甲状腺球蛋白抗原决定簇基因的克隆及原核表达载体的构建

目的：扩增甲状腺球蛋白抗原决定簇基因，构建可转化人大肠杆菌的重组表达载体。方法：用TRIzol一步法从甲状腺组织中提取总RNA，RT—PCR逆转录出cDNA，PCR扩增出目的基因，与pET102／D—TOPO载体进行拓扑克隆．对重组质粒进行PCR、酶切及测序鉴定。结果：甲状腺球蛋白抗原决定簇基因及其重组表达载体经鉴定准确无误。结论：成功构建了带有目的基因的原核表达载体。     

庚型肝炎病毒NS3区抗原基因的原核表达

目的 建立检测HGV抗体酶联免疫吸附试验(ELISA)的方法。方法 选取HGVNS3区具有较强免疫原性的C17抗原基因，构建原核表达质粒．在大肠杆菌中进行诱导表达。结果 C17抗原基因获得了正确而高效的表达，经纯化、复性后建立的ELISA技术与RT—PCR法同时检测血清标本．其灵敏度和特异度分别为40％和98．4％．检测结果一致率为82．2％。联合包被另外两种非结构区蛋白(NS4，NS5)．可使灵敏度提高到60％．而保持一定的特异度。结论 该方法检测HGV抗体可靠，可作为临床应用。     

HBV基因T1862突变真核表达载体的构建及在Cos7细胞中的表达

目的：研究HBVT1862变异的生物学意义。方法：采用分子生物学方法,构建HBV前C/C基因EB病毒真核表达载体,利用体外定点突变技术诱导前C/C基因T1862变异经PCR-RFLP初筛并经测序终鉴定出阳性克隆后,以脂质体介导方法将突变前后的重组质粒转染Cos7细胞,以ELISA检测HBeAg的表达量。结果：未突变的重组质粒可稳定表达HBeAg,突变后的重组质粒未能检测到HBeAg表达。结论：HBV前C/C基因1862点突变的真核表达载体的构建,为体外研究该点突变引起HBV的一系列生物学改变奠定基础。     

重叠PCR合成乙型肝炎病毒核心抗原基因及其在大肠杆菌中表达

目的：构建乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）基因的融合表达质粒并在原核系统表达,为治疗性疫苗的研制奠定基础。方法：根据大肠杆菌偏爱密码子,利用Synthetic Gene Designer软件对HBcAg基因进行密码子优化,分成24条长约40bp寡核苷酸片段,将重叠PCR合成的HBcAg基因插入到pET30a中,经限制性核酸内切酶酶切鉴定和核酸序列分析无误后转化BL21（DE3）中,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表达情况。结果：酶切和测序鉴定表明,成功构建了重组质粒pET30a／rmcAg,SDS—PAGE分析显示目的蛋白以包涵体的形式在大肠杆菌中获得高表达,表达量占总菌体蛋白的64．3％。结论：应用重叠PCR合成HBcAg基因并在大肠杆菌中获得了高效表达。     

HBV 基因T1862突变真核表达载体的构建及在Cos7细胞中的表达

目的研究HBV T1862变异的生物学意义。方法采用分子生物学方法,构建HBV前C/C基因EB病毒真核表达载体,利用体外定点突变技术诱导前C/C基因T1862变异,经PCR-RFLP初筛并经测序终鉴定出阳性克隆后,以脂质体介导方法将突变前后的重组质粒转染Cos7细胞, 以ELISA 检测HBeAg的表达量。结果未突变的重组质粒可稳定表达HBeAg,突变后的重组质粒未能检测到HBeAg表达。结论 HBV前C/C基因1862点突变的真核表达载体的构建,为体外研究该点突变引起HBV的一系列生物学改变奠定基础。     

乙型肝炎病毒核心抗原在大肠杆菌中的构建及表达

目的:用基因工程的方法对乙型肝炎病毒核心抗原在大肠杆菌中的构建及表达进行分析与探讨。方法:利用ELISA方法,使得HBcAg基因片段扩增,构建含有HBcAg基因的表达质料与克隆质粒,以IPTG诱导大肠杆菌BL21(DE3)plys中蛋白的重组表达,并且,采用酶联免疫测定方法检测重组蛋白。结果:在大肠杆菌中,重组HBcAg得到表达,经过酶联免疫测定方法检测,在预期位置显示有特异性条带。结论:采用基因工程的方法对乙型肝炎病毒核心抗原在大肠杆菌中的构建及表达,成功构建了HBcAg原核表达系统,并获取重组HBcAg,有效地推进了重组蛋白的相关功能研究,具有很高的研究推广价值。     

乙型肝炎病毒全-X基因的克隆及原核表达

目的:构建乙型肝炎病毒全-X基因原核表达载体并在细菌中表达、纯化. 方法:利用基因重组技术,将全-X基因定向克隆于原核表达载体pET-32a( )多克隆位点中,限制性酶切和测序鉴定. 细菌表达产物及纯化后的产物经SDS-PAGE和Western免疫印迹分析. 结果:经限制性酶切分析及测序鉴定,证实成功构建全-X原核表达质粒. SDS-PAGE和Western免疫印迹分析表明重组质粒在大肠杆菌中表达. 结论:本研究将全-X基因定向克隆于原核表达载体,并在大肠杆菌中成功表达、纯化. 为进一步研究全-X的功能及制备相应抗体奠定了基础.     

ZNF580基因原核表达载体的构建与鉴定

【目的】构建ZNF580基因原核表达载体,为获得大量重组ZNF580蛋白并制备其多克隆抗体奠定基础。【方法】根据ZNF580cDNA序列的开读框架设计上、下游引物,利用PCR技术扩增ZNF580开放阅读框cD-NA序列,将PCR扩增的目的片段与载体pET30a分别双酶切、回收纯化后做定向连接,EcoRI、XhoI双酶切电泳筛选、鉴定并测序。【结果】双酶切pET30a-ZNF580,电泳分析插入片段长度为524 bp,与预期的结果一致,经连接点两端进行测序,测序结果显示接头两端序列连接正确。【结论】成功构建原核表达载体pET30a-ZNF580。     

乙型肝炎病毒X基因真核表达的载体构建及鉴定

目的:构建HBV X基因与pCDNA3.1相融合的高效真核表达载体,为进一步研究HBV X基因的功能奠定基础。方法:设计并合成HBV X基因的引物,以HBV DNA阳性血清PCR扩增得到HBV X基因全序列;将X基因连接到真核表达载体pCDNA3.1上后,酶切图谱分析、PCR检测和扩增产物序列分析等,鉴定所构建的真核表达载体。结果:以重组载体为模板扩增得到的片段大小与已知HBV X基因大小相同,酶切也得到目的基因片段,测序结果也显示与已知X基因序列相同。结论:成功构建了HBV X基因的真核表达载体,为进一步研究HBVX基因及其产物的功能奠定了基础。     

乙型肝炎病毒X基因cDNA的克隆及真核表达载体的构建

目的为研究HBVX基因（HBx）与原发性肝细胞癌发生的关系，克隆HBx的cDNA并构建HBx真核表达载体。方法 利用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）方法从HepG2．2．15细胞中扩增出HBx的cDNA，克隆到质粒PCDNA3．1中。结果RT—PCR扩增出约460bp片段，经酶切鉴定显示HBx的cDNA真核表达载体（HBx—PCDNA3．1）构建成功，测序结果显示HBx的cDNA与已发表的的序列相同。结论成功地构建了HBx的真核表达载体HBx—PCDNA3．1。     

Eotaxin原核表达载体的构建及初步表达

目的：获得人嗜酸性粒细胞趋化因子Eotaxin基因，构建其原核表达载体，并初步表达成熟的Eotaxin，为进一步构建其N-端突变体，检测其生物学活性作准备。方法：提取外周血单个核细胞细胞总RNA，经RT-PCR扩增编码人Eotaxin全长cDNA序列，并将其克隆至T载体进行序列测定，然后构建于原核表达载体pET30a^＋中，并转入大肠杆菌表达。结果：RT-PCR扩增得到了400bp左右的DNA片段，序列分析发现其中包含了GenBank中报道的编码EotaxincDNA序列，并获得了正确表达。结论：EotaxincDNA的克隆及其原核表达载体的构建及表达，为进一步构建其N-端突变体，纯化和检测其生物学活性奠定了基础。     

大鼠DJ-1原核表达载体的构建与初步表达

目的:构建一个能表达大鼠DJ-1的高效大肠杆菌表达载体并作初步表达.方法:先建立一个可以诱导表达DJ-1的大鼠动物模型,然后提取其mRNA,采用RT-PCR的方法扩增出DJ-1基因,经T载体连接,双酶切,测序鉴定后将DJ-1基因转入PQE30的高效E. coli表达体系.结果:PCR扩增出约600bp的基因片段,重组克隆了T-easy/DJ-1载体,并测序正确,构建了PQE30/DJ-1表达载体并表达,最终获得约21kD的目的蛋白质.结论:DJ-1基因原核表达载体的构建及其融合蛋白的制备,为进一步研究DJ-1蛋白的功能及在神经细胞中的保护效应奠定了基础.此蛋白也可进一步用于抗体制备、免疫鉴定和诊断等研究.     

重组乙肝表面抗原真核表达质粒的构建及表达

采用限制性内切酶从重组的真核表达质粒pcDNA-S2S中分离出经过测序鉴定的乙肝表面抗原中蛋白（preS2 S)基因片段,将其亚克隆于pVAX1真核表达载体,构建编码乙肝表面抗原中蛋白的卡那霉素抗性真核表达质粒pVAX-S2S,酶切鉴定后将重组质粒体外转染COS7细胞,ELISA法检测上清液中的HBsAg呈阳性,说明重组质粒pVAX-S2S在体外能够有效表达HBsAg,为进一步的体内免疫反应打下基础。     

凋亡素原核表达载体的构建和表达

目的 构建凋亡素原核表达系统，以制备抗原物质凋亡素融合蛋白。方法 通过PCR方法，以pcDNA-VP3质粒为模板，扩增出凋亡素VP3基因。将其克隆到原核表达载体pET-DsbA的多克隆位点，构建成凋亡素的高效原核表达栽体pET-DsbA-VP3，将该质粒转化到大肠杆菌E．coliBL21(DE3)plysS中，以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside，IPTG)对其进行诱导表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳分析目的蛋白。结果 转化有凋亡素原核表达载体pET-DsbA-VP3的大肠杆菌E．coliBL21(DE3)plysS经IPTG诱导后，聚丙烯酰胺凝胶电泳出现38300的目的蛋白条带。结论 凋亡素原核表达栽体pET-DsbA-VP3能高效表达出凋亡素融合蛋白。     

人肥胖基因的克隆与原核表达载体的构建

目的：克隆人肥胖基因瘦素蛋白（leptin）编码区cDNA序列，并构建其原核表达载体。 方法：在人体脂肪组织中提取mRNA，利用RT-PCR扩增人肥胖基因，将其插入pMD18-T载体，经双酶切、鉴定后将肥胖基因片段亚克隆入pET-28a表达载体，提取质粒。将阳性重组质粒转化表达受体菌E.coliBL21(DE3)，经IPTG诱导肥胖基因表达产物,以聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测产物蛋白。 结果：经测序证实获得的肥胖基因序列与相关文献报道一致，其表达产物的相对分子质量约为20 000。 结论：利用pMD18-T克隆载体和pET-28a表达载体可以有效地在原核生物中表达重组人类瘦素蛋白。     

mFSHR基因N端片段的序列分析、原核表达载体构建及其表达

目的：克隆小鼠卵泡刺激素受体（FSHR）基因N-端部分片段（28—90aa）（mFSHRn）;预测其编码蛋白作为候选避孕疫苗的可行性;构建原核表达重组质粒,并在大肠杆菌中表达。方法：提取小鼠睾丸组织总RNA,利用逆转录．聚合酶链反应（RT—PCR）技术反转录成cDNA,按照GeneBank中小鼠FSHRN．端序列设计引物,扩增基因片段并插入pET32a载体,测序鉴定后做生物信息学分析;质粒转化E．coli BL21（DE3）感受态菌株诱导表达蛋白。结果：扩增片段长度为186bp,测序结果与预期结果完全一致,生物信息学分析其编码蛋白具有良好的抗原性;重组原核表达质粒经鉴定获得正确重组子并诱导表达。结论：mFSHRn蛋白可作为良好的候选避孕疫苗,成功构建了pET32a—mFHSRn原核表达重组质粒,获得可表达mFHSRn的大肠杆菌菌株,为后续的相关研究奠定了基础。     

尤文肉瘤EWS-FLI1基因原核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建尤文肉瘤EWS-FLI1基因原核表达质粒.方法:从人尤文肉瘤A673细胞中提取总RNA,以RT-PCR法扩增EWS-FLI1基因序列,目的基因两侧引入Sac Ⅰ和HindⅢ酶切位点,克隆至pMD18-T载体中,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆作PCR鉴定、酶切鉴定及测序鉴定.再将EWS-FLI1基因亚克隆至原核表达载体pQE30中,构建重组原核表达质粒pQE30-EWS-FLI1,酶切及测序鉴定.所构建的重组质粒转化JM109,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE电泳后转印到NC膜上,进行Western blot鉴定.结果:PCR结果显示扩增片段大小约为1.5 kb,双酶切鉴定目的基因片段大小约为1.5 kb,阳性克隆测序结果显示目的基因序列与预期相同.所构建重组质粒在大肠杆菌中表达出与预期大小相符的54 kD蛋白,经鉴定系EWS-FLI1蛋白.结论:成功构建了pQE30-EWS-FLI1,并进行了原核表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

人β-防御素-3基因定点突变,原核表达载体构建和融合蛋白表达

目的:利用PCR技术对人β-防御素-3基因进行定点突变,将突变后的基因连接入pGEX-4T-1表达载体.方法:采用PCR体外定点突变技术,设计两对引物,引入一个突变点,通过重叠延伸法进行两次PCR扩增,使人β-防御素-3基因第27位密码子由GAG突变为CGA,将突变后的片段克隆入pGEX-4T-1质粒中,转化至E.coli BL21,对鉴定含有目的片段的克隆进行测序.结果:获得预期大小的突变产物,经序列鉴定证实为突变的人β-防御素-3基因. 将诱导后的菌体进行SDS-PAGE电泳,在Mr31 000处可见明显的高表达带.结论:获得突变型人β-防御素-3基因,构建了表达载体,融合蛋白得到表达,为基因工程制备肽类抗生素奠定了基础.     

人BAFF cDNA的克隆及原核表达载体的构建

目的 克隆人BAFF（B cell activating factor belonging to the TNF family)全长及128－285片段的cDNA并构建其原核表达载体，为表达和检测其生物学活性做准备。方法 提取HL－60细胞总RNA，经RT－PCR扩增编码人BAFF全长及128－285氨基酸残基的cDNA序列，并将其克隆至载体pUC18和pUC19进行序列测定，然后构建于新型原核表达载体pQE-80L中。结果 RT－PCR扩增得到了858bp和477bp的DNA片段，序列分析与GenBank中报道的编码BAFF全长及128－285氨基酸残基的cDNA序列完全一致。结论 BAFF cDNA的克隆及其原核表达载体的构建，为进一步表达和检测其生物学活性奠定了基础。     

人可溶性TRAIL cDNA的克隆及新型原核表达载体的构建

目的 克隆人可溶性TRAIL（sTRAIL)cDNA并构建其原核表达载体，为制备新型抗癌分子创造条件。方法 提取HL－60细胞总RNA，经RT－PCR扩增编码人TRAIL114－281氨基酸残基的cDNA序列，将其克隆至pUC19进行序列测定，然后构建于新型原核表达载体pQE-80L中。结果 RT－PCR扩增得到了504bp的DNA片段，序列分析表明与GeneBank中报道的编码人TRAIL 114－281氨基酸残基的cDNA序列安全一致。结论 sTRAIL cDNA的克隆及其原核表达载体的构建，为进一步制备具有抗肿瘤活性的sTRAIL奠定了基础。