慢性乙型肝炎患者外周血CD8~+T细胞TCR Vβ基因亚家族克隆化的研究

目的:分析慢性乙型肝炎(CHB)患者CD8+T细胞TCR Vβ基因亚家族克隆化特征。方法:采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增8例CHB患者外周血CD8+T细胞TCR Vβ基因22个亚家族的CDR3区,基因扫描技术对TCR Vβ亚家族的克隆化进行鉴定。结果:基因扫描显示所有8例CHB患者CD8+T细胞TCR Vβ基因亚家族均出现一个或一个以上单克隆或寡克隆增生。Vβ8、Vβ11、Vβ12出现单克隆增生的频率相对较高。8例健康者TCR Vβ基因亚家族均为多克隆。结论:CHB患者外周血CD8+T细胞TCR Vβ亚家族存在克隆性增生。     

利用基因扫描分析TCR Vβ亚家族的CDR3长度方法检测T细胞克隆性

分析了健康人、Ｔ－ＡＬＬ外周血及Ｔ细胞株Ｍｏｌｔ－４和Ｊｕｒｋａｔ中ＴＣＲＶβＴ细胞的表达和克隆性。应用ＲＴ－ＰＣＲ扩增ＴＣＲＶβ２４个亚家族的ＣＤＲ３，并经基因扫描和序列分析确定Ｔ细胞克隆性。结果表明健康人表达除Ｖβ２０外的多克隆Ｔ细胞；Ｔ－ＡＬＬ仅表达３～４个Ｖβ亚家族Ｔ细胞；部分呈寡克隆性；Ｍｏｌｔ－４和Ｊｕｒｋａｔ分别表达Ｖβ２和Ｖβ８单克隆Ｔ细胞。Ｔ－ＡＬＬ中存在克隆性生长Ｔ细胞。该方法是检测Ｔ细胞克隆性的敏感和精确的方法。     

CML患者CD4+和CD8+T细胞的TCR Vβ基因谱系和克隆性分析

目的：了解慢性粒细胞白血病慢性期（CML-CP）患者外周血CD4^＋和CD8^＋T细胞中TCR Vβ亚家族T细胞的基因表达和克隆性.方法：利用RT-PCR分别扩增19例CML-CP患者外周血单个核细胞（PBMCs）、CD4^＋和CD8^＋细胞TCR Vβ亚家族基因的CDR3,阳性产物进一步经基因扫描分析其克隆性.结果：CML患者外周血CD4^＋和CD8^＋细胞分别表达部分（1～21个）Vβ亚家族,均以Vβ13的表达率最高,其次为Vβ9,多数患者的一些Vβ亚家族T细胞呈克隆性增殖,主要出现于CD8^＋细胞中,分别以Vβ21（CD4^＋）和Vβ11（CD8^＋）亚家族的克隆性增殖多见.结论：CML患者外周血CD4^＋和CD8^＋细胞的TCR Vβ谱系均存在限制性分布,患者存在的克隆性增殖CD4^＋和CD8^＋T细胞可能与宿主抗CML抗原反应有关,它们可能在抗CML效应中起主要作用.     

急性乙型肝炎患者HBV特异性CD8~+ T细胞受体α和β链亚家族特点

目的:分析急性乙型肝炎患者HBV特异性CD8+ T细胞受体α和β链亚家族特点。方法:从1例HLA*0201的急性乙型肝炎患者的外周血分离外周血单个核细胞(PBMC),用乙肝抗原HBsAg表位S335-343多肽和细胞因子刺激PBMC以诱导CD8+ T增殖,用流式细胞仪分选出特异性CTL到96孔培养板,培养10～14 d后,提取细胞RNA,PolyA介导反转录,巢式PCR扩增TCR Vα和TCR Vβ,并用非特异性CD8+ T细胞作为对照。对扩增产物分别进行直接测序和克隆测序分析。结果:从HBV急性肝炎患者分离的HBsAg335-343表位特异性CD8+ T细胞扩增出15个Vα亚家族和10个Vβ亚家族,其中用少量CTL仅检出Vα2、Vα9和TCR Vβ3、Vβ4、Vβ9,提示这几种亚家族可能为该特异性CTL TCR的优势取用亚家族,除Vα2呈现3种序列和Vβ9呈现2种序列外,其他亚家族内序列单一;而从患者非特异性CD8+ T对照细胞中可扩增到所有的32个TCRVα和25个Vβ亚家族,且同一亚家族序列呈现高度多样性。结论:急性乙型肝炎患者HBV特异性CD8+ T细胞受体存在优势利用的特点,可能是由于针对同一抗原的特异性CD8+ T细胞克隆性增殖所致,其机制有待进一步分析。     

正常人外周血和脐血中TCR Vβ亚家族sjTRECs的检测情况

目的:检测TCR23个Vβ亚家族sjTRECs在正常人外周血中的存在特点,从而进一步了解正常人胸腺近期各Vβ亚家族初始T细胞的输出情况。方法:采用半巢式PCR对4例胸腺、10例脐血和10例正常人外周血分别在2×105、5×104、1×104和1×103个单个核细胞中的23个Vβ亚家族sjTRECs进行扩增。结果:在细胞数相同的情况下,各Vβ-Dβ1sjTRECs的检出率胸腺细胞最高,其次是脐血,正常人最低。当细胞数为2×105、5×104和1×104时,正常人Vβ2、Vβ4、Vβ7、Vβ11和Vβ19亚家族sjTRECs的检出率以及检出sjTRECs的亚家族数量均显著低于脐血。当细胞数为2×105和5×104时,正常人可检测到绝大多数Vβ亚家族的sjTRECs,随着细胞数的降低,部分Vβ亚家族的sjTRECs则检测不到,而少部分Vβ亚家族的sjTRECs则在1000个细胞时仍能检测到。结论:成功建立了半定量检测23个Vβ亚家族sjTRECs的检测方法;在2×105细胞中约可以检测到80%左右的Vβ亚家族初始T细胞,而在5×104细胞中约有半数的Vβ亚家族初始T细胞可检测到,提示不同Vβ亚家族初始T细胞的出现频率有所差异。     

乙肝疫苗无应答者CD4~+T细胞TCR Vβ基因克隆化特征的研究

目的:研究乙肝疫苗接种者CD4+T细胞TCR Vβ基因克隆化特征,分析乙肝疫苗有应答者和无应答者TCR Vβ基因单克隆改变的差异性。方法:采用多引物PCR技术扩增80例乙肝疫苗接种者CD4+T细胞TCR Vβ基因22个家族的CDR3区基因片段,对PCR产物分别应用琼脂糖凝胶电泳和基因扫描两种方法检测。结果:80例乙肝疫苗接种者中有58例产生抗体,有22例未产生抗体。TCR Vβ基因单克隆改变主要集中在Vβ2、Vβ8、Vβ9、Vβ11和Vβ17五个家族上,乙肝疫苗无应答组这五个Vβ基因单克隆改变频率明显低于乙肝疫苗有应答组(P<0.01或P<0.05)。结论:CD4+T细胞TCR Vβ基因克隆化改变是影响机体对乙肝疫苗免疫应答效果的重要因素之一。     

脐血中TCR Vβ亚家族T细胞的增殖特点

目的了解脐血T细胞体外诱导后TCR Vβ亚家族的分布和克隆性增殖特点. 方法利用T淋巴细胞液体培养法,在不同刺激源(rhIL-2、抗CD3单抗、PHA、AML-M5细胞和bcr-abl多肽)条件下诱导脐血T细胞扩增,并利用RT-PCR分别扩增培养前后脐血T细胞的TCR Vβ 24个亚家族基因的CDR3片段,了解各Vβ亚家族的表达情况.阳性的PCR产物进一步经荧光素标记和基因扫描分析产物的CDR3长度,了解T细胞克隆性. 结果脐血T细胞仅表达部分Vβ亚家族,但经体外培养后,可检测到绝大多数TCR Vβ亚家族T细胞,而经AML-M5细胞和bcr-abl多肽诱导后,TCR Vβ亚家族T细胞呈限制性表达和Vβ亚家族克隆性增殖. 结论脐血T细胞具备产生各TCR Vβ亚家族T细胞的潜能,在白血病相关抗原诱导下,具有限制性和克隆性增殖的能力.     

乙型肝炎患者治疗前后外周血CD4+ CD25+ Tregs TCR CDR3 谱系漂移特征分析

目的:探讨AHB 患者急性期及恢复期、CHB 患者恩替卡韦治疗前后外周血PBMC 中CD4+ CD25+ Tregs TCR CDR3 谱系漂移特征的变化。方法:采集4 例正常人、3 例AHB 患者(急性期和恢复期)及4 例CHB 患者恩替卡韦治疗前后外周抗凝静脉血,分离外周血PBMC;磁珠分选法分选CD4+ CD25+ Tregs,提取总RNA,逆转录合成cDNA;根据TCR β链24 个可变区基因(TRBV)家族设计相应的上游引物,并在茁链恒定区(BC)设计一条共用的FAM 荧光标记下游引物及对照引物。PCR 扩增出24 个包含完整CDR3 区的TRBV 家族的PCR 产物,电泳鉴定目的片段; PCR 产物送上海基康用毛细管电泳法进行基因扫描;用Peak Scanner Software v1.0 软件分析研究对象TRBV 家族CDR3 谱系特征;采用配对t 检验(paired-sample ttest)检测AHB 患者急性期及恢复期、CHB 患者恩替卡韦治疗前后TRBV 家族谱系漂移率差异。结果:3 例AHB 患者急性期呈现普遍谱系漂移的TRBV4、10、14、16、19 家族在恢复期多转变为正态的多峰谱型,AHB 患者恢复期外周血CD4+ CD25+ Tregs TRBV 家族CDR3 谱型漂移率显著低于急性期(t =9.456,P =0.011);TRBV8、11、13.2、15、16、18、20 在3 例CHB 患者抗HBV治疗前出现克隆增生,TRBV1、5.2、6、12、14、24 在3 例CHB 患者抗HBV 治疗后出现克隆增生。CHB 患者抗病毒治疗后TRBV家族CDR3 谱型漂移率高于治疗前(t =-0.666,P =0.553)。结论:AHB 患者急性期呈现谱系漂移的TRBV4、10、14、16、19 家族在恢复期多转变为正态的多峰谱型,推测这种转变可能与HBsAg、HBeAg 转阴相关。CHB 患者在治疗前TRBV8、11、13.2、15、16、18、20 家族克隆增生的Tregs 可能通过下调机体的细胞免疫应答,阻碍病毒清除;随着药物导致病毒载量的显著下降,TRBV1、5.2、6、12、14、24 家族克隆增生的Tregs 可能更有助于诱导机体出现免疫耐受,导致HBV 不能彻底清除。     

强直性脊柱炎患者外周血TCR Vα CDR3谱系基因扫描分析研究

目的:探讨强直性脊柱炎(AS)患者外周血T细胞受体α链可变区互补决定区3(TCR Vα CDR3)谱系多态性,为AS的免疫发病机制的研究提供实验基础。方法:采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增34个TCR Vα亚家族,经免疫扫描谱型技术分析AS患者外周血单个核细胞(PBMC)中T细胞TCR Vα CDR3的谱系漂移情况。结果:5例正常健康对照PB-MC TCR Vα CDR3谱型多数呈高斯分布。所有AS患者外周血T细胞均出现多个TCR Vα亚家族谱型的异常改变,异常峰型包括:单峰、寡峰/寡峰趋势、偏峰和不规则异常峰型。34个TCR Vα亚家族中,共有17个亚家族在少数患者中的扫描谱型呈单峰即单克隆增生。结论:AS患者PBMC TCR Vα CDR3谱系具有显著多态性,表明T细胞在AS免疫发病机理中扮演重要角色。单/寡克隆增生的T细胞有可能是AS发病中的自身反应性T细胞,将为AS的发病机制的进一步研究提供基础依据。     

大鼠TCR Vβ8.2基因真核表达质粒的构建及表达

目的：构建含大鼠TCR Vβ8．2基因的重组真核表达质粒，并检测其在体内外的表达。方法：以RT-PCR法分离Lewis大鼠脾淋巴细胞中的TCR Vβ8．2基因片段，插入到真核表达载体pTARGET中，构建重组表达载体pTARGET-TCR Vβ8．2，并转化E．coli JM109，经蓝白斑筛选阳性菌落，进行菌落PCR和测序鉴定。将重组质粒以肌注法免疫BALB／c小鼠，采集注射部位股四头肌处的肌肉，用RT-PCR及免疫组化染色法检测TCRVB8．2基因在注射部位的转录和表达：通过脂质体介导，将再组质粒导入COS-7细胞中进行瞬时表达，用免疫细胞化学染色法检测靶基因在真核细胞内的表达。结果：测序鉴定证实，TCR Vβ8．2基因已被正确插入到pTARGET载体中，并检测到在肌肉组织和COS-7细胞内重组蛋白的表达。结论：成功地构建重组真核表达质粒pTARGET-TCR Vβ8．2，并在体内体外均可检测到其转录和表达，为进一步进行TCR VβDNA疫苗的研究奠定了基础。     

超抗原SEA和SEB对正常人TCR V_β基因的限制性取用

金黄色葡萄球菌肠毒素 (SE )作为一种超抗原 ,以MHC非限制性及TCRVβ特异性的方式激活T细胞。本文用定量PCR方法 ,分析SEA和SEB刺激的正常人外周血淋巴细胞T细胞抗原受体Vβ的取用格局。揭示在不同HLA遗传背景下 ,SEA刺激的淋巴细胞均选择性地取用Vβ3和Vβ6两种基因片段 ,而SEB刺激的淋巴细胞则优势表达Vβ2、Vβ8和Vβ9。通过比较分析 ,Sigma产的SEB刺激淋巴细胞后则优势表达Vβ3、Vβ4、Vβ16和Vβ2 0 ,提示外周血淋巴细胞在超抗原作用下发生寡克隆扩增。     

基因扫描分析AML-M2a病人外周血的TCR Vβ亚家族T细胞的克隆性增殖

目的了解AML-M2a患者外周血中TCR Vβ亚家族T细胞的分布和克隆性情况.方法利用RT-PCR扩增14例AML-M2a患者外周血单个核细胞中24个TCR Vβ亚家族基因的CDR3,了解TCR Vβ亚家族T细胞的分布.阳性产物进一步经基因扫描分析了解其克隆性.结果 14例AML-M2a患者选择性表达3～10个Vβ亚家族,其中部分Vβ亚家族呈寡克隆增殖.结论 AML-M2a患者TCR Vβ亚家族T细胞的倾斜性分布和克隆性增殖,可能是机体对M2a细胞刺激所产生的特异性免疫反应.     

基因扫描分析AML-M_(2a)病人外周血的TCR Vβ亚家族T细胞的克隆性增殖

目的　了解AML -M2a患者外周血中TCRVβ亚家族T细胞的分布和克隆性情况 .方法　利用RT -PCR扩增 14例AML -M2a患者外周血单个核细胞中 2 4个TCRVβ亚家族基因的CDR3,了解TCRVβ亚家族T细胞的分布 .阳性产物进一步经基因扫描分析了解其克隆性 .结果　 14例AML -M2a患者选择性表达 3～ 10个Vβ亚家族 ,其中部分Vβ亚家族呈寡克隆增殖 .结论　AML -M2a患者TCRVβ亚家族T细胞的倾斜性分布和克隆性增殖 ,可能是机体对M2a细胞刺激所产生的特异性免疫反应 .     

基因扫描分析AML—M2a病人外周血的TCR Vβ亚家族T细胞的克隆性增殖

目的 了解AML－M2a患者外周血中TCR Vβ亚家族T细胞的分布和克隆性情况。方法 利用RT－PCR扩增14例AML－M2a患者外周血单个核细胞中24个TCR Vβ亚家族基因的CDR3,了解TCR Vβ亚家族T细胞的分布。阳性产物进一步经基因扫描分析了解其克隆性。结果 14例AML－M2a患者选择性表达3－10个Vβ亚家族,其中部分Vβ亚家族呈寡克隆增殖。结果 AML－M2a患者TCR Vβ亚家族T细胞的倾斜性分布和克隆性增殖,可能是机体对M2a细胞刺激所产生的特异性免疫反应。     

HIV-1感染者CD4+T细胞受体基因多样性特点及其与病毒载量的相关性

目的 分析HIV-1感染者CD4+T细胞受体(TCR)基因的多样性特征及其与病毒载量的相关性.方法 应用抗CD4单克隆抗体从25份HIV-1感染者和10份HIV-1阴性对照样本外周血单个核细胞(PBMC)中分离CD4+T细胞,提取细胞总RNA,然后通过逆转录及巢式多聚酶链反应(nestedPCR)对TCR 22个Vβ基因家族的互补决定区3(CDR3)进行扩增,利用ABI3700测序仪对扩增的PCR产物进行扫描,定最分析HIV-1感染者TCRCDR3区多样性变化特征及其与病毒载量的相关性.结果 HIV-1感染者CD4+T细胞TCR CDR3区平均D(distance)值显著高于正常对照组(P＜0 05),TCR Vβ基因各家族CDR3长度谱型成寡克隆分布,TCR CDR3区的紊乱与病毒载量呈正相关(r=0 494,P＜0 05);HIV-1感染引起TCR多样性的改变不仅表现在不同Vβ基因家族上,而且也表现在CDR3长度上,其中感染者Vβ8、Vβ22、Vβ23基因家族的变化与正常人差异有统计学意义.结论 HIV-1感染能引起CD4+T细胞TCR基因多样性的减少及高斯(Gaussian)分布的破坏,TCR CDR3区的紊乱与病毒载量呈正相关.

Abstract：

Objective To assess the impact of the virus on the complementary determining region 3 (CDR3) length diversity of T cell receptor(TCR) Vβ repertoires of CD4+ T lymphocytes and to explore its association with viral load in individuals with HIV-1 infection. Methods The TCR repertoire was examined using spectratyping of CDR3 length diversity within CD4+ T cells in HIV infected and healthy adults. Separation of CD4+ T cells from peripheral blood mononuclear cells ( PBMCs) was carried out by using immunomagnetic beads coated with anti-CD4 antibody. Total RNAs from the purified CD4 + T lymphocytes were isolated and used to perform nested-PCR amplifications in CDR3 of 22 TCR gene families. CDR3 diversity and its association with viral load in individuals with HIV-1 infection were analyzed. Results An average diversity for all CDR3 profiles in CD4+ T cells from 25 HIV-infected individuals was significantly different as compared to 10 age-matched healthy donors (P＜0.05) with the HIV-infected individuals losing diversity in the CDR3 profiles. There was positive correlation between changes in TCR CDR3 diversity and viral load (r = 0. 494, P ＜ 0. 05). The changes in CDR3 length diversity of Vβ families in HIV-infected individuals, particular in Vβ8, Vβ22, Vβ23 were statistically different from the healthy controls. Conclusion HIV-1 infection might induce the loss of TCR Vp repertoire diversity and disrupt the CDR3 Gaussian distributions within CD4 + T cells. There should be positive correlation between changes in TCR CDR3 diversity and the viral load in HIV-1 infected patients.     

肿瘤患者胸/腹水和外周血中TCR Vβ亚家族表达及调节性T细胞亚群的研究

目的:探讨肿瘤患者胸/腹水中肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)和外周血T细胞中T细胞受体(TCR)Vβ亚家族的表达变化情况、CD4/CD8细胞比例变化和Treg细胞的分布情况,分析肿瘤患者的免疫状态。方法:分离11例肿瘤患者胸/腹水和外周血以及4例健康人外周血的T细胞,采用流式方法检测Vβ24个亚家族及CD3、CD4、CD8、CD25、CD127的表达情况,统计分析T细胞中Vβ24个亚家族、Treg细胞的特点。结果:TCR Vβ亚家族的表达在肿瘤患者胸/腹水TIL中与血液淋巴细胞中存在着显著差异,其中肺癌患者(4/5)TIL中TCR Vβ8,结肠癌患者(3/4)TIL中TCR Vβ2等亚家族显著高表达;11例肿瘤患者胸/腹水样本中Treg的比例均比外周血高(P<0.05),其中5例肺癌患者胸腹水中CD8+T细胞比例降低。结论:肿瘤患者胸/腹水中的淋巴细胞TCR Vβ亚家族表达与外周血存在差异,表明肿瘤患者体内淋巴细胞发生了明显的优势取用和定向趋化。此外肿瘤微环境可能影响了TIL中CD4+细胞的分化导致胸腹水中Treg细胞的比例升高,同时伴随着CD8+T比例的下降,并可能因此影响到TIL中TCR Vβ亚家族的优势取用情况,且导致免疫耐受。     

慢性苯中毒患者外周血TCR Vδ亚家族T细胞分布和克隆性研究

目的:了解慢性苯中毒患者外周血T细胞的TCRV8基因谱系及其克隆性增殖情况.方法:利用RT-PCR方法扩增10例慢性苯中毒患者外周血单个核细胞中8个TCR Vδ基因的互补决定区3(CDR3),PCR产物进一步经荧光标记和基因扫描分析CDR3长度而确定T细胞的克隆性.结果:8例健康人平均表达(6.63±0.52)个Vδ亚家族,外周血中未检测到Vδ4和Vδ5亚家族,慢性苯中毒患者工人表达(1.10±0.57)个Vδ亚家族(1例重度苯中毒工人8个Vδ亚家族均未表达),外周血中未检测到Vδ1、Vδ3、Vδ4和Vδ8亚家族,与健康人比较有显著性差异(P<0.01).6例慢性苯中毒患者存在1～2个Vδα亚家族T细胞出现克隆性增殖.结论:慢性苯中毒患者外周血出现TCR Vδ亚家族倾斜性分布和克隆性增殖T细胞,这可能是苯中毒后所引起的机体特异性免疫反应.     

多发性骨髓瘤患者外周血中TCR Vβ亚家族na(i)ve T细胞水平变化

目的:检测多发性骨髓瘤(MM)患者外周血中23个TCR Vβ亚家族的T细胞受体删除DNA环(sjTRECs)的存在特点,从而了解MM患者相应Vβ亚家族na(i)ve T细胞的近期胸腺输出情况.方法:利用半巢式PCR分别扩增12例MM患者每5×104个外周血单个核细胞(PBMCs)中的23个Vβ亚家族sjTRECs,10例正常人外周血作为对照.结果:在5×104个PBMCs中,检测到MM患者sjTRECs的Vβ亚家族数量约为(5.00±2.45)个,与正常人的(9.60±5.48)个相比,检出的亚家族数量明显减少(P＜0.05);23个Vβ亚家族sjTRECs在正常人中均可以检测到,而在MM患者仅检测到部分;并且Vβ2、Vβ10、Vβ16、Vβ17和Vβ21等5个亚家族sjTRECs的检出率明显低于正常水平.12例MM患者检出的亚家族数量(2-9个)不等,患者的年龄与检出的亚家族数量存在负相关(r=-0.892;P＜0.01).结论:MM患者胸腺近期输出的23个Vβ亚家族na(i)ve T细胞存在不同程度的缺失或水平降低,表明患者存在不同程度的细胞免疫功能缺陷以及T细胞谱系重建的能力和潜能受损.