛋白cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9表达上调.结论 CP可以增加MCF-7/ADR细胞对ADR的敏感性,可能是通过下调耐药相关蛋白的表达,活化凋亡相关蛋白,诱导细胞凋亡,从而有效逆转肿瘤细胞的耐药.     

Reversing adriamycin resistance of human breast cancer cells by hyperthermia combined with Interferon alpha and Verapamil

One of the major obstacles related to chemotherapy is resistance against anticancer drugs, including Adriamycin (ADM). The purpose of the present work is to investigate the reversal effects on ADM resistance by hyperthermia (42.5 degrees C) combined with two reversal agents (Interferon alpha and Verapamil) in MCF-7/ADR (ADM-resistant MCF-7 breast cancer cell line), and its relevant molecular mechanism of action. The cell survival rate and ADM IC50 of different experiment groups were measured by MTT test. The quantitative expression of MDR1 gene in cells was detected by Real-time PCR, and the expression of P-glycoprotein (P-gp) on the cells surface and the intracellular ADM accumulation was detected by flow cytometry (FCM). The ADM IC50 of the MCF-7/ADR cells decreased 830-fold after combined with Interferon alpha (IFN-alpha) and Verapamil (VRP). Although there was no distinction in the mRNA expression of MDR1, the P-gp on the MCF-7/ADR cell membrane was significantly reduced and the cellular ADM uptake increased markedly as compared to pretreatment. Our results suggeste that hyperthermia induces a considerably reversal activity against ADM resistance synergizing other reversal agents (IFN-alpha and VRP). The reversal mechanism needs further study. However, these features of hyperthermia may be exploited in clinical cancer chemotherapy.     

转铁蛋白修饰多柔比星脂质体靶向抑制乳腺癌细胞增殖的研究

目的：利用转铁蛋白（TF）修饰多柔比星脂质体,并探讨其对乳腺癌细胞增殖的影响。方法采用薄膜超声法制备脂质体,利用硫酸梯度法制备多柔比星脂质体,然后采用后插入法制备 TF修饰多柔比星脂质体。激光共聚焦显微镜检测乳腺癌细胞 MCF-7和 MDA-MB-231对 TF-多柔比星脂质体的摄取,四甲基偶氮唑盐比色法（MTT 法）检测 TF-多柔比星脂质体靶向作用 MCF-7和 MDA-MB-231细胞后的杀伤能力,软琼脂克隆集落实验检测 TF-多柔比星脂质体对 MCF-7和 MDA-MB-231细胞的生长抑制作用。结果激光共聚焦显微镜观察显示,MCF-7细胞和 MDA-MB-231细胞对 TF-多柔比星脂质体摄取率显著高于多柔比星脂质体;MTT 法检测结果则显示,TF-多柔比星脂质体对 MCF-7细胞[（20．8±3．2）μmol／L]和 MDA-MB-231细胞[（20．1±3．0）μmol／L]杀伤的 IC50显著低于多柔比星脂质体[（158．6±24．6）μmol／L;（160．1±25．1）μmol／L）]和游离多柔比星[（161．7±26．2）μmol／L;（166．9±27．0）μmol／L）],差异有统计学意义（F ＝116．03,P ＜0．001;F ＝75．29,P ＜0．001）。软琼脂克隆集落实验显示,TF-多柔比星脂质体对克隆集落的生长抑制显著优于多柔比星脂质体、游离多柔比星及对照组[MDA-MB-231细胞直径：（60．5±10．4）μm、（94．3±16．8）μm、（131．8±22．6）μm、（162．8±30．3）μm;MCF-7细胞直径：（31．8±5．5）μm、（62．1±11．1）μm、（108．6±18．6）μm、（157．4±29．3）μm],差异有统计学意义（F ＝87．17,P ＜0．0001;F ＝178．23,P ＜0．0001）。结论 TF-多柔比星脂质体对乳腺癌细胞体外增殖具有显著的抑制作用,能够高效、特异地杀死乳腺癌细胞,为体内治疗乳腺癌提供了一定的理论依据。