溶藻弧菌抗独特型抗体单链抗体基因真核表达载体的构建

目的：构建溶藻弧菌抗独特型抗体的单链抗体（scFv）基因的毕赤酵母分泌型表达载体.方法：从分泌溶藻弧菌抗独特型抗体的杂交瘤细胞株（2F4）中克隆该抗体的重链可变区（VH）基因和轻链可变区（VL）基因（GenBank accession No：DQ011530和 DQ011531）, 并通过基因重组为scFv基因.然后将其克隆入毕赤酵母菌分泌型表达载体pPIC9K中, 经序列测定后, 电转化入毕赤酵母菌SMD1168中, 将经表型筛选和G418抗性筛选的重组酵母菌株进行PCR鉴定.结果：获得毕赤酵母菌分泌型表达载体pPIC9K-scFv, 经G418浓度梯度筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母菌株.结论：成功地构建溶藻弧菌抗独特型抗体的scFv基因的真核表达载体, 为进一步研究其生物学活性奠定了基础.     

溶藻弧菌抗独特型抗体scFv的原核表达及免疫原性鉴定

目的 构建溶藻弧菌抗独特型单链抗体(scFv)的原核表达载体,并对其表达的蛋白进行免疫原性鉴定.方法从分泌溶藻弧菌抗独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2F4)中已获得的该抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),通过基因重组构建scFv及原核表达载体pET32a-AL,转化大肠杆菌BL21后用IPTG诱导表达.表达后的重组蛋白利用动物免疫试验进行免疫原性鉴定.结果 scFv基因序列全长747碱基对,编码249个氨基酸,符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征,含有框架区(FRs)、抗原互补决定区(CDRs)及抗体特征性的半胱氨酸残基.ELISA测定和动物免疫试验显示抗独特性抗体的scFv具有藻弧菌一样的免疫原性.结论 成功构建了抗溶藻弧菌独特型抗体scFv原核表达载体并表达于包涵体中,表达的融合蛋白具有与溶藻弧菌一样的免疫原性,为溶藻弧菌抗独特型单链抗体scFv成为鱼用基因工程疫苗奠定了初步基础.     

溶藻弧菌抗独特型抗体单链抗体在毕赤酵母中的表达

目的构建溶藻弧菌抗独特型抗体的单链抗体(scFv)基因的毕赤酵母分泌型表达载体,并对其表达的蛋白进行免疫原性鉴定。方法从分泌溶藻弧菌抗独特型抗体的杂交瘤细胞株(2F4)中克隆该抗体的重链可变区(VH)基因和轻链可变区(VL)基因(GenBank accession No:DQ011530和DQ011531),并通过基因重组为scFv基因。然后将其克隆入毕赤酵母菌分泌型表达载体pPIC9K中,经序列测定后,电转化入毕赤酵母菌SMD1168中,将经表型筛选和G418抗性筛选的重组酵母菌株进行PCR鉴定。以甲醇进行诱导表达,表达后的重组蛋白利用动物免疫试验进行免疫原性鉴定。结果获得毕赤酵母菌分泌型表达载体pPIC9K-scFv,经G418浓度梯度筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母菌株,ELISA测定和动物免疫试验显示抗独特性抗体的scFv具有与溶藻弧菌一样的免疫原性。结论构建溶藻弧菌抗独特型抗体的scFv基因的真核表达载体并成功表达,为进一步研究其生物学活性奠定了基础。     

抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体可变区基因的克隆和序列分析

目的: 克隆并分析抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体(mAb)VH及VL基因。方法: 从分泌抗溶藻弧菌独特型mAb的杂交瘤细胞株 (AL1 )中提取总RNA。利用RT- PCR技术,克隆抗溶藻弧菌独特型mAbVH 和VL基因, 并将其重组入PMD18 Tvector中进行测序分析。结果: VH基因序列全长为369bp, 编码 123个氨基酸; VL基因序列全长为 339bp, 编码113个氨基酸。通过国际联机检索及Kabat库分析, 二者均符合小鼠IgGV区基因的特征, 含有 4个框架区 (FR), 3个抗原互补决定区 (CDR)及两个抗体特征性的半胱氨酸残基。结论: 抗溶藻弧菌独特型mAb的VH和VL基因的克隆成功,为抗溶藻弧菌独特型mAb基因工程疫苗的构建奠定了基础。     

抗溶藻弧菌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及其特性鉴定

目的 研制抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体并进行免疫学特性分析。方法 用溶藻弧菌外膜蛋白免疫BALB／c小鼠。ELISA鉴定mAb特异性,用BALB／c小鼠进行感染保护实验。结果 共获8株抗溶藻菌单克隆抗体,其中两株具有很好的被动免疫保护抵抗溶藻弧菌感染的能力。结论 本研究制备的抗溶藻弧菌单克隆抗体可作为溶藻弧菌感染的检验和被动免疫保护研究。     

基因工程单链抗体的研究进展

抗体的ＶＨ基因的ＶＬ基因经寡核苷酸接头连接成ＳｃＦｙ基因，转入原核或真核表达系统中表达，表达产物具有与亲本抗体相同的抗原结合特性和能力。在ＳｃＦｖ基因的ＶＬＣ端连连接柔曲的铰链和易形成螺旋束或卷曲螺旋结构的寡核苷酸，表达产物能在活细胞内折叠成具有活性的双价ＳｃＦｖ。ＳｃＦｖ是研究蛋白质结构与功能最理想的实验系统，本文拟就有关问题作一综述。     

单链抗体（ScFv）表达载体的构建及抗HBs ScFv的表达

通过ＤＮＡ重组技术和ＰＣＲ技术，将Ｆａｂ表达载体改建成了ＳｃＦｖ表达载体。该载体可以表达表达方式产生噬菌体抗体，用于抗体库技术，也可以分泌型表达产生有活性的ＳｃＦｖ。所表达的抗ＨＢｓ ＳｃＦｖ具有与其亲本Ｆａｂ相同的抗体活性。载体上具有聚组氨酸编码序列，使表达的ＳｃＦｖ可经金属螯合层析法进行简便有效的纯化。     

单链抗体的改进—ScFv多聚体

ScFv多聚体是通过将单链抗体的连接肽缩短至12个氨基酸以下而构成的一种新型小分子抗体,由单链抗体聚合为二聚体、三聚体等形式,使抗原结合价增加、亲和力得到提高、功能多样,具有广阔的应用前景。本文对该新型小分子抗体连接肽的设计、性能、表达及应用作一综述。     

人源抗乳腺癌单链抗体ScFv的基因克隆

乳腺癌的发病率在我国呈上升趋势。鼠源性单克隆抗体(mAb)抗不适用于人体,而人源化mAb则在乳腺癌的诊断、靶向治疗中具有较高的应用价值。为此,我们从乳腺癌细胞体外致敏乳腺癌患者外周血中分离的淋巴细胞,利用噬菌体抗体库技术克隆了人抗体基因,以期获得抗乳腺癌的人源化单链抗体。1材料和方法1.1 材料 质粒提取试剂盒(Wizard plus SV minipreps DNApurification)、DNA纯化试剂盒(Wizard DNA clean up)、SfiI和Not I内切酶、T4 DNA连接酶均购于Promega公司;RNA纯化     

单链抗体的改进——ScFv多聚体

ScFv多聚体是通过将单链抗体的连接肽缩短至 12个氨基酸以下而构成的一种新型小分子抗体 ,由单链抗体聚合为二聚体、三聚体等形式 ,使抗原结合价增加、亲和力得到提高、功能多样 ,具有广阔的应用前景。本文对该新型小分子抗体连接肽的设计、性能、表达及应用作一综述。     

抗人大肠癌单链抗体的构建、表达及其体内外生物学活性的检测

目的 将抗人大肠癌单克隆抗体ND-1(mAb)的VR和VL基因进行重组，构建和表达ND－1scFv，并对其在体内外的生物学活性进行检测。采用RT－PCR技术，从能够分泌mAb ND-1的鼠杂交瘤细胞中扩增VH和RL基因，通过重叠延伸拼接PCR在VH和VL基因间引入连接短肽，体外构构建ND－1scFv基因，并在大肠杆菌中表达。采用间接免疫荧光（IFA）EY IF工IMPG-1scFv的免疫学活性。用^99Tc^m标记ND－1scFv后，将偶联物给予荷瘤裸鼠，观察其在动物体内的显像及生物学分布。结果 SDS－PAGEW显示，重组蛋白Mr为30000，同预期结果一致。IFA及ELISA检测表明，ND－1scFv保留了与亲本抗体相近的免疫学活性，对表达相应抗原的靶细胞具有行异结合活性。体内放射免疫实验显示，^99Tc^m-ND-1scFv在荷瘤小鼠体内的生物学分布，呈明显的肿瘤积聚趋向，注入体内1h血中T／NT即在2．61。结论 获得免疫学活性良好的ND－1scFv，对荷瘤动物体内肿瘤的定位快速，准确，可望成为有效的肿瘤诊断和治疗的导向载体。     

抗人Lipocalin型前列腺素D合酶单链抗体基因的构建与表达

利用RT-PCR技术,从稳定分泌抗人Lipocalin型前列腺素D合酶(Lipocalin-typeprostaglandinDsynthase,L-PGDS)单克隆抗体的鼠杂交瘤细胞中获得抗体可变区基因;通过一柔性连接短肽[(Gly)4Ser]3,SOEPCR法将此重、轻链可变区拼接成完整的抗人L-PGDS单链抗体基因,并装入表达载体pET-28a(+),在BL21宿主菌中进行表达。经SDS-PAGE检测显示,在低剂量0.02mmol/LIPTG诱导和较低温度25℃或28℃条件下培养,重组菌表达了一定量的可溶性单链抗体。后经Ni-NTA亲和层析柱纯化,得率为2mg/100ml,纯度达92%;双夹心ELISA和免疫荧光竞争抑制实验证实,纯化后的单链抗体具有较好的亲和力和特异性。     

抗转铁蛋白受体双价抗体的构建、表达及鉴定

目的：抗转铁蛋白受体（TfR）双价抗体（bsFv）构建、表达及其与细胞结合的活性鉴定。方法：以抗TfR的单链抗体（scFv）为模板，设计引物引入中问连接肽（G4S）及酶切位点AscI，通过PCR方法扩增两条scFv片段，将其连接并克隆至原核表达载体pAB1，转化大肠杆菌TG1，阳性菌经IPTG诱导表达，FCM检测bsFv与K562，HepG2肿瘤细胞结合的活性及特异性。结果：酶切鉴定及DNA测序证明该bsFv构建成功；SDS-PAGE、Westernblot鉴定表明表达蛋白分子量与bsFv理论值一致；FCM结果证明bsFv可与K562，HepG2肿瘤细胞特异性结合，且结合的阳性率较scFv有所提高。结论：成功构建了抗转TfR的bsFv，且能与K562，HepG2肿瘤细胞特异性结合。     

抗血小板膜糖蛋白单克隆抗体SZ-2单链抗体的构建、表达及功能研究

目的：降低鼠源性抗体的免疫原性及分子量，为其进一步研究、应用奠定基础。方法：应用RT—PCR技术，克隆SZ-2重链、轻链可变基因。应用基因重组技术构建SZ-2单链抗体表达载体pET22-2scFv，导入大肠杆菌BL21(DE3)Plys，诱导表达。流式细胞术、ELISA、Western blot检测SZ-2 scFv与血小板结合能力，瑞斯托霉素、凝血酶和ADP诱导血小板聚集试验对表达产物功能进行研究。结果：克隆基因序列符合小鼠轻、重链可变区基因特征；pET22—2scFv表达质粒拼接正确；表达产物以包涵体形式为主，表达量占菌体总蛋白的25％；纯化、复性后证明表达产物具有与血小板结合的活性，并可抑制瑞斯托霉素、凝血酶诱导的血小板聚集。结论：成功表达了SZ—2单链抗体，该小分子抗体具有与血小板结合的活性，并可抑制瑞斯托霉素、凝血酶诱导的血小板聚集。     

CEA单链抗体基因在大肠杆菌中的克隆及表达

目的尝试将ＣＥＡ单链抗体在大肠杆菌中进行高效表达。方法以ＣＥＡ单链抗体基因为模板，设计４对引物，ＰＣＲ扩增，将４条ＤＮＡ扩增片段分别插入原核表达载体ｐＢＶ２２０中；重组质粒转染大肠杆菌ＴＧ１，４２℃热诱导外源蛋白的表达；包涵体经８ｍｏｌ／Ｌ脲溶解及谷胱甘肽系统复性；过离子交换柱进行纯化；ＥＬＩＳＡ夹心法测活性。结果得到了ＳＤ序列与起始密码ＡＴＧ分别相隔着５，６，７，８个核苷酸的重组质粒；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示转染入重组质粒的ＴＧ１菌经热诱导后有分子量约为３×１０４的外源蛋白，表达量最高达９３０ｍｇ／Ｌ培养液，约占菌体总蛋白的５０％；ＥＬＩＳＡ活性测定结果表明复性后的ＳｃＦｖ有较高的抗原结合活性。结论ＣＥＡ单链抗体在大肠杆菌中获得了较高水平的表达，且经复性后有较高的抗原结合活性。     

人活化血小板单抗SZ-51单链抗体的基因构建及高效表达

目的　为降低鼠源性抗体对人体的免疫原性并降低其分子量 ,进行了人活化血小板单克隆抗体SZ 5 1单链抗体 (ScFv)的基因构建及表达 ,希望摸索出一套稳定、高效表达SZ 5 1ScFv的方法。方法　同时构建了两种不同的SZ 5 1ScFv表达载体pHEN1 5 1ScFv及pET2 0b 5 1ScFv ,并分别导入大肠杆菌HB2 15 1及BL2 1(DE3)plys中进行表达 ,同时对它们的表达特性进行了比较。结果　pHEN1 5 1ScFv在HB2 15 1中经IPTG诱导后 ,SZ 5 1ScFv以可溶性形式分泌至细菌培养上清中。pET2 0b 5 1ScFv在BL2 1(DE3)plys中经IPTG诱导后 ,SZ 5 1ScFv以可溶性与不溶性的包涵体两种形式存在 ,其表达量占菌体总蛋白的 2 0 %。经Westernblot证明两种体系表达产物均维持了亲本抗体与活化血小板特异性结合的能力。结论　pET2 0b表达体系对于SZ 5 1ScFv而言是一种稳定、高效的表达体系。但其包涵体部分的变复性条件仍需进一步探讨。