高糖状态下肾小管上皮细胞肌肌醇加氧酶表达变化对TGF-β1表达的影响

目的:探讨高糖状态下肌肌醇加氧酶(MlOX)表达变化对肾小管上皮细胞TGF-β1表达的影响.方法:①在体外培养大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E.应用不同浓度高糖刺激NRK-52E细胞48 h,观察MIOX、TGF-β1 mRNA和蛋白表达的改变;②观测不同浓度TGF-β1刺激NRK-52E细胞48 h后MIOX mRNA和蛋白表达的变化;③应用针对MIOX基因的ASODN干涉NRK-52E细胞抑制MIOX基因表达后再用高糖刺激.观测其对TGF-β1 mRNA和蛋白表达的影响.结果:①不同浓度(15、30mmol/L)高糖刺激NRK-52E细胞48 h后MIOX、TGF-β1 mRNA和蛋白表达增加;②不同浓度(1、5、10、25 mmol/L)TGF-β1刺激NRK-52E细胞48 h后MIOX mRNA和蛋白表达无明显变化;③针对MIOX基因的ASODN干涉NRK-52E细胞使MIOX基因表达下降.同时NRK-52E细胞TGF-β1 mRNA和蛋白的表达也下降.结论:本研究结果提示,高糖刺激肾小管上皮细胞能使MIOX、TGF-β1 mRNA和蛋白表达增加,而且MIOX表达异常可能通过影响细胞因子TGF-β1的表达在糖尿病肾病中起作用.     

siRNA沉默CTGF表达对高糖诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的探讨针对结缔组织生长因子(CTGF)基因的siRNA对高糖条件培养下的人肾小管上皮细胞株HK-2细胞向间充质细胞转分化(EMT)的影响。方法将体外培养的HK-2细胞分为6组:(1)正常对照组,培养基含D-葡萄糖1g/L;(2)等渗对照组,培养基含D-葡萄糖1g/L,甘露醇3.5 g/L;(3)高糖组,培养基含D-葡萄糖4.5 g/L;(4)高糖+空白对照组:细胞转染空白质粒后于高糖培养基中培养;(5)高糖+阴性对照组:细胞转染含无关序列的重组质粒后于高糖培养基中培养;(6)高糖+干扰组:细胞转染针对CTGF的siR-NA表达质粒后于高糖培养基中培养。应用RT-PCR检测CTGF mRNA水平,Western blot法检测CTGF、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白水平。结果高糖刺激可上调HK-2细胞的CTGFmRNA及蛋白水平,并呈时间依赖性降低HK-2细胞的E-cadherin蛋白表达水平,升高α-SMA蛋白表达水平。而通过特异性siRNA抑制CTGF mRNA表达后,细胞的CTGF蛋白表达随时间延长进行性降低,同时伴有细胞E-cadherin蛋白表达升高,α-...     

针对CTGF的siRNA对高糖诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的 探讨针对结缔组织生长因子（CTGF）基因的siRNA对高糖条件培养下的人肾小管上皮细胞株HK-2细胞向间充质细胞转分化（EMT）的影响。方法 将体外培养的HK-2细胞分为6组：(1)正常对照组,培养基含D-葡萄糖1g/L;(2)等渗对照组,培养基含D-葡萄糖1g/L,甘露醇3.5g/L;(3)高糖组组,培养基含D-葡萄糖4.5g/L;(4) 高糖+空白对照组：细胞转染空白质粒后于高糖培养基中培养;(5) 高糖+阴性对照组：细胞转染含无关序列的重组质粒后于高糖培养基中培养;(6) 高糖+干扰组：细胞转染针对CTGF的 siRNA表达质粒后于高糖培养基中培养。应用RT-PCR检测CTGF mRNA水平,Western blot法检测CTGF、E-钙黏蛋白（E-cadherin）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）蛋白水平。结果 高糖刺激可上调HK-2细胞的CTGF mRNA及蛋白水平,并呈时间依赖性降低HK-2细胞的E-cadherin蛋白表达水平,升高α-SMA蛋白表达水平。而通过特异性siRNA抑制CTGF mRNA表达后,细胞的CTGF蛋白表达随时间延长进行性降低,同时伴有细胞E-cadherin蛋白表达升高,α-SMA蛋白表达水平降低。结论 证实了CTGF是高糖诱导HK-2细胞EMT的重要介质。针对CTGF的siRNA能明显改善高糖诱导的肾小管上皮细胞EMT,为进一步寻找DN防治的靶点提供了新的实验依据。     

高糖环境肾小管上皮细胞Smad1的表达

目的模拟糖尿病条件,观察人肾小管上皮细胞(HK-2)生长情况和Smad1表达的变化,探讨高糖对肾小管上皮细胞的损伤机制。方法用DMEM/F12细胞液培养HK-2细胞,分为对照组,中糖组(12.5mmol/L葡萄糖),高糖组(25mmol/L葡萄糖),分别培养24h、48h、72h后倒置显微镜下观察HK-2的形态和数量变化,采用蛋白印迹技术检测Smad1的蛋白表达。结果高糖组刺激72h后,与对照组相比HK-2细胞数为(105.333±6.429)×105/m L,而对照组HK-2细胞数为(50.333±2.51)×105/m L,差异有统计学意义(P<0.01);高糖组HK-2细胞形态改变,Smadl蛋白表达明显增加。结论高糖能够诱导肾小管上皮细胞数量及形态发生改变,并且这一作用可能与Samd1表达增加有关。     

白细胞介素-10对肾小管上皮细胞转分化的影响

目的研究白细胞介素-10（interleukin-10,IL-10）对高糖诱导的人近端肾小管上皮细胞（HK-2细胞）转分化（epithelial to mesenchymal transition,EMT）的影响。方法将培养的HK-2细胞通过完全随机设计分为5组：①对照组：5．5mmol／L的D-葡萄糖组;②高糖组：30mmol／L的D-葡萄糖组;③30mmol／L的D-葡萄糖＋1ng／ml IL-10组;④30mmol／L的D-葡萄糖＋5ng／ml IL-10组;⑤30mmol/L的D-葡萄糖＋25ng／ml IL-10组。培养48h后,RT-PCR法检测各组细胞CTGF mRNA的表达;免疫细胞化学法和Western blot法检测各组细胞α-SMA的表达;ELISA法检测各组细胞FN的分泌。结果在高糖中加入1、5、25ng／ml的IL-10作用后,与高糖组相比HK-2细胞CTGF、α-SMA和FN表达减少,且均有统计学差异（P〈0．05）。结论IL—10可以抑制高糖环境下的。肾小管EMT。     

高糖刺激对大鼠近端肾小管上皮细胞脂联素受体表达的影响

目的:观察体外高糖环境下大鼠近端肾小管上皮细胞脂联素受体基因及其蛋白表达变化。方法:正常大鼠近端肾小管上皮细胞细胞株(NRK-52E)常规培养于含10%灭活新生胎牛血清的低糖DMEM培养液传代培养,待细胞生长至亚融合状态时,更换为无胎牛血清低糖DMEM培养基培养24h使其同步化,将NRK-52E细胞分为5组:A组为正常对照组,低糖DMEM完全培养液(含D-葡萄糖5.5mmol/L);B组为高糖刺激12h组:高糖DMEM完全培养液(含D-葡萄糖25mmol/L)刺激12h;C组为高糖刺激24h组:高糖DMEM完全培养液刺激24h;D组为高糖刺激48h组:高糖DMEM完全培养液刺激48h;E组为高糖刺激72h组:高糖DMEM完全培养液刺激72h。然后分别提取各组总RNA和总蛋白,分别用RT-PCR检测各组目的基因AdipoR 1/2mRNA的表达,Western印迹法检测各组目的蛋白AdipoR 1/2蛋白的表达。结果:脂联素受体1(AdipoR1)和脂联素受体2(AdipoR2)在NRK-52E细胞中均有表达;在高糖刺激情况下,随着刺激时间的延长,目的基因AdipoR 1/2mRNA的表达均有先增高后降低的趋势,在刺激24h时升高到最高点,和对照组相比有统计学意义(P<0.05);与正常对照组相比,高糖刺激后各时间点AdipoR 1/2蛋白的表达有上升的趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论:NRK-52E细胞AdipoR1/2蛋白的表达不受高糖刺激的影响;高糖影响NRK-52E细胞AdipoR1/2mRNA的表达,并随着刺激时间的延长表现出先增高后降低。高糖通过影响脂联素受体基因的表达从而影响脂联素发挥其生物学作用,以致影响大鼠近端肾小管上皮细胞的功能。     

肌醇加氧酶在糖尿病肾病发病机制中的作用

[目的]研究高糖环境下大鼠肾近曲小管上皮细胞肌醇加氧酶（myoinositol oxygenase,MIOX）的表达及糖尿病肾病大鼠体内肌醇耗竭的机制。[方法]体外培养大鼠近曲肾小管上皮细胞株（NRK-52E）,将其分为正常对照组（NG）、高糖组（HG）和渗透浓度对照组（MG）,并分别于12、24、48、72h应用RT—PCR法检测MIOX的mRNA表达,免疫荧光细胞化学法检测其蛋白的表达。[结果]HG组MIOXmNA与蛋白表达水平在12h出现升高,二者分别在24h与48h达高峰。NG组的MIOXmRNA及蛋白表达水平各时间点差异无显著性意义（P〉0．05）;与NG组和MG组相比,HG组MIOX的mRNA及蛋白表达均明显升高（P〈0．01）。MG组明显高于NG组（P〈0．05）。[结论]高糖能促进大鼠肾近曲小管上皮细胞肌醇加氧酶（MIOX）的表达,并可能通过MIOX的形成增加介导肌醇的耗竭,提示MIOX参与了糖尿病肾病的发生发展。     

氯沙坦对高糖诱导大鼠肾近端小管上皮细胞纤溶酶原激活物及其抑制物表达的影响

目的 研究高糖对正常大鼠肾近端小管上皮细胞纤溶酶原激活物(tPA和uPA)及其抑制物-1(PAI-1)表达的影响,并探讨血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂氯沙坦对其改善作用.方法 培养大鼠肾近端小管上皮细胞,并分组为正常对照组、甘露醇组(5 mmol/L D-葡萄糖 25 mmol/L 甘露醇)、高糖组(30 mmol/L D-葡萄糖)、氯沙坦组(10-3 mmol/L氯沙坦)、高糖 氯沙坦组(30 mmol/L D-葡萄糖 10-3 mmol/L氯沙坦).RT-PCR法检测各组细胞tPA、uPA及PAI-1 mRNA表达. 结果与正常对照组比较,高糖组肾小管上皮细胞tPA和uPA mRNA表达下降(P＜0.01), PAI-1 mRNA表达增加(P＜0.01);氯沙坦可部分逆转高糖的作用,高糖加氯沙坦组tPA、uPA表达分别是高糖组的2.06倍、1.69倍(P＜0.01),PAI-1表达为高糖组的44% (P＜0.01). 结论高糖可使肾近端小管上皮细胞PA/PAI-1 mRNA异常表达, 氯沙坦可以在肾小管中通过维持PA/ PAI-1的平衡,对糖尿病肾病防治起一定的作用.     

去甲斑蝥素对高糖刺激的HK-2 细胞FN,Col IV 和TGF-β1 mRNA 及蛋白表达的影响

目的:观察去甲斑蝥素(NCTD) 对高糖刺激的HK-2 细胞外基质和TGF-β1 表达的影响。方法:常规培养HK-2 细胞,无血清DMEM 培养基同步培养24 h,细胞分为正常葡萄糖组(C,D-glucose 5.5 mmol/L)、甘露醇对照组(M,5.5 mmol/L D-glucose+24.5 mmol/L mannitol)、高糖组(HG,30 mmol/L D-glucose)、高糖+NCTD 干预组(30 mmol/L D-glucose+0.5~40 mg/L NCTD)。台盼蓝排斥实验检测NCTD 对高糖刺激的细胞毒性。MTT 法检测NCTD 对高糖刺激的细胞增殖的影响。收集培养6,24,48 h 后细胞总RNA 及蛋白,用RT-PCR 检测细胞FN,Col Ⅳ和TGF-β1 mRNA 的表达,采用Western 印迹检测FN,Col Ⅳ和TGF-β1 蛋白的表达。结果:不同浓度NCTD 作用72 h 后,浓度超过5 mg/L 的NCTD 对高糖环境下的HK-2 细胞有明显的毒性。RT-PCR 和Western 印迹结果显示: 30 mmol/L D- 葡萄糖可引起HK-2 细胞FN,Col Ⅳ和TGF-β1 mRNA 及蛋白水平的升高(P<0.05),而5 mg/L NCTD 可抑制高糖刺激的FN,Col Ⅳ和TGF-β1 的表达(P<0.05)。相同渗透浓度的D- 甘露醇组对上述指标均无影响(P>0.05)。结论:NCTD 能下调HK-2 细胞FN,Col Ⅳ及TGF-β1 的表达。     

法舒地尔对高糖培养肾小管上皮细胞增殖和纤维化的影响#br#

目的：探讨法舒地尔（Fasudil）对高糖培养的肾小管上皮细胞（HK-2）增殖和纤维化的影响。方法：将HK-2细胞分为正常对照组（NG组,葡萄糖浓度5.5 mmol/L）、高张组（HM组,葡萄糖浓度5.5 mmol/L+甘露醇54.5 mmol/L）、高糖组（HG组,葡萄糖浓度60 mmol/L）、高糖+小剂量法舒地尔干预组[FA（5）组,D-葡萄糖60 mmol/L+法舒地尔5μmol/L]、高糖+中剂量法舒地尔干预组[FA（10）组,D-葡萄糖60 mmol/L+法舒地尔10μmol/L];⑥高糖+大剂量法舒地尔干预组[FA（20）组,D-葡萄糖60 mmol/L+法舒地尔20μmol/L]。四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定HK-2细胞增殖;免疫共沉淀法检测p-MYPT1-Thr853;Western印迹法检测结缔组织生长因子（CTGF）的表达;ELISA法检测细胞培养上清液转化生长因子β1（TGF-β1）和纤维连接蛋白（Fn）的含量。结果：与NG组比,HG组HK-2细胞出现增殖增加,p-MYPT1-Thr853、TGF-β1、CTGF和Fn的表达增加。与HG组比,FA（5）组、FA（10）组、FA（20）组均抑制了HK-2细胞的过度增殖,p-MYPT1-Thr853、TGF-β1、CTGF和Fn的表达均减少。结论：法舒地尔可能通过抑制Rho激酶活性抑制高糖培养的肾小管上皮细胞增殖和纤维化。