c-myc反义寡核苷酸对HL-60细胞增殖及c-myc基因表达的影响

目的：观察c-myc基因反义寡核苷酸(ASODN)对HL-60细胞增殖及c-myc基因表达的抑制作用．探讨ASODN作为药物进行白血病基因治疗的可行性、方法：应用c-myc反义寡核苷酸封闭HL-60细胞c-myc基因、RTPCR方法检测该基因表达抑制情况．流式细胞仪进行细胞周期分析,倒置显微镜观察细胞形态变化．绘制细胞生长曲线,MTT法检测细胞增殖状态。结果：c-myc基因反义寡核苷酸转染HL-60细胞后,c-myc基因表达明显受抑;S期细胞比值由55.6％降至16．7％;细胞生长受抑,增殖能力减弱,其抑制作用具有序列特异性及剂量依赖性。结论c-myc基因反义寡核苷酸对HKL-60细胞增殖及c-myc基因的表达具有明显的抑制作用,有望成为抑制白血病细胞增殖的核酸药物。     

RNA干扰对HL-60白血病细胞株WT1基因表达的抑制作用

目的 研究RNA干扰(RNA interference, RNAi) 对白血病细胞株WT1 基因表达的抑制作用.探讨WT1小干扰RNA在白血病治疗中的应用.方法 设计制备多对针对WT1基因的小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA),转染HL-60人白血病细胞株,采用RT-PCR法测定WT1 mRNA 的表达,Western blot 测定WT1 蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果 siRNA 后WT1 mRNA与蛋白的表达强度分别为(23.62±1.28)%和(23.20±1.04)%,和对照组比较有显著性差异(P＜0.05);在WT1表达受到抑制的同时,HL-60细胞的凋亡率为(13.72 ±1.33)%,和对照组比较有显著性差异(P＜0.05).结论 siRNA能有效抑制HL-60细胞中WT1基因的表达,增加细胞凋亡.     

Effects of UbcH10 gene silencing combined with paclitaxel treatment on proliferation and apoptosis of NCI-H226 cells

目的 观察小干扰RNA(siRNA)介导的UbcH10基因沉默联合紫杉醇处理对人肺鳞癌细胞株NCI-H226细胞增殖活性和凋亡的影响.方法 化学合成针对UbcH10基因的siRNA-UbcH10序列,脂质体转染siRNA至NCI-H226细胞(siRNA转染组),转染后24 h,采用Real-Time PCR和Western blotting分别检测UbcH10 mRNA和蛋白的表达水平,以未予任何转染细胞作为空白对照,以阴性序列转染细胞作为阴性对照.以紫杉醇(1μmol/L)处理siRNA转染及未转染NCI-H226细胞(siRNA+紫杉醇组和紫杉醇组),分别于转染后24、48 h收集细胞,MTT比色法检测细胞增殖;转染后24 h收集细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡;以未经紫杉醇处理的siRNA转染、阴性序列转染和未予转染的NCI-H226细胞作为siRNA转染组、阴性对照组和空白对照组.结果 Real-Time PCR和Western blotting检测结果显示:转染后24 h,siRNA转染组UbcH10 mRNA和蛋白的表达较空白对照组和阴性对照组显著下调(P＜0.01).MTT比色法检测结果显示,siRNA转染组细胞增殖抑制率显著高于紫杉醇组和对照组(P＜0.05),而siRNA+紫杉醇组细胞增殖抑制率显著高于siRNA转染组(P＜0.05).siRNA转染组细胞凋亡率显著高于紫杉醇组和对照组(P＜0.05),而siRNA+紫杉醇组细胞凋亡率显著高于siRNA转染组(P＜0.05),紫杉醇组与对照组细胞凋亡率比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 UbcH10基因沉默可显著增强NCI-H226细胞对于化疗药物紫杉醇的敏感性.     

Let-7a沉默c-myc基因对人乳腺癌MCF-7细胞生长的抑制作用

目的 探讨let-7a对体外生长的人乳腺癌MCF-7细胞株的抑制作用及可能的作用机制.方法 用lipofectamineTM2000介导let-7a和阴性对照siRNA转染人乳腺癌MCF-7细胞株,半定量RT-PCR检测各组细胞c-myc mRNA表达;Western blot测定转染24 h后c-myc蛋白的表达水平; CCK-8检测细胞增殖和凋亡.结果 细胞转染后,let-7a转染组的c-myc mRNA表达水平明显低于脂质体对照组和阴性siRNA转染组(0.586±0.032, 0.934±0.029,0.825±0.004,P<0.01);在MCF-7细胞中存在分子量62 kD的特异性条带,与c-myc蛋白分子量相符,let-7a组的特异性条带明显弱于对照组; let-7a对细胞增殖具有一定的抑制作用(P<0.05),且该抑制作用具有时间和浓度的依赖性.结论 Let-7a对体外生长的人乳腺癌MCF-7细胞的增殖有明显抑制作用,其机制可能与抑制c-myc的基因表达有关.     

人PGI基因siRNA慢病毒质粒的构建及对白血病细胞增殖的影响

目的 构建共表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因和人磷酸葡萄糖异构酶(phosphoglucose isomerase,PGI)基因的慢病毒载体,初步探讨干扰人PGI基因对白血病细胞增殖的影响.方法 RT-PCR、Western blot检测人单核细胞、K562、KG1-α、HL-60细胞中PGI mRNA和蛋白表达水平,筛选高表达PGI的白血病细胞系;构建人PGI基因siRNA的慢病毒载体及阴性对照,经293T细胞包装后,获得可表达人PGI基因siRNA的慢病毒载体及阴性对照;分别使用重组病毒(干扰组)、原始病毒(阴性对照组)和等量PBS(空白对照组)转染白血病KG1-α细胞,筛选稳定转染细胞株.RT-PCR和Western blot检测干扰组、阴性对照组及空白对照组KG1-α细胞PGI基因表达水平;CCK-8检测各组细胞增殖情况并作生长曲线.结果 PGI基因在白血病KG1-a细胞中高表达;成功构建了稳定低表达PGI的白血病细胞株(KG1-α-siPGI);低表达PGI基因的KG1-α细胞增殖能力较空白对照组明显降低,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 成功构建了低表达PGI基因的白血病KG1-α细胞株,干扰PGI基因的表达能够抑制KG1-α细胞的生长.     

慢病毒载体介导的siRNA抑制Jiyoye细胞c-myc基因表达的实验研究

目的探讨RNAi技术经慢病毒载体介导的siRNA对Jiyoye细胞c-myc基因表达的抑制作用。方法设计并合成RNA干扰序列,退火后连接到pLVX干扰载体上,构建PLVX-c-myc表达载体,经慢病毒介导转染人Jiyoye细胞株培养72 h。实验分为空白对照(未转染)、c-myc-neg、c-myc-1、c-myc-2、c-myc-3组。采用流式细胞术检测各组细胞转染率,采用real-time PCR和Western blot法检测各组细胞c-myc mRNA及蛋白表达水平的变化。结果构建pLVX-c-myc-neg、pLVX-c-myc-1、pLVX-c-myc-2、pLVX-c-myc-3重组表达载体。与c-myc-neg组相比,c-myc-1、c-myc-2和c-myc-3组c-myc mRNA及蛋白表达水平均明显下调(P<0.05),以c-myc-3组下降最显著(P<0.05)。结论成功构建c-myc shRNA表达载体,利用慢病毒介导转染Jiyoye细胞的c-myc基因表达下调,为进一步探讨沉默c-myc基因在白血病和淋巴瘤靶向治疗中的作用奠定了实验基础。     

UbcH10基因沉默联合紫杉醇干预对NCI-H226细胞增殖活性和凋亡的影响

目的观察小干扰RNA(siRNA)介导的UbcH10基因沉默联合紫杉醇处理对人肺鳞癌细胞株NCI-H226细胞增殖活性和凋亡的影响。方法化学合成针对UbcH10基因的siRNA-UbcH10序列,脂质体转染siRNA至NCI-H226细胞(siRNA转染组),转染后24 h,采用Real-Time PCR和Western blotting分别检测UbcH10 mRNA和蛋白的表达水平,以未予任何转染细胞作为空白对照,以阴性序列转染细胞作为阴性对照。以紫杉醇(1μmol/L)处理siRNA转染及未转染NCI-H226细胞(siRNA+紫杉醇组和紫杉醇组),分别于转染后24、48 h收集细胞,MTT比色法检测细胞增殖;转染后24 h收集细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡;以未经紫杉醇处理的siRNA转染、阴性序列转染和未予转染的NCI-H226细胞作为siRNA转染组、阴性对照组和空白对照组。结果Real-Time PCR和Western blotting检测结果显示:转染后24 h,siRNA转染组UbcH10 mRNA和蛋白的表达较空白对照组和阴性对照组显著下调(P0.01)。MTT比色法检测结果显示,siRNA转染组细胞增殖抑制率显著高于紫杉醇组和对照组(P0.05),而siRNA+紫杉醇组细胞增殖抑制率显著高于siRNA转染组(P0.05)。siRNA转染组细胞凋亡率显著高于紫杉醇组和对照组(P0.05),而siRNA+紫杉醇组细胞凋亡率显著高于siRNA转染组(P0.05),紫杉醇组与对照组细胞凋亡率比较差异无统计学意义(P0.05)。结论 UbcH10基因沉默可显著增强NCI-H226细胞对于化疗药物紫杉醇的敏感性。     

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白在人结肠癌中的表达及其对HT-29细胞增殖凋亡的影响

目的 探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白( mTOR)基因在人结肠癌组织中的表达及其对HT-29细胞增殖与凋亡的影响.方法 免疫组织化学方法检测磷酸化mTOR (p-mTOR),在郑州大学第一附属医院普通外科2009年10月至2010年6月50例结肠癌组织和50例正常结肠组织中的表达情况.体外合成mTOR小干扰RNA(siRNA),转染人结肠癌HT-29细胞为实验组,同时设空白对照组(不转染)及无义对照组(转染无义siRNA),Western印迹法检测各组HT-29细胞的mTOR蛋白表达;四甲基偶氮唑蓝法检测细胞增殖;原位末端标记法检测细胞凋亡.结果 结肠癌组织中p-mTOR的表达高于对照组[60％(30例)比14％(7例),P＜0.05],mTOR的表达和淋巴结转移、肿瘤的分化程度相关(r=0.311、0.427,均P＜0.05).实验组HT-29细胞mTOR的表达和细胞增殖均低于空白对照组和无义对照组(0.39±0.25比1.18±0.05、1.46±0.09,0.275±0.033比0.460±0.028、0.450±0.037,均P＜0.05);细胞凋亡指数则均高于空白对照组和无义对照组(12.33±1.53比0.33±0.31、1.67±0.58,均P＜0.05).结论 在结肠癌组织中存在mTOR高表达,mTOR siRNA对HT-29细胞mTOR基因的表达有抑制作用,能抑制HT-29细胞的增殖并促进其凋亡.     

靶向Hsp90β的siRNA对Jurkat细胞生长的抑制作用

目的 探讨RNA干扰技术沉默热休克蛋白90β(heat shock protein 90 beta,Hsp90β)基因表达对Jurkat细胞生长的抑制作用.方法 根据Hsp90β基因全长cDNA序列Hsp90B1(NM_003299.1),设计并构建针对Hsp90β基因的siRNA真核表达载体,应用LipofectamineTM LTX 转染入Jurkat细胞后,Real-time PCR检测 Hsp90β mRNA水平的变化,筛选出沉默效果最好的Hsp90β siRNA干扰片段;Western印迹法检测Hsp90β蛋白表达水平;MTT法和流式细胞仪检测干扰前后对Jurkat细胞生长抑制作用.结果 成功构建Hsp90β基因特异性的真核表达载体pSOS-Hsp90βi,转染Jurkat细胞后发现pSOS-Hsp90βi2的沉默效果最明显,Jurkat细胞Hsp90β mRNA及蛋白表达均明显降低(P<0.05).Hsp90β基因表达沉默后,Jurkat细胞增殖明显受抑(P<0.01),实验组与对照组的细胞凋亡率分别为:(2.69±0.34)%、(3.63±0.38)%、(19.56±0.62)%, 细胞凋亡率比空白对照组及转染pSOS-Hsp90βi control组明显增加,差异具有显著意义(P<0.05).结论 靶向Hsp90β的siRNA下调Hsp90β表达对人白血病Jurkat细胞有明显的生长抑制作用.     

靶向4-1BBL基因siRNA抑制HL-60B细胞生长的体外研究

目的：观察4-1BBL基因小分子干扰RNA（siRNA）对HL-60细胞生长及诱导其凋亡作用的影响。方法：化学合成法合成靶向人4-1BBL基因siRNA,脂质体转染法转染HL-60B细胞;半定量PCR和流式细胞术检测转染前后HL-60B细胞4-1BBL的表达水平,MTT法检测HL-60B细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡。结果：靶向4-1BBL基因siRNA转染HL-60B细胞后,4-1BBLmRNA和蛋白的表达明显降低;细胞增殖被抑制,其抑制作用在转染后48h最明显,增生抑制率达到（22.1±2.3）%;细胞凋亡率增加,由（9.8±2.5）%上升到（32.5±5.1）%。结论：化学合成的siRNA在体外能成功抑制靶基因4-1BBL的表达和HL-60B细胞的增殖,并有助于细胞趋向凋亡。     

肝癌癌变过程中端粒酶逆转录酶、c-myc、PCNA表达和细胞凋亡观察

目的观察肝癌癌变过程中端粒酶逆转录酶(h-TERT)、c-myc、增殖细胞核抗原(PCNA)和凋亡活性的改变,分析它们在肝癌发生发展过程中的意义。方法所用标本包括47例原发性肝细胞肝癌、52例肝炎性肝硬变及56例慢性病毒性肝炎,采用原位杂交法检测h-TERT和c-mycmRNA表达,免疫组化SP法检测PCNA表达,用3'-OH末端DNA原位标记技术进行凋亡细胞检测。结果在慢性病毒性肝炎、肝炎性肝硬变及原发性肝细胞肝癌中:h-TERT阳性表达率分别为19.6%(11/56)、82.7%(43/52)和93.6%(44/47);c-myc阳性表达率分别为12.5%(7/56)、40.4%(21/52)和55.3(26/47);凋亡细胞阳性率分别为(27.3±4.7)%、(16.5±2.6)%和(8.7±1.3)%;PCNA分别为(l7.1±2.9)%、(49.3±7.8)%和(62.5±9.1)%。h-TERT、c-myc、PCNA及凋亡细胞阳性表达率在慢性病毒性肝炎、肝炎性肝硬变及原发性肝细胞癌各组中未见相关(P>0.05)。结论肝炎及肝硬变的癌变是一个由量变到质变的过程,h-TERT和c-myc基因的过表达、PCNA升高及凋亡活性下降与肝细胞的恶性转化有关。     

Ets-1、c-myc在骨巨细胞瘤中的表达及意义

目的 探讨Ets-1、c—myc在骨巨细胞瘤中的表达与肿瘤预后复发的关系。方法 利用免疫组化SP法检测Ets-1、c—myc在30例采用刮除手术治疗的骨巨细胞瘤患者石蜡切片中的表达。结果 30例骨巨细胞瘤患者，其中复发10例，复发率33．3％。Ets-1在复发组中阳性表达5例，未复发组4例，差异无显著性。复发组与未复发组c—myc阳性表达分别为6例、4例，存在统计学差异。两者同时表达在复发组与未复发组分别为4例、1例。Ets-1和c—myc同时过表达与骨巨细胞瘤复发有关。结论 在排除手术方式影响下，c-myc表达与Ets-1、c—myc同时表达可以作为帮助评估骨巨细胞瘤预后复发的参考指标。     

c-myc癌蛋白在食管鳞癌中的表达

目的 研究ｃ－ｍｙｃ癌蛋白在食管鳞癌中的表达及意义。方法 应用免疫组化Ｓ－Ｐ法检测了３４例食管癌及其相应病例的正常食管粘膜组织标本中ｃ－ｍｙｃ癌蛋白表达与食管鳞癌临床病理特征的关系。结果 食管鳞癌组织阳性表达率为６１．７６％,正常食管组织阳性表达率为０。ｃ－ｍｙｃ癌蛋白表达与淋巴结转移有密切关系（Ｐ〈０．０５）。结论 ｃ－ｍｙｃ癌蛋白表达与食管鳞癌的生物学行为有一定相关性。     

反义c-myc重组腺病毒对人肝细胞癌细胞的实验性治疗

目的：研究携带反义c-myc的重组腺毒（Ad-Asmyc)对人肝细胞癌细胞体外,体内的治疗作用及其机制,方法：用Ad-Asmyc感染人肝细胞癌细胞系BEL－7402和QSG－7701,绘制细胞生长曲线,进行克隆形成实验,研究Ad-Asmyc在体外的抗瘤作用,在瘤内注射Ad-Asmyc,观察裸鼠皮下移植的生长情况,应用逆转聚合酶链反应（RT－PCR）及Western blot检测相关基因表达,应用流式细胞术,梯形DNA,DNA原位末端标记研究细胞周期及细胞凋亡情况,结果：感染Ad-Asmyc后,BEL－7402及PSG－7701细胞内c-myc基因表达降低,肿瘤细胞的生长受到明显抑制,而且出现了G1期阻滞及凋亡,体内注射Ad-Asmyc基因表达降低,肿瘤细胞的和长受到明显抑制,而且出现了G1期阻滞及凋亡,体内注射Ad-Asmyc后裸鼠皮下移植的生长也得到明显掏,结论：Ad-Asmyc在体外及体内可使肝细胞癌出现的细胞生长抑制,发生凋亡,具有明显的抗癌作用,是有应用前景的抗癌药物。     

皮肤鳞状细胞癌中p53、bcl-2和c-myc的表达及意义

目的 研究p53、bcl—2和c—myc在皮肤鳞状细胞癌中的异常表达及其与癌分化程度的关系。方法 应用免疫组织化学S-P法检测58例皮肤鳞状细胞癌中p53、bcl—2和c—myc的表达水平。结果 58例皮肤鳞状细胞癌中p53、bcl-2和c—myc的阳性表达率分别为48．3％、67．2％和32．8％。结论 p53、bcl—2和c—myc异常表达在皮肤鳞状细胞癌的发生、发展中起重要作用，并与皮肤癌的恶性程度有关。     

c-myc的反义寡核苷酸抑制血管平滑肌细胞增殖的研究

目的探讨ｃ－ｍｙｃ的反义寡核苷酸抑制培养大鼠血管平滑肌细胞增殖的研究。方法　贴壁法培养血 管平滑肌细胞,将不同浓度的反义及正义寡核苷酸加入培养液,观察对血管平滑肌细胞增殖的作用。结果５μｇ／ｍｌ ｃ－ｍｙｃ的反义寡核苷酸加入培养液后第 ５、７天抑制血管平滑肌细胞增殖,１５μｇ／ｍｌ ｃ－ｍｙｃ的反义寡核苷酸加入培养液 后第３、５、７天抑制血管平滑肌细胞增殖。各浓度ｃ－ｍｙｃ的正义寡核苷酸未发现其抑制血管平滑肌细胞增殖。结论 ｃ－ｍｙｃ的反义寡核苷酸抑制培养大鼠血管平滑肌细胞增殖。     

携带Oct4、Klf4、Sox2、c-myc和EGFP基因小鼠肿瘤细胞株的建立

目的构建稳定携带Oct4、Klf4、Sox2、c-myc(以下简称为OKSM)和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因的小鼠肿瘤细胞株。方法将载体pLentG-KOSM用NotI、XbaI线性化,并进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR),以鉴定其结构。按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;携带OKSM和EGFP基因的慢病毒感染小鼠肝癌细胞(Hep1-6)、小鼠乳腺癌细胞(4T1)和小鼠肺癌细胞(LLC),以建立相应病毒感染体系。结果 pLentG-KOSM确实含有OKSM4种基因,按标准程序生产的携带OKSM和EGFP基因的慢病毒上清高效率感染Hep1-6、4T1及LLC,成功建立稳定携带OKSM和EGFP基因的小鼠肿瘤细胞株。结论成功构建携带OKSM和EGFP基因的Hep1-6、4T1、LLC细胞株,为相关的后续研究打下了良好基础。     

涎腺肿瘤中增殖细胞核抗原,bcl-2,c-myc与细胞凋亡关系的研究

目的：探讨涎腺肿瘤中细胞凋亡及其调控基因bcl-2,c-myc及增殖细胞核抗原（PCNA）间的关系，方法：采用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）技术，免疫组织化学染色和HE染色对18例多形性腺瘤和52例恶性涎腺肿瘤中细胞凋亡和PCNA，bcl-2,c-myc蛋白表达进行观察和比较。结果：恶性涎腺肿瘤的凋亡细胞指数和增殖细胞指数明显高于多形性腺瘤（P＜0．05），恶性涎腺肿瘤中bcl－2和c-myc蛋白表达率和表达强度明显高于多形性腺瘤（P＜0．05），结论：细胞凋亡和调控基因异常在涎腺肿瘤中可能起重要作用，在涎腺肿瘤中，bcl-2和c-myc蛋白的共同作用可抑制细胞凋亡。     

PTTG,c-myc和p53在非小细胞肺癌中的表达及意义

目的:探讨非小细胞肺癌(NSCLC)中PTTG,c-myc和p53的表达及其与NSCLC发生发展之间的关系。方法:用免疫组化法测定60例NSCLC标本及27例正常肺组织中PTTG,c-myc和p53的表达。结果:NSCLC组织细胞中PTTG,c-myc和p53的阳性表达率明显高于正常肺组织(P<0.01)。在不同组织学类型间阳性表达率差异无统计学意义(P>0.05),PTTG和c-myc在不同分化程度肺癌间的阳性表达率差异有统计学意义(P<0.05),淋巴结是否转移PTTG和c-myc的阳性表达率差异也有统计学意义(P<0.05)。PTTG与c-myc,PTTG与p53阳性表达率呈显著正相关(P<0.01),c-myc与p53阳性表达率也呈显著正相关(P<0.05)。结论:PTTG,c-myc和p53在NSCLC中有较高表达,有可能作为评估预后、指导治疗的指标。     

食管癌和淋巴结转移组织中c-myc,hTERT和c-MET蛋白的表达

目的:探讨食管癌和淋巴结转移组织中c-myc、hTERT和c-MET的表达.方法:利用组织微阵列技术,采用免疫组化ABC法,测定58例食管癌及其相应的癌旁组织、8例转移淋巴结组织中c-myc、hTERT和c-MET的表达.结果:癌旁、癌及淋巴结转移组织中c-myc阳性率分别为7%,66%,75%;hTERT阳性率分别为0%,48%,75%;c-MET阳性率分别为7%,34%,75%;癌旁和癌组织间c-myc和hTERT的表达差异有统计学意义(P＜0.05),癌旁和癌组织间,以及癌和淋巴结转移灶之间c-MET的表达差异均有统计学意义(P＜0.05).食管癌组织中c-myc与hTERT的表达呈正相关(r=0.411,P=0.002),c-myc与c-MET的表达不相关(r=0.211,P=0.146).结论:c-myc、hTERT和c-MET的高表达可能与食管癌发生发展相关,c-myc可能参与了hTERT的激活过程,c-MET的高表达可能参与了食管癌淋巴结的转移过程.