反义ClC-3寡核苷酸对PC12细胞增殖的影响

目的：研究反义ClC-3寡核苷酸对PC12细胞增殖的影响。方法：PC12细胞用Lipofectamine2000介导分别转染6.25,12.5,25.0,50.0,100.0及200.0mg/L的CIC-3反义寡核苷酸,50mg/LCIC-3正义寡核苷酸,50mg/LClC-3随义寡核苷酸,以转染10mg/LLipofectamine2000和未转染细胞作对照。利用MTT以及[3H]-胸腺嘧啶掺入实验检测细胞存活率及DNA合成情况,流式细胞术检测细胞周期。结果：与未转染细胞组比较,反义ClC-3寡核苷酸可以降低PC12细胞存活率,并抑制[3H]-胸腺嘧啶掺入到DNA,使G0/G1期细胞增多,S期细胞减少（P均〈0.05）。而转染脂质体、正义及随义ClC-3寡核苷酸对PC12细胞的细胞存活率、DNA合成及细胞周期均无影响（P〉0.05）。结论：反义ClC-3寡核苷酸通过使PC12细胞周期被阻滞在G0/G1期而抑制细胞的增殖。     

反义ClC-3寡核苷酸对thapsigargin触发 的Ca2+ 运动的影响

 【目的】 研究反义ClC-3寡核苷酸对Thapsigargin (TG)触发的Ca2+ 运动的影响。【方法】 在PC12 细胞中转染反义ClC-3寡核苷酸,利用生物荧光影像分析系统测定胞浆Ca2+ 技术探讨ClC-3寡核苷酸对TG触发的Ca2+ 运动的影响。【结果】 与对照组相比,反义寡核苷酸转染对TG触发的PC12细胞静息[Ca2+]i的Ratio值和Ca2+ 释放量的Ratio值无显著影响(P>0.05)?但使Ca2+ 内流量明显升高(P<0.05)?Ca2+ 池操纵性Ca2+ 通道(store-operated Ca2+ channels, SOCC)阻断剂SK&;F96365可以浓度依赖的抑制TG触发的PC12细胞Ca2+ 内流,但与随义?正义寡核苷酸转染组相比, SK&;F96365对反义转染组细胞Ca2+ 内流的抑制作用明显增强(P<0.05)。【结论】 ClC-3蛋白参与TG触发的Ca2+ 池操纵的Ca2+ 内流(store-operated Ca2+ entry,SOCE),但对细胞静息钙水平及钙释放过程没有影响。     

反义ClC-3寡核苷酸对thapsigargin触发的Ca^2＋运动的影响

【目的】研究反义ClC-3寡核苷酸对Thapsigargin（TG）触发的Ca^2＋运动的影响。【方法】在PC12细胞中转染反义ClC-3寡核苷酸,利用生物荧光影像分析系统测定胞浆Ca^2＋技术探讨ClC-3寡核苷酸对TG触发的Ca^2＋运动的影响。【结果】与对照组相比,反义寡核苷酸转染对TG触发的PC12细胞静息[Ca^2＋]i的Ratio值和Ca^2＋释放量的Ratio值无显著影响（P〉0.05）。但使Ca^2＋内流量明显升高（P〈0.05）。Ca^2＋池操纵性Ca^2＋通道（store-operatedCa^2＋channels,SOCC）阻断剂SK＆F96365可以浓度依赖的抑制TG触发的PC12细胞Ca^2＋内流,但与随义、正义寡核苷酸转染组相比,SK＆F96365对反义转染组细胞Ca^2＋内流的抑制作用明显增强（P〈0.05）。【结论】ClC-3蛋白参与TG触发的Ca^2＋池操纵的Ca^2＋内流（store-operatedCa^2＋entry,SOCE）,但对细胞静息钙水平及钙释放过程没有影响。     

ClC-3 siRNA抑制鼻咽癌细胞调节性容积回缩

目的用siRNA沉默ClC-3氯通道,探讨ClC-3氯通道在鼻咽癌CNE-2Z细胞调节性容积回缩(regulatory volumedecrease,RVD)中的作用。方法使用终浓度100 nmol/L的ClC-3 siRNA转染鼻咽癌CNE-2Z细胞,流式细胞术检测siRNA的转染率,Western blotting检测ClC-3蛋白表达,活细胞图像系统分析对照组和ClC-3 siRNA组细胞在低渗(160mOsm/L)刺激时的容积调节能力。结果 ClC-3 siRNA转染率为(63.8±3.8)%(n=3,P<0.01),与对照组相比,ClC-3氯通道蛋白的表达减少(60.9±4.0)%(n=3,P<0.01)。对照组细胞的RVD为(42.6±2.8)%(n=20),ClC-3 siRNA组细胞在低渗液中的最大容积与对照组没有显著性差异,但RVD仅为(10.5±4.8)%,RVD抑制率达75.4%(P<0.01)。结论 ClC-3 siRNA成功转染鼻咽癌CNE-2Z细胞,特异性抑制ClC-3蛋白表达,显著降低细胞RVD能力,提示ClC-3氯通道在鼻咽癌细胞调节性容积回缩中起重要作用。     

ClC-3氯通道调节氧糖剥夺所诱导的小胶质细胞的表型转化

目的:研究ClC-3氯通道在氧糖剥夺所致小胶质细胞表型转化中的作用?方法:应用小胶质细胞株(BV-2)制备氧糖剥夺模型,分别给予氯通道阻断剂DIDS和NPPB预处理BV-2细胞?通过MTT活性测定确定BV-2细胞损伤及药物的有效浓度;通过实时荧光定量PCR法测定细胞表型相关分子,如M1型相关分子[肿瘤坏死因子-?琢(tumor necrosis factor-?琢,TNF-?琢)?白介素-1β(interleukin 1?茁,IL-1?茁)?CD86]和M2型相关分子[转化生长因子?茁(transforming growth factor β,TGF-β)?CD206]mRNA水平的表达;通过RNA干扰的方法下调ClC-3的表达,再给予氯通道阻断剂DIDS和NPPB干预,进一步检测细胞的MTT活性,观察药物作用效果?结果:预先给予DIDS(1和10 μmol/L)和NPPB(1 μmol/L)能够改善氧糖剥夺所诱导的BV-2细胞MTT活性下降,抑制M1型相关分子如TNF-?琢?IL-1?茁和CD86的表达并促进M2型相关分子(TGF-?茁和CD206)的表达;通过RNA干扰下调ClC-3的表达,能够消除DIDS和NPPB的作用?结论:ClC-3氯通道参与调控氧糖剥夺所致小胶质细胞的表型转化,阻断ClC-3氯通道抑制氧糖剥夺诱导小胶质细胞向M1型转化?     

ClC-3基因敲除不影响心肌细胞肿胀激活性氯通道的PKC敏感性

目的:探讨小鼠心室肌细胞肿胀激活性氯(VSOR Cl-)通道的蛋白激酶C (PKC)敏感性是否受ClC-3的影响.方法:采用基因打靶、RT-PCR、膜片钳全细胞记录技术分别获得ClC-3基因敲除小鼠(Clcn3-/-)、验证心肌ClC-3 mRNA表达、及记录VSOR Cl-电流.结果:①低渗条件下1μmol/L佛波酯(PMA)明显增大VSOR Cl-电流;②等渗条件下PMA-预处理不影响基础电流,随后低渗刺激性VSOR Cl-电流激活时程明显缩短;③PMA对VSOR Cl-电流的增强作用在野生型和Clcn3-/-小鼠无明显区别;④10 μmol/L白屈菜红硷(CHE)-预处理明显抑制低渗激活性VSOR Cl-电流,并消除PMA-后处理对VSOR Cl-通道的上调作用.结论:小鼠心室肌细胞VSOR Cl-通道激活主要依赖于内源性PKC活性,VSOR Cl-通道的PKC依赖性不受ClC-3的影响.     

氯通道ClC-2反义寡核苷酸对顺铂作用下神经胶质瘤U251细胞侵袭力的影响

目的：探讨氯通道ClC-2 反义寡核苷酸(AON)抑制ClC-2基因表达对顺铂(DDP)作用下神经胶质瘤U251细胞侵袭力的影响,为ClC-2成为神经胶质瘤综合治疗的新基因靶点提供理论依据。方法：U251细胞按处理方法不同分为对照组（转染无义寡核苷酸）、AON组（转染ClC-2反义寡核苷酸）、DDP组（无义寡核苷酸与顺铂联用）和AON +DDP组（ClC-2反义寡核苷酸与顺铂联用）。应用RT-PCR检测相关基因ClC-2、cyclin D1 、MMP-2、MMP-9 mRNA表达;Transwell 小室侵袭实验检测各组细胞侵袭力;Transwell 小室迁移实验检测各组细胞迁移率。结果：与对照组比较,AON组、DDP组和AON +DDP组ClC-2、cyclin D1 、MMP-2、MMP-9 mRNA表达率降低（P＜0.05）;Transwell 小室侵袭实验中对照组、AON组、DDP组和AON +DDP组侵袭细胞数分别为81.00±4.58、42.01±4.36、48.33±2.52和12.67±5.13;与对照组比较,AON组、DDP组和AON +DDP组穿透细胞数明显降低（P＜0.05）。Transwell 小室迁移实验中AON 组、DDP组、AON +DDP组细胞迁移率（%）分别为72.40±2.20、51.48±1.29、37.87±1.50,与对照组比较均明显降低（P＜0.05）。结论：①转染ClC-2反义寡核苷酸能有效抑制ClC-2 mRNA表达;②抑制ClC-2 mRNA能降低U251细胞的迁移力和侵袭力;③ClC-2 mRNA表达降低可促进顺铂对U251细胞迁移力和侵袭力的抑制作用。     

蝎毒抗癌多肽对CNE-2Z细胞生长周期移行和p53表达的影响

目的 :观察蝎毒抗癌多肽 (APBMV)对CNE 2Z细胞生长周期和p5 3表达的影响。方法 :采用流式细胞仪双标法。结果 :APBMV处理CNE 2Z细胞 48h后 ,进入S期的细胞明显减少 ,处于G1期和G2期的细胞明显增多 ,APBMV 16mg/L处理CNE 2Z细胞 48h后 ,G1期、S期和G2期细胞的百分比分别为 5 9.7%、32 .3 %和 7.9% ,空白对照组的百分比分别为 5 3 .3%、45 .2 %和 1.5 % ,二者比较差异有显著性 (P <0 .0 1或P <0 .0 0 1)。空白对照组CNE 2Z细胞P5 3蛋白 2 4h和 48h表达量处于较高水平 (2 7.2 3± 0 .93)和 (31.6 7± 1.75 ) ,经APBMV处理 2 4h或 48h后 ,P5 3蛋白表达量明显下降 ,与空白对照组相比差异有显著性 (P <0 .0 1)。结论 :APBMV能够阻止CNE 2Z细胞周期的移行 ,并抑制抑癌基因p5 3的表达     

阻断氯通道对鼻咽癌细胞凋亡和细胞增殖的影响

目的研究阻断氧通道对低分化鼻咽癌（CNE-2Z）细胞凋亡和细胞增殖的影响，探讨氯通道在CNE-2Z细胞凋亡中的作用。方法用顺铂（CDDP）诱导细胞凋亡，流式细胞仪检测细胞凋亡，MTT法检测细胞增殖。结果顺铂（1．5μg/ml）处理细胞48h后可检测出凋亡峰，氯通道阻断荆NPPB（50μmol／L）阻抑顺铂诱导的细胞凋亡及细胞增殖抑制。结论氯通道参与了CNE-2Z细胞凋亡过程的调控。     

姜黄素对人鼻咽癌细胞CNE-2Z细胞骨架的影响

目的:观察姜黄素对鼻咽癌细胞CNE-2Z细胞骨架的影响,探讨姜黄素对鼻咽癌细胞直接杀伤作用的可能机制。方法:用考马斯蓝染色和图像分析方法检测不同浓度姜黄素作用24 h后CNE-2Z细胞骨架的染色变化;用免疫组织化学方法观察表皮生长因子受体(EGFR)、增殖细胞核抗原(PCNA)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、Tubulin-β在各组细胞中的表达情况;运用RT-PCR方法检测不同浓度姜黄素作用后的CNE-2Z细胞中EGER的表达水平。结果:CNE-2Z细胞在10μmol/L姜黄素处理后细胞体积有所增大,随后姜黄素浓度升高细胞骨架染色逐渐降低(P<0.01);不同浓度的姜黄素可抑制CNE-2Z细胞中EGFR、PCNA、PI3K和Tubulin-β的表达,并使EGFR mRNA在CNE-2Z细胞中的表达下调。结论:姜黄素可能通过下调EGFR影响细胞骨架,从而起到直接杀伤鼻咽癌细胞CNE-2Z的作用。     

蝎毒抗癌多肽对CNE-2Z细胞膜电位的影响

目的: 观察蝎毒多肽(APBMV)对鼻咽癌CNE-2Z细胞株细胞膜电位的影响.方法: 细胞经培养传代,分组处理.空白对照组加生理盐水,其他3组分别加入浓度为8,12和16 mg/L的APBMV. 采用玻璃微电极细胞内记录法测定CNE-2Z细胞膜电位,MTT法观察APBMV对CNE-2Z细胞的毒性作用. 结果: CNE-2Z 细胞经APBMV处理48 h后,细胞膜负电位(13.00±3.58) mV明显小于空白对照组(23.00±8 .21)mV,P<0.01,细胞膜呈去极化状态;CNE-2Z细胞代谢MTT的能力下降,显示明显的毒性反应.结论: APBMV可能具有膜毒素的作用,通过降低CNE-2Z细胞膜电位 ,继而影响肿瘤细胞的增殖.     

蝎毒抗癌多肽对CNE-2Z细胞膜电位的影响

目的观察蝎毒多肽(APBMV)对鼻咽癌CNE-2Z细胞株细胞膜电位的影响.方法细胞经培养传代,分组处理.空白对照组加生理盐水,其他3组分别加入浓度为8,12和16mg/L的APBMV.采用玻璃微电极细胞内记录法测定CNE-2Z细胞膜电位,MTT法观察APBMV对CNE-2Z细胞的毒性作用.结果CNE-2Z细胞经APBMV处理48h后,细胞膜负电位(13.00±3.58)mV明显小于空白对照组(23.00±8.21)mV,P<0.01,细胞膜呈去极化状态;CNE-2Z细胞代谢MTT的能力下降,显示明显的毒性反应.结论APBMV可能具有膜毒素的作用,通过降低CNE-2Z细胞膜电位,继而影响肿瘤细胞的增殖.     

弓形虫对HPB-ALL细胞及CNE-2Z细胞增殖的影响

目的：探讨弓形虫对HPB—ALL细胞及CNE-2Z细胞增殖的影响。方法：取培养至对数生长期的HPB—ALL细胞和CNE-2Z细胞分别接种于96孔培养板中,加入不同浓度（1×10^4、2×10^4、4×10^4、8×10^4、16×10^4／mL）的弓形虫速殖子作用48h,MTT法检测细胞增殖抑制率。结果：弓形虫对HPB—ALL细胞增殖抑制率依次为14％、20％、33％、38％和39％,除第1组外,其余4组的吸光度值与对照组比较．差异均有统计学意义（P〈0．05）,且实验3、4、5组吸光度值与对照组比较,差异均有统计学意义（P〈0．01）;弓形虫对CNE-2Z细胞增殖抑制率分别是4％、9％、16％、20％和23％,其中实验4、5组吸光度与对照组比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论：弓形虫逮殖子对体外培养的HPB—ALL细胞和CNE．2z细胞增殖有不同程度的抑制作用．     

薏苡仁酯对人鼻咽癌细胞的放射增敏作用

【目的】探讨薏苡仁酯 (CXL)对人鼻咽癌细胞CNE 2Z辐射效应的影响。【方法】以60 Co为放射源 ,采用微量细胞克隆形成法检测CNE 2Z对γ射线的敏感性。【结果】CXL使CNE 2Z的放射—存活曲线左移 ,Do 和Dq 值下降。不同浓度的CXL(10 -7～ 10 -6mol/L)使辐射剂量减少 7 45 %～ 17 31% (在D37水平 ) ,其增敏比 (SER) :Do 比值 1 11～ 1 46 ,Dq 比值1 0 2～ 1 11。【结论】CXL能提高CNE 2Z的放射敏感性。     

蛋白激酶C对鼻咽癌CNE-2Z细胞端粒酶活性的影响

为进一步探讨蛋白激酶C（PKC）调控入低分化鼻咽癌CNE－2Z细胞生长的机制，观察了PKC对CNE－2Z酶粒酶活性的影响。结果显示：CNE－2Z细胞有较高的端粒酶活性；PKC的抑制剂Staurosporine显著降低细胞端粒酶活性（P＜0．001）。提示抑制PKC可以抑制CNE－2Z细胞的端粒酶活性，PKC可通过调控端粒酶活性从而影响CNE－2Z细胞的生长。     

白藜芦醇对鼻咽癌细胞株 CNE-2Z 增殖和凋亡的影响

目的　探讨白藜芦醇 (resveratrol,Res)对鼻咽癌细胞株 CNE- 2 Z增殖和凋亡的影响。方法　采用 MTT法检测 IC50 值 ,流式细胞术、Hoechst 332 5 8/PI荧光染色和 DNA琼脂糖凝胶电泳分析细胞凋亡。结果　不同浓度Res分别处理细胞 2 4 ,4 8和 72 h,其 IC50 值分别为 (10 9.2± 7.5 ) ,(83.6± 6 .0 ) ,(5 4 .3± 2 .8) μmol/L,各 IC50 值间比较差异显著 (P<0 .0 1)。2 5 ,5 0 ,10 0和 2 0 0 μm ol/L Res分别处理细胞 2 4 h后 ,5 0 ,10 0 ,2 0 0 μmol/L Res处理组经流式细胞术和荧光染色检测出的细胞凋亡率均明显高于对照组 (P<0 .0 1) ,荧光染色可见典型的凋亡形态学改变 ,10 0 ,2 0 0 μmol/L Res处理组可见明显的 DNA梯带。结论　 Res可通过诱导 CNE- 2 Z细胞株凋亡而抑制其增殖。     

电离辐射对人鼻咽癌细胞株CNE-2Z体外表达血管内皮生长因子的影响

目的 探讨电离辐射对人鼻咽癌细胞体外表达血管内皮生长因子(VEGF)的影响.方法 人鼻咽癌细胞株CNE-2Z置RPMI 1640培养液培养,实验分为两组,剂量梯度组分别给予2、4、6、8、12、16 Gy电离辐射;时间梯度组给予6 Gy照射;收集细胞上清液,双抗体夹心ELISA法测定VEGF表达水平.结果 与阴性处理细胞比较,人鼻咽癌细胞株CNE-2Z体外接受不同剂量辐照后,VEGF表达明显增高,且具有剂量依赖性和时程依赖性.结论 电离辐射能诱导人鼻咽癌细胞VEGF高表达,这可能是临床肿瘤抗辐射的机制之一.     

蛇毒精氨酸酯酶Agkihpin对人鼻咽癌CNE-2细胞系E-钙粘素表达的影响

目的探讨蛇毒精氨酸酯酶Agkihpin对人鼻咽癌CNE-2细胞系中表皮钙粘素(E-CD)表达的影响,并试图阐明Agkihpin抑制人鼻咽癌CNE-2细胞的机制。方法用不同浓度的Agkihpin处理鼻咽癌细胞株72 h后,应用免疫细胞化学、RT-PCR法检测E-CD在CNE-2细胞中的表达。结果不同浓度Agkihpin作用CNE-2细胞72 h后E-CD表达均降低,并呈现出一定的浓度依赖效应,显示Agkihpin可显著下调CNE-2细胞中E-CD表达。各加药组与不加Agkihpin组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论在人低分化鼻咽癌CNE-2细胞系中,Agkihpin能抑制E-CD的表达,并且随浓度的增大有明显的抑制作用。     

蛇毒精氨酸酯酶Agkihpin对人鼻咽癌CNE-2细胞系E-钙粘素表达的影响

目的探讨蛇毒精氨酸酯酶Agkihpin对人鼻咽癌CNE-2细胞系中表皮钙粘素（E-CD）表达的影响,并试图阐明Agkihpin抑制人鼻咽癌CNE-2细胞的机制。方法用不同浓度的Agkihpin处理鼻咽癌细胞株72h后,应用免疫细胞化学、RT—PCR法检测E—CD在CNE一2细胞中的表达。结果不同浓度Agkihpin作用CNE-2细胞72h后E—CD表达均降低,并呈现出一定的浓度依赖效应,显示Agkihpin可显著下调CNE-2细胞中E—CD表达。各加药组与不加Agkihpin纽比较,差异具有统计学意义（P〈0．05）。结论在人低分化鼻咽癌CNE-2细胞系中,Agkihpin能抑制E-CD的表达,并且随浓度的增大有明显的抑制作用。