耐药相关新基因HA117的克隆及重组腺病毒制备

目的:构建表达耐药相关新基因HA117的重组腺病毒表达系统.方法:用基因工程技术将耐药相关新基因HA117的cDNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,然后在细菌内与pAdEasy同源重组,将重组腺病毒Ad5-HA117经脂质体转染293细胞包装、扩增腺病毒颗粒,通过荧光显微镜及流式细胞仪进行检测.结果:酶切鉴定及PCR结果证明耐药相关新基因HA117重组腺病毒载体构建成功,构建的耐药新基因HA117重组腺病毒载体的效价达到8.3×1011PFU/ml.结论:成功构建了表达ATRA相关耐药新基因HA117的重组腺病毒载体,为后续对HA117基因的相关研究奠定了基础.     

腺病毒介导的新基因HA117对Jurkat细胞多药耐药功能的影响

目的 研究新基因HA117对急性淋巴细胞白血病细胞Jurkat耐药性的影响,探讨新基因HA117多药耐药(muhidmg resistance,MDR)相关功能.方法 以携带HA117基因的重组腺病毒Ad5-HA117感染Jurkat细胞得到高表达HA117基因的细胞Jurkat/HA117,以荧光显微镜和流式细胞术检测细胞感染效率,RT-PCR检测感染前后实验细胞HA117基因表达,MTT检测比较高表达HA117基因前后Jurkat细胞药物敏感性变化.结果 新基因HA117可使Jurkat细胞对多种化疗药物耐药性增强,转染AdS-HA117重组腺病毒的Jurkat细胞对VCR、ADM、Vp-16、DNR、MMC、CTX药物的药物耐受性均比未转染的Jurkat细胞增高,增高3～7倍(P<0.05,P<0.01),转染空载体组耐药性跟未转染的Jurkat细胞相比无显著差异(P>0.05).结论 新基因HA117可使Jurkat细胞的耐药功能增加,证实新基因HA117具有多药耐药功能.     

新基因HA117最佳siRNA的筛选及重组腺病毒构建

目的 验证pSOS-HUS筛选目的 基因最佳siRNA的效果,应用pSOS-HUS筛选新基因HA117最佳siRNA,构建携带HA117基因最佳siRNA转录模板DNA的重组腺病毒.方法 构建携带HA117基因及其siRNA模板DNA链的双克隆质粒.把双克隆质粒分别转染293细胞,通过镜下观察、流式细胞仪检测比较绿色荧光表达强度,RT-PCR检测HA117基因mRNA表达,筛选鉴定基因HA117最佳siRNA.构建HA117基因RNA干扰重组腺病毒.结果 从5对模板DNA链中筛选出最有效片段HAi5,构建携带HAi5的重组腺病毒.结论 载体pSOS-HUS可快捷有效地筛选目的 基因的最佳siRNA;在5对模板DNA中,HAi5转录的siRNA对新基因HA117干扰效果最强;成功构建携带HAi5的重组腺病毒.     

Livin siRNA重组腺病毒的构建及其对K562细胞增殖、凋亡和耐药的影响

目的 通过改良的重组腺病毒介导方法 研究Livin基因与K562细胞增殖、凋亡及耐药的关系.方法 用基因工程技术将靶向Livin siRNA片段克隆至穿梭质粒pSES-HUS中,然后与骨架质粒pAdeasy同源重组,将重组成功的质粒用脂质体介导的方法 转染HEK293细胞,乒乓感染收获高滴度的重组腺病毒AdS-Livin siRNA,并将其感染K562细胞,采用Real-time PCR、Western blot检测Livin基因的干扰效果,用MTT和流式细胞仪检测其与K562细胞增殖、凋亡及多药耐药的关系.结果 成功构建重组腺病毒Ad5-Livin siRNA,并感染K562细胞,在mRNA和蛋白2个水平均抑制Livin的表达.证实通过重组腺病毒沉默Livin基因,可抑制K562细胞增殖,促进凋亡,增加其对阿霉素、长春新碱和依托泊苷的敏感性.结论 用重组腺病毒介导的方法 抑制K562细胞中Livin基因的表达,可增加K562细胞的凋亡及对抗癌药物的敏感性.Livin可能成为治疗白血病新的分子靶点.     

人多药耐药基因1(mdr1)的克隆及重组腺病毒制备

目的:构建表达多药耐药基因1(MDR1)的重组腺病毒表达系统.方法:用基因工程技术将多药耐药基因1的cDNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,然后在细菌内与pAdEasy同源重组,经脂质体转染293细胞包装、扩增腺病毒颗粒.将重组腺病毒Ad5-mdr1感染小鼠单个核细胞,通过荧光显微镜及流式细胞仪进行检测.结果:酶切鉴定及PCR结果证明多药耐药基因重组腺病毒载体构建成功,构建的人多药耐药基因1(mdr1)重组腺病毒载体的效价达到8.3×1011 pfu/ml.对小鼠单个核细胞的感染效率可达10%～15%,转染小鼠单个核细胞细胞48h后,可检测到mdr1基因的表达.结论:成功构建了表达多药耐药基因1的重组腺病毒载体,为后续对mdr1的相关研究创造了条件.     

小鼠降钙素基因相关肽基因重组腺病毒载体的构建及其在心肌细胞的表达

目的:利用AdEasy腺病毒载体系统,构建小鼠降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)基因重组腺病毒载体,并验证其在心肌细胞中的表达.方法:采用RT-PCR方法扩增出含有小鼠CGRP全长cDNA的基因片段,并将其插入PUC57载体,经EcoRⅤ和SalⅠ双酶切,将小鼠CGRP基因亚克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV,形成重组质粒pShuttle-CMV-CGRP.经PmeⅠ酶切线性化后,在大肠杆菌BJ5183中与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组产生重组腺病毒质粒AdEasy-pShuttle-CGRP.重组腺病毒质粒在XL-Gold 细胞中扩增,经PacⅠ酶切线性化后,转染人胚肾293细胞进行重组腺病毒的包装,并经氯化铯纯化得到重组腺病毒AdEasy-pShuttle-CGRP.用纯化后的重组腺病毒转染原代培养的乳鼠心肌细胞,荧光显微镜下观察转染效果.通过尾静脉导入重组腺病毒7 d后,放免法测定心肌中CGRP的表达量.结果:测序证实PUC57 -CGRP重组质粒中含有小鼠CGRP基因的cDNA;重组穿梭质粒pShuttle-CMV-CGRP经双酶切鉴定后可见约7.5 kb和423 bp片段;重组腺病毒质粒AdEasy-pShuttle-CGRP经Pac Ⅰ酶切可见长约3 kb与30 kb DNA片断.转染293细胞进行包装,7 d后细胞出现病变效应,回收病毒重复感染293细胞,在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达.提取病变293细胞中重组腺病毒进行目的基因的PCR鉴定为阳性.构建好的重组腺病毒经纯化后具有很高的滴度,并且成功转染了原代培养的乳鼠心肌细胞.通过放免法证实,该载体可以显著增加小鼠心脏中CGRP的表达.结论:成功构建携带CGRP基因的重组腺病毒载体,该重组腺病毒载体AV-CGRP可以显著增加心脏中CGRP的表达量,为进一步研究CGRP基因治疗奠定了基础.     

PPARγ2基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的 构建携带PPARγ2基因的腺病毒载体.方法 采用PCR技术从pcDNA3质粒中扩增小鼠PPARγ2基因,将PPARγ2基因亚克隆至质粒穿梭载体pAd-Track-CMV.用脂质体(lipid body)转染法(infection protocol)将重组腺病毒pAd-Track-PPARγ2-CMV和pAdEas-1共转染293细胞,确定转染效率.结果 RT-PCR检测结果显示腺病毒Ad-PPARγ2PCR产物约为470bp;用抗PPARγ2单克隆抗体进行Western blot检测为阳性,感染的重组腺病毒载体在L02细胞中PPARγ2有较高的稳定表达.结论 成功构建携带小鼠PPARγ2基因的腺病毒载体.     

重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP的构建及其对K562细胞增殖的影响

目的构建表达SH2-DED融合基因的新型重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP,观察其对K562细胞增殖的抑制作用。方法重叠PCR扩增SH2-DED融合基因并克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建成穿梭质粒pAdT-SD-EGFP并进行酶切和测序鉴定。穿梭质粒经Pme I酶切后转化pAd5F35-GFP的BJ5183感受态,通过细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAd5F35-SD-EGFP及其突变体,Pac I酶切后转染AD293细胞进行包装。重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP经PCR和western blot鉴定后进行病毒扩增和滴度测定。体外感染K562细胞,通过MTT和流式周期检测实验观察Ad5F35-SD-EGFP对K562细胞增殖的影响。结果 PCR、酶切和测序结果均表明pAdT-SD-EGFP和pAd5F35-SD-EGFP构建成功;PCR、EGFP检测结果证明重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP包装扩增成功,滴度可达1.4×1012 pfu/ml。转染K562细胞后,Western blot可检测到目的蛋白的表达,MTT实验和流式周期检测结果证明其对K562细胞的增殖有明显的抑制作用。结论成功构建并鉴定了携带SH2-DED融合基因的重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP,其对BCR-ABL阳性K562细胞的增殖有明显的抑制作用。     

hVEGFA基因重组腺病毒载体的构建及其转染效率的研究

目的:应用AdEasy复制缺陷型腺病毒载体系统构建携带hVEGFA基因的重组腺病毒载体.方法:采用分子克隆技术,从PCR2.1-hVEGFA质粒中克隆出hVEGFA基因的编码序列,酶切、连接后,插入腺病毒系统中的穿梭载体pAdTrack-CMV,获得重组质粒pAdTrack-CMV-hVEGFA,将其转化含有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠埃希菌BJ5183,进行同源重组,获得重组子pAdeasy-1-hVEGFA.鉴定后,将pAdeasy-1-hVEGFA转染人胚肾细胞(HEK293A细胞),获得含hVEGFA基因的重组腺病毒(rAd-hVEGFA).反复感染HEK293A细胞扩增腺病毒,50%组织培养感染量法(TCID50)检测病毒滴度,荧光显微镜观测绿色荧光蛋白(GFP)的表达.结果:成功构建出含有hVEGFA基因的腺病毒载体rAd-hVEGFA,转染HEK293A细胞后出现绿色荧光蛋白表达,证明腺病毒载体rAd-hVEGFA 转染成功,通过反复感染HEK293A细胞获得大量病毒.结论:成功构建含有hVEGFA基因的腺病毒载体rAd-hVEGFA,可为缺血性脑血管疾病的基因治疗提供基因载体.     

结缔组织生长因子的克隆及其重组腺病毒的构建

目的:克隆结缔组织生长因子(CTGF)及制备表达CTGF基因的重组腺病毒.方法:体外克隆出CTGF并将该基因采用定向克隆的方法克隆进入穿梭质粒pAdTrack-CMV中,进一步采用同源重组方法将该质粒和腺病毒质粒Adeasy-1连接,然后用脂质体介导的方法导入包装细胞HEK293中产生表达目的基因的重组腺病毒,收集病毒液感染HCT116 wt骨软骨肉瘤细胞,通过荧光显微镜观察GFP和Western Blot检测CTGF蛋白的表达.结果:经限制性内切酶检测和GFP表达证实成功地构建了携带该基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒,重组腺病毒转染后可使HCT116 wt细胞CT-GF蛋白表达明显增加.结论:成功构建了携带CTGF基因的重组腺病毒载体Ad5-CTGF,为探讨CTGF的作用机制、功能及与相关疾病的发生、发展上的进一步研究打下基础.