HCV基因及其核苷酸序列差异的生物学作用与疾病的关系

近年来，国外关于ＨＣＶ基因组ＲＮＡ序列的研究进展很快。本文就ＨＣＶ的基因分型、核苷酸序列的差异以及ＨＣＶ基因组的多样性与疾病的关系作一简要综述。     

北京地区TT病毒分离株全基因的克隆及序列测定

目的 克隆和测定北京地区ＴＴ病毒（ＴＴＶ）分离株全基因序列。方法 采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术从１例临床非甲￣庚型肝炎病人血清中分段扩增ＴＴＶ全基因,获得５个互相重叠的片段,分别长１９９ｂｐ（１－１９９）,１２６７ｂｐ（９０－１３５６,８７８ｂｐ（１３５４－２２３１,１１２９ｂｐ（２１７８－３３０６,４３４ｂｐ（３３０６－３７３９）,用标准的分子生物学方法测定了这５个序列,从而得到全长ＴＴＶ基因     

湖北地区119例 HCV 1b 型 NS3丝氨酸蛋白酶区的序列变异研究

目的：分析丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)1b 型非结构蛋白3(non-structure protein 3, NS3)丝氨酸蛋白酶区序列的变异规律及影响意义。方法使用基因型别特异性引物,通过巢式 PCR 的方法扩增119例慢性 HCV 1b 型患者血清中 HCV NS3区。对 PCR 产物进行测序后获得 NS3区核苷酸及氨基酸序列。分析119例 HCV 1b 型 NS3区序列的同源性及种系进化,分析 NS3丝氨酸蛋白酶区的变异情况及重要功能位点的突变情况。结果湖北地区 HCV 1b 型与 HCV 1b 型标准株及亚洲地区序列同源性较高,核苷酸序列同源性为85.94％及87.68％,氨基酸序列同源性可达96.83％及92.39％,而与欧美地区1b 型同源性较低,核苷酸序列同源性均为85.57％,氨基酸序列同源性分别为92.17％及93.38％。进化树分析提示湖北地区序列与中国其他地区序列亲缘性较接近,而与日本、东南亚地区及欧美地区的1b 型亲缘性较远。 NS3丝氨酸蛋白酶区185个氨基酸内有34个位点有氨基酸突变,但其重要的功能区包括催化酶底物特异性结合位点以及 Zn2﹢结合位点在所有序列中均高度保守,无一例发生突变。结论对湖北地区 HCV 1b型 NS3丝氨酸蛋白酶区的变异规律及生物学意义的研究进一步丰富和完善了对 HCV 1b 型基因组变异情况的认识。为了解 HCV1b 型在中国地区的进化过程提供一定理论基础。     

汉坦病毒A9株L片段部分核苷酸序列分析

目的 测定我国分离的汉坦病毒Ａ９株Ｌ片段的部分核苷酸序列。方法 用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术扩增我国分离的汉坦病毒Ａ９株部分Ｌ片段ｃＤＮＡ,测定ＰＣＲ产物的核苷酸序列。结果 ＰＣＲ扩增产物为Ｌ片段４００６ｎｔ－４４５４１ｎｔ（根据７６－１１８株序列）,和已发表的汉坦病毒Ｌ片段序列比较,Ａ９株和汉滩病毒７６－１１８株同源性最高,为８５．２％,和其他不同型别汉坦病毒代表株ＨＲ８０－３９、     

慢性丙型肝炎患者丙型肝炎病毒NS5A区序列与干扰素疗效的关系

目的　探讨上海地区丙型肝炎病毒 (HCV) 1b亚型慢性感染者的血清HCV非结构基因5A(NS5A)与干扰素 (IFN)疗效的关系。方法　收集上海地区 2 4例HCV1b慢性感染者在干扰素治疗前后及随访过程中的血清标本 ,定量检测治疗前血清HCVRNA ,用逆转录 聚合酶链反应方法扩增NS5A的干扰素敏感决定区 (ISDR)基因并进行测序和分析。另扩增干扰素应答类型不同的 3例患者治疗前后共 5株HCV病毒的NS5A全长序列 ,测序后作种系发生树分析及蛋白二级结构预测。结果　治疗前血清HCVRNA的定量结果显示 ,持续应答组的病毒滴度 (平均滴度 4 50× 1 0 4copies ml)明显低于复发组和无应答组 (平均滴度 1 82× 1 0 7copies ml)。 2 4例慢性丙型肝炎患者干扰素治疗前血清HCV的ISDR氨基酸序列与抗干扰素的HCV J株比较 ,1 3例为野生型 ,1 1例为中间型 ,无突变型。 6例完全应答者 3例感染的是野生型株 ,另 3例感染的是中间型病毒株。 5株HCV病毒的NS5A全长序列种系发生树显示 ,3种不同应答类型株在种系发生上分属 3个组别 ,无应答株与抗干扰素的HCV J株关系相近被归为 1组。蛋白质二级结构预测显示 ,上述病毒株NS5A蛋白在二级结构方面基本相似 ,仅在 2 2 55～ 2 2 89范围内有明显不同 ,这一区域与PKR结合域部分重叠。结论　HCVNS5A基因     

山东烟台地区HCV感染的基因分型研究

目的 了解山东烟台地区丙型肝炎病毒的基因分型,结合受试者的肝功能指标观察基因型别与肝损情况是否相关.方法 采用特异性PCR引物对HCV RNA5'UTR区和(或)NS5B区进行扩增,PCR产物进行序列分析,通过与GenBank中参考序列的比对,联合遗传进化树对标本予以分型.结果 9例无偿献血员中检出1b和3a两种基因亚型,分别为8例和1例.33例丙肝患者中,检出1b、2a和6a三种基因亚型,分别为22(66.7％)、10(30.3％)和1(3.03％)例.1b亚型是烟台地区HCV携带者的优势流行基因亚型,在不同人群中分布差异无统计学意义(x2=0.796,P=0.373);不同基因分型的受试者其肝损指标的差异有统计学意义(P＜0.05),2a型携带者的ALT、AST均值明显高于1b型.结论 山东烟台地区HCV基因型呈现多样性,以1b为主,并首次检出3a和6a亚型.HCV基因型与肝损指标具有相关性,2a型HCV感染可能在肝细胞的病变过程中起着重要作用.     

线探针核酸杂交分析贵州地区HCV感染株基因型

目的　分析贵州地区丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染株的基因型。方法　用第二代线探针核酸杂交方法,对９８ 例ＨＣＶ感染者血清进行基因分型。结果　１２ 例献血员血清,均为ＨＣＶ１ｂ 型;１５ 例血液病患者中,１４ 例（９３－３％ ）为ＨＣＶ１ｂ ,１ 例（６－７％ ）为ＨＣＶ１ｂ ＋ ２ 型。慢性丙肝患者３７ 例中,ＨＣＶ１ｂ 型３４例（９１－９％ ） ,混合感染基因型３ 例（ＨＣＶ１ａ ＋ １ｂ 、ＨＣＶ１ｂ ＋ ２ 、ＨＣＶ１ａ ．１ｂ ＋ ２ａ２ｃ 各１ 例）。静脉药瘾者３４ 例,其中ＨＣＶ１ｂ 感染１３ 例（３８－２％ ） ,ＨＣＶ６ａ１０ 例（２９－４％ ） ,ＨＣＶ３ｂ４ 例（１１－８％ ） ,ＨＣＶ３ａ１ 例（２－９ ％） ,混合感染６ 例（１７－６ ％） ,大多为ＨＣＶ２ 复合其他基因型。结论　贵州地区ＨＣＶ感染者中,以ＨＣＶ１ｂ 基因型为主,其次为ＨＣＶ６ａ ,尚存在ＨＣＶ３ａ 和ＨＣＶ３ｂ 。其中ＨＣＶ３ａ、３ｂ 、６ａ ,在本地区系首次报告,但主要存在于静脉药瘾者中。虽然有混合感染基因型的存在,但其基因基础需测序分析     

丙型肝炎病毒E2／NS1区基因cDNA的克隆及序列分析

从北京地区１份丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染者血清中提取ＲＮＡ，经逆转录和套式聚合酶链反应扩增ＨＣＶＥ２／ＮＳ１区基因约９３０ｂｐ，将其插入至ｐＧＥＭ－Ｔ质粒载体中，利用双脱氧链末端终止法测出该基因５’端４３１ｂｐ的核苷酸序列，将此序列与其它９个ＨＣＶ分离株的相应序列进行比较分析，结果表明，此序列与ＨＣＶⅡ型序列同源性较高，核苷酸水平同源性在８０％以上。由其编码的ＨＣＶ外膜蛋白Ｎ端存在两个高变部位（ＨＶＲ），在ＨＶＲ内、外具有几个保守氨基酸残基和氨基酸区域，它们与外膜蛋白空间构型的维持有关。     

鼠抗丙型肝炎病毒（HCV）NS3区单克隆抗体的研制及特性分析

用淋巴细胞杂交瘤技术，制备出５株抗ＨＣＶ－ＮＳ３区单克隆抗体（ＭｃＡｂ）分别命名为Ｃ７－１，３，６，８，９。单抗特性测定结果显示５株单抗均为ＨＣＶ－ＮＳ３区特异性，与ＨＣＶ其它区域的抗原及宿主菌成份均无交叉反应，此５株单抗识别ＮＳ３区上两个不完全相关的抗原位点，其中Ｃ７－１，３，６株识别同一抗原决定簇，Ｓ７－９的识别位点与此３株有一定的相关，Ｃ７－８则识别与此４株不完全相关的位点。ＨＣＶ－ＮＳ３抗     

湖北地区丙型肝炎患者HCV基因分型及HCV NS5B耐药突变位点分析

目的:检测湖北地区丙型肝炎(丙肝)患者丙肝病毒(HCV)基因分型及HCV NS5B基因耐药突变位点的分布特征。方法:收集自2011-03-2014-05在本院确诊的来自湖北地区的丙肝患者外周静脉血标本273例,采用一代测序法检测每例样本的HCV和NS5B基因序列,将测得的序列与Blast进行在线比对后,统计分析HCV基因型和各亚型检出率,以及HCV NS5B耐药突变位点在HCV各基因亚型中的分布差异。结果:273例丙肝患者共检出1、2、3、6四种基因型和1a、1b、2a、3a、3b、6a六种基因亚型,其中1b亚型检出率较高,占76.19%(208/273),其次是2a亚型,占15.02%(41/273),其它各亚型检出率均不超过4.40%,各亚型检出率差异有统计学意义(P0.05)。HCV NS5B基因以L159F突变率较高,占17.95%(42/234),与其它位点的基因突变率差异有统计学意义(P0.05)。同时各个位点的耐药突变发生在2a亚型中的比例较高,达57.26%(134/234),显著高于其它亚型的耐药突变(P0.05)。结论:分析湖北地区丙肝患者HCV基因分型及HCV NS5B耐药突变位点的分布特点,可为该地区丙肝患者的个体化治疗提供指导依据。     

New findings in HCV genotype distribution in selected West European,Russian and Israeli regions

BackgroundHCV affects 185 million people worldwide and leads to death and morbidities. HCV has a high genetic diversity and is classified into seven genotypes and 67 subtypes. Novel anti-HCV drugs (Direct-Acting-Antivirals) eligibility, resistance and cure rates depend on HCV geno/subtype (GT).ObjectivesAnalysis of epidemiological information and viral GT from patients undergoing viral genotyping in 2011–2015.Study designAnonymized information from 52 centers was analyzed retrospectively.Results37,839 samples were included in the study. We show that the GT distribution is similar throughout Western European countries, with some local differences. Here GTs 1 and 2 prevalences are lower and of GT4 higher than in all previous reports. Israel has a unique GT pattern and in South Russia the GT proportions are more similar to Asia. GTs 5 and 6 were detected in very low proportions. Three cases of the recombinant genotype P were reported in Munich (Germany).In addition, we observed that GT proportion was dependant on patientś gender, age and transmission route: GTs 1b and 2 were significantly more common in female, older, nosocomially-infected patients, while GTs 1a, 3 and 4 were more frequent in male, younger patients infected by tattooing, drug consume, and/or sexual practices. In infections acquired by drug consume, GTs 1a (35.0%) and 3 (28.1%) prevailed. In infections related to sexual practices lower proportion of GT3 (14.0%) and higher of GT4 (20.2%) were detected. GT4 was mostly abundant in MSM (29.6%). HIV coinfection was significantly associated with higher proportions GTs 1a and 4 (42.5% and 19.3%, respectively).ConclusionGenotype prevalence evolves and correlates to epidemiological factors. Continuous surveillance is necessary to better assess hepatitis C infection in Europe and to take appropriate actions.     

丙型肝炎病毒非结构基因5b的变异及与干扰素治疗的关系

以聚合酶链反应直接序列分析方法测定了４例无症状慢性丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染者，与９例接受干扰素治疗的慢性丙型肝炎患者血清中ＨＣＶ非结构基因５ｂ（ＮＳ５ｂ）ｃＤＮＡ的序列。发现，与已发表的Ⅱ／１ｂ型ＨＣＶ序列相比，无症状慢性ＨＣＶ感染者的ＨＣＶ在核苷酸水平的同源性高于干扰素治疗有效的慢性丙型肝炎患者（９５．６５％±２．６１％比９４．３５％±２．２９％），后者又高于干扰素治疗无效的慢性丙型肝炎患者（９２．７０％±１．９０％）。还发现在干扰素治疗后，治疗无效者血清中ＨＣＶＮＳ５ｂｃＤＮＡ序列发生明显变化，在所测定的３８０个核苷酸中有９～４８个发生碱基替换，从而导致所编码的氨基酸中有６～２０个发生突变。结果提示，ＨＣＶＮＳ５ｂ基因变异与病情及干扰素治疗有一定关系。变异较大者常出现明显的临床表现，且干扰素治疗可能趋势于失败。     

广州地区肝炎患者血清中庚型肝炎病毒核酸检测和病毒核苷酸测序

目的 了解广州地区肝炎患者中庚型肝炎病毒（HGV）的感染情况及基因型特点。方法 采用逆转录－套式聚合酶链反应（RT－nested PCR)方法检测出肝炎患者血清中HGV RNA,引物位于HGV基因组的非编码区,并对扩增产物进行直接测序。结果 251例急慢性肝炎血清中共检出25例HGV RNA阳性,总阳性率为9．96％,其中56例非甲－戊型肝炎中要出4例阳性（7．14％）,77例乙型肝炎（HB）中检出8例阳性（10．39％）,118例丙型肝炎（HC）中检出13例阳性（11．17％）;2株HGV广州核苷酸之间的同源性为98．0％,与非洲洲的同源性分别为81．7％和84．2％,与美国株的同源性均为91．1％。结论 广州地区肝炎患者中存在HGV感染,2株HGV广州株可能为同一基因型,且与HGV美国株具有较高的同源性。     

广西HCV高危人群庚型肝炎病毒的新基因型核苷酸序列分析

目的 探讨广西HCv高危人群庚型肝炎病毒(HGv)的感染情况及其新基因型的核苷酸序列。方法 静脉药瘾者(IVDAs)85份、肝病患者(PLDs)80份和献血员(BDs)50份血清标本．用PCR法检测庚型肝炎病毒RNA，EIA法检测HBsAg、抗-HCV和抗-HIV；随机选出62份庚型肝炎病毒RNA阳性标本进行核苷酸序列分析，构建种系发生树作基因分型。结果 215份血清中HGv阳性者85份(39.53％)，HBsAg、抗-HGV和抗-HIV的阳性率分别为39.07％、42．79％和0；11份HGV RNA的测序结果证实其有3种基因型，其中5株为新基因型(亚洲型)，51份补测序，其中GBV—C型占3．23％，HGV型占30.65％，亚洲型占64．51％。结论 HGV的3种基因型中存在不同的基因亚型；广西IVDAs、PLDs和BDs中感染庚型肝炎病毒以亚洲型和HGV型为主。     

不同基因型HCV膜区（E2）基因克隆及亲、疏水性分析

目的 研究丙型肝炎病毒（HCV）不同基因型膜区序列变异及其变异规律。方法 克隆不同基因型HCV的膜区基因,序列测定,核苷酸和氨基酸序列比较和分析。结果 不同基因型膜区基因相似性不同,从同一血清样本获得的不同克隆间,其同源性核苷酸大于99．2％,氨基酸大于99．9％。相同亚型核苷酸和氨基酸同源性大于80％。同型基因核苷酸和氨基酸同源性分别为（63．9－75．0）％和（64．9－72．8）％。异型基因同源性核苷酸为（59．4－67．0）％,氨基酸为（56．5－66．3）％。氨基酸序列变化在某些部位有一定保守性。不同基因HCV高变区（HVR）的亲水性和疏水性变化小于其下游3′端区域。结论 HCV基因变化可能有一定规律性。     

福建省新分离3株乙型脑炎病毒的分子特征鉴定

目的　确定福建省新分离乙型脑炎病毒 (JEV)的基因分型及其E区段氨基酸序列特征。方法　用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)扩增并克隆新分离JEV(0 2 4 1、0 2 4 3、0 2 10 2 )的PrM、E区段核苷酸序列 ,测序后应用ClustalX软件做碱基配对和比较分析 ,种系发生采用PHYLIP软件包分析。结果　新分离的 3株JEV属于基因Ⅲ型 ,E区段核苷酸和氨基酸与减毒活疫苗株SA 14 14 2株的同源性均在 96 %以上 ,在关键结构域有部分氨基酸差异。结论　福建省新分离的 3株病毒属于基因Ⅲ型JEV ,E蛋白与疫苗株相比有部分氨基酸差异     

聚合酶链反应诱导丙型肝炎病毒(HCV)蛋白酶活性位点的突变及突变HCVNS3/4a蛋白的表达

目的 以聚合酶链反应（PCR）突变方法诱导丙型肝炎病毒（HCV）蛋白酶活性位点ser1165的突变，获得全长非结构基因3（NS3）／4a的表达与纯化。方法 分别以NS3 N端正向引物与诱变反向引物，诱变正向引物与NS4a C端反向引物获得2个PCR产物，产物纯化后在新的PCR反应体系中加入以上2个PCR产物与NS3 N端正向引物、NS4a C端反向引物。再次PCR扩增突变模板，分别与野生型模板重组入表达载体pET26-Ub，转化大肠杆菌BL21（DE3）pCG1，诱导表达后经菌体裂解、纯清化、硫酸铵沉淀、DEAE－Sepharose、NTA纯化，Western blot分析表达蛋白的特异性及PCR诱导突变使HCV蛋白酶活性位点失活的作用。结果 获得诱导突变的模板，Western blot证实该突变可完全阻断对NS3丝氨酸蛋白酶与NS3螺旋酶间的切割，部分阻断了螺旋酶与NS4a间的切割，纯化后的HCV NS3／4a蛋白在SDS－PAGE胶上显示为双带。结论 PCR突变方法简便、有效，获得丝氨酸蛋白酶失活的NS3蛋白表达，NS3蛋白与NS4a蛋白以复合物形式存在。     

丙型肝炎病毒基因分型及其与疾病程度、感染途径和干扰素疗效的关系

为探讨广州地区丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染的基因型及其与疾病程度、感染途径和干扰素疗效的关系，作者应用分型ＰＣＲ技术对１５６例抗－ＨＣＶ阳性患者血清ＨＣＶＲＮＡ进行分型检测，并分析不同程度肝病及不同感染途径ＨＣＶ基因型分布，且对５１例经干扰素治疗的慢性丙肝作分型评价。结果１２４例ＨＣＶＲＮＡ阳性中，Ⅱ型占９０．３％（１１２例），Ⅲ型占８．１％（１０例），Ⅱ／Ⅲ型混合感染占１．６％（２例），未检出Ⅰ、Ⅳ型，说明广州地区ＨＣＶ感染以Ⅱ型为主；不同程度肝病及不同感染途径之间ＨＣＶ基因型构成比无明显差异，表明基因型与疾病严重程度及感染途径关系不大；干扰素治疗病例，ＨＣＶ－Ⅱ、Ⅲ型感染的总应答数、完全应答数及部分应答数分别为１８／４１，１１／４１，７／４１和８／１０，６／１０，２／１０，提示Ⅲ型感染疗效较好，ＨＣＶ基因型似可作为选择干扰素治疗病例及判断疗效的参考指标，但是由于观察的Ⅲ型病例数较少，需积累更多的资料才能作出更客观的结论。