LH/EGF诱导ICR小鼠窦状卵泡卵母细胞体外成熟与排卵的研究

目的：利用医学研究常用ICR品系小鼠,在建立窦状卵泡体外培养体系的基础上,研究黄体生成素（luteinizing hormone,LH）与表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）诱导卵母细胞体外成熟及排卵的作用。方法：体外剥离得到大的窦状卵泡用于培养并建立适宜于研究诱导卵母细胞成熟及排卵的窦状卵泡体外培养模型,通过向培养液中添加LH和EGF诱导卵母细胞体外成熟与排卵。结果：成功构建了ICR小鼠窦状卵泡体外培养模型,发现LH或EGF单独处理均可诱导卵泡卵母细胞成熟和卵丘扩展,而两者共同作用才能够诱导卵泡体外排卵。结论：LH/EGF促进ICR小鼠窦状卵泡卵母细胞体外成熟与排卵。     

经后增殖方对超排卵大鼠卵母细胞分泌因子的影响

目的观察经后增殖方对超排卵大鼠卵母细胞分泌因子的影响。方法 30只雌性SD大鼠随机分为空白对照组、模型对照组、中药治疗组。模型对照组和中药治疗组建立超排卵模型,中药治疗组给予经后增殖方颗粒剂灌胃,模型对照组和空白对照组给予生理盐水灌胃,经颈椎脱臼处死后取卵巢组织。采用实时荧光定量PCR(qPCR)和蛋白印迹法(Western Blot)分别检测大鼠卵巢组织中GDF9、BMP15、FGF10mRNA及蛋白的表达。结果模型对照组GDF9、BMP15、FGF10 mRNA及蛋白表达均下降,与空白对照组比较差异具有显著性(P0.05)。中药治疗组各因子mRNA及蛋白表达水平均高于模型对照组,且差异具有统计学意义(P0.05)。中药治疗组GDF9、BMP15表达与空白对照组相比差异无统计学意义(P0.05),FGF10表达显著低于空白对照组(P0.05)。结论中药经后增殖方能促进超排卵大鼠卵母细胞分泌因子GDF9、BMP15、FGF10 mRNA及其蛋白的表达,推测中药通过提高其表达而改善卵母细胞质量。     

透明质酸对小鼠卵丘细胞外基质的影响

目的 观察透明质酸(HA)对小鼠卵丘细胞外基质的影响。方法 取3～4周龄的雌鼠(含野生型和bikunin基因敲除小鼠)诱导排卵，取卵丘-卵母细胞复合体(COC)，镜下计数诱导排卵后卵母细胞。免疫荧光双重染色后观察HA及血清来源的HA相关蛋白(SHAP)在卵丘细胞外基质的分布。结果 SHAP-HA复合体缺失引起卵丘细胞外基质的变化，并影响到随后的排卵。结论 SHAP-HA参与卵丘细胞外基质的构建．细胞外基质的受损引起卵母细胞功能的破坏。     

Bikunin基因敲除小鼠卵丘-卵母细胞复合体形态学变化

目的研究野生型和bikunin基因敲除小鼠卵丘-卵母细胞复合体显微和超微结构变化。方法用扫描电镜和光镜对诱导排卵后野生型和bikunin基因敲除小鼠卵丘-卵母细胞复合体结构上的变化进行观察。结果 （1）光镜显示,野生型小鼠中,卵丘细胞紧密围绕在卵母细胞周围;bikunin基因敲除小鼠中,卵丘细胞松散地分布在卵母细胞周围。（2）电镜显示,野生型小鼠可见大量的纤维网格状结构,卵丘细胞亦可见;bikunin基因敲除小鼠中,卵丘细胞之间未见有网状结构,卵丘细胞紧密连接少。（3）bikunin基因敲除小鼠卵丘-卵母细胞数明显低于野生型。结论 bikunin基因敲除小鼠卵丘细胞之间、卵丘细胞与卵母细胞之间结构发生变化,卵丘-卵母细胞数明显下降,该现象可能与卵丘-卵母细胞复合体的功能密切相关。     

卵母细胞分泌因子及其Smads信号通路与卵母细胞质量关系的研究进展

卵母细胞的质量在人类生殖能力、胚胎质量及人类辅助生殖技术妊娠结局方面发挥关键性作用。研究发现有多种方法可研究/评估卵母细胞质量,其中卵母细胞分泌因子(OSFs)中的生长分化因子-9(GDF-9)、骨形态发生蛋白-15(BMP-15)和骨形态发生蛋白-6(BMP-6)等是卵泡发育和卵巢功能的重要调节因子,其通过自分泌和旁分泌方式调控优势卵泡的形成及卵母细胞的质量。Smads蛋白家族是OSFs细胞内信号转导的重要因子。本文就OSFs及其Smads信号通路对卵母细胞质量影响的调节机制进行简要综述。     

雄激素对卵母细胞生长分化因子

通过观察雄激素对小鼠卵母细胞生长分化因子 9（growth differentiation factor 9,GDF 9）表达的影响，研究GDF 9参与卵泡生长发育及其表达调控机制，探讨GDF 9与多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)的关系。方法：以性成熟昆明小鼠为研究模型，体内实验分为实验组（注射丙酸睾丸酮）和对照组（注射等体积的生理盐水），每组各20只小鼠，采用原位杂交法检测卵巢组织GDF 9 mRNA的表达水平。体外实验：胶原酶消化加机械法分离性成熟昆明小鼠卵泡进行体外培养，实验组培养液中加睾丸酮,对照组不加睾丸酮,72?h后收集卵泡，免疫组化检测卵母细胞GDF 9的表达水平。结果：体内实验：实验组较对照组卵巢组织GDF 9 mRNA表达水平降低, 差异有统计学意义（P＜0.05）；体外实验：实验组卵母细胞GDF 9蛋白表达较对照组降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：雄激素减弱卵母细胞GDF 9 mRNA和蛋白的表达强度；表达强度降低的GDF 9可能与PCOS卵泡发育停滞有关     

补肾法对控制性超促排小鼠卵丘扩展分级及相关因子HAS2、TNFAIP6的影响

目的研究补肾调经Ⅱ号方、Ⅲ号方序贯给药对小鼠卵丘卵母细胞复合物(COCs)卵丘扩展分级情况及卵丘扩展相关因子透明质酸合成酶2(HAS2)、肿瘤坏死因子α刺激因子-6(TNFAIP6)表达的影响。方法将120小鼠随机分为正常组、模型组、补肾组。模型组、补肾组第1～9天腹腔注射醋酸丙氨瑞林(GnRHa),第9天同时注射血清促性腺激素(PMSG),48 h后注射绒毛膜促性腺激素(hCG),正常组注射等体积生理盐水;补肾组第1～9天灌胃补肾调经Ⅱ号方,第10～11天灌胃补肾调经Ⅲ号方,正常组与模型组灌胃等体积蒸馏水。注射生理盐水或hCG 6、9、12 h后在体式显微镜下取出卵丘卵母细胞复合物(COCs),观察卵丘扩展分级并计数,收集COCs,免疫荧光染色、实时荧光定量PCR检测卵丘扩展相关因子蛋白及mRNA的表达。结果与正常组相比,模型组的卵丘扩展分级情况及卵丘扩展相关因子的mRNA表达水平差异无统计学意义(P0.05);与正常组和模型组相比,补肾组的卵丘扩展分级呈现低级别扩展率降低、高级别扩展率升高的特点(P 0.05);注射生理盐水或hCG 6 h,正常组、模型组和补肾组3组间HAS2 mRNA的表达水平差异无统计学意义(P 0.05);注射生理盐水或hCG 9、12 h,与正常组和模型组相比,补肾组HAS2 mRNA的表达水平升高(P0.05);注射生理盐水或hCG6、9、12 h,补肾组TNFAIP6 mRNA的表达水平升高(P0.05)。结论补肾调经Ⅱ号方、Ⅲ号方序贯给药可促进小鼠COCs的卵丘扩展,推测其可能的机制与上调卵丘扩展相关因子HAS2、TNFAIP6 mRNA的表达有关。     

表皮生长因子调节小鼠卵丘卵母细胞复合体卵丘细胞扩散及激素分泌的研究

目的　研究表皮生长因子 (EGF)对小鼠GV期卵丘卵母细胞复合体 (COC)卵丘细胞扩散以及对孕酮 (P)、雌二醇 (E2 )合成的影响 ,探讨EGF对卵巢功能的调节作用。方法　GV期COC在EGF的浓度为 0、2、5、10、15 μg·L-1的培养基中体外培养 48h ,每组COC数为 5 5～ 65。以不含EGF的培养组为对照组 ,观察 2 4、3 6、48h时各组卵丘细胞扩散情况 ,测定培养终末上清液中P及E2 的含量。结果　在含不同浓度EGF培养基中培养的 4组 ,其 2 4h、3 6h、48h的Ⅱ度和Ⅲ度扩散率均大于对照组 (P <0 .0 5或P <0 .0 1) ;EGF含量为 5、10、15 μg·L-1的培养组E2 分泌低于对照组 (P <0 .0 5或P <0 .0 1) ;不同EGF含量的培养组P的分泌较对照组增加 (均为P <0 .0 1)。结论　EGF能促进卵丘细胞扩散 ,抑制E2 合成 ,促进P分泌。     

经后增殖方含药血清对超排卵大鼠卵巢COCs及CCs中GDF9与Bim表达的影响

目的 观察经后增殖方含药血清对超排卵大鼠卵巢的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)及卵丘细胞(CCs)中生长分化因子9(GDF9)及Bim表达的影响,探讨其治疗效果及作用机制.方法 制备大鼠超排卵卵巢模型,收集COCs和CCs,分别与雌性SD超排卵大鼠空白血清和经后增殖方药物血清在体外共同培养,各分3组:空白血清组(空白组)、含药血清组(对照组)、含药血清+ GDF9受体阻断剂组(实验组),共6组.24 h后收集COCs和CCs,实时荧光定量PCR检测GDF9和Bim mRNA表达水平,蛋白质印迹法检测GDF9蛋白表达水平.结果 (1)对照组COCs中GDF9 mRNA表达水平明显高于空白组和实验组(P＜0.05);对照组和实验组COCs中Bim mRNA表达水平均明显低于空白组(P＜0.05);对照组COCs中GDF9蛋白表达水平明显高于空白组(P＜0.05),亦高于实验组,但差异无统计学意义(P＞0.05).(2)CCs中GDF9 mRNA表达水平在3组间的差异性比较结果与COCs中一致;对照组和实验组CCs中Bim mRNA表达水平均明显低于空白组(P＜0.05);对照组CCs中Bim mRNA表达水平明显低于实验组(P＜0.05);对照组CCs中GDF9蛋白表达水平明显高于空白组和实验组(P＜0.05).(3)对照组COCs中GDF9 mRNA表达水平明显高于CCs中(P＜0.05),其余组内COSs和CCs比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 经后增殖方舍药血清能提高COCs和CCs中GDF9的表达水平,维持COCs和CCs中Bim的低水平表达,抑制细胞凋亡,促进卵泡发育;COCs较剔除卵母细胞的CCs更有利于GDF9 mRNA的表达.     

补肾调经方、逍遥丸对促排卵小鼠排卵前卵巢卵母细胞分泌因子表达的影响

目的探讨补肾调经方、逍遥丸对促排卵小鼠排卵前卵巢中影响排卵率的重要因子卵母细胞分泌因子生长分化因子-9(GDF-9)、骨形态发生蛋白-15(BMP-15)蛋白及其mRNA表达的影响,分析补肾法、疏肝法诱发排卵可能的分子机制。方法将性未成熟雌性小鼠随机分为对照组、补肾组和疏肝组,均于第3天腹腔注射血促性素(PMSG)5 IU/只、第5天腹腔注射绒促性素(h CG)5 IU/只,补肾组、疏肝组分别灌服补肾调经方(其中第1~3天灌服Ⅱ号方18.70 g/kg,第4~5天灌服Ⅲ号方28.57 g/kg)和逍遥丸(其中第1~3天灌服高剂量2.34 g/kg,第4~5天灌服低剂量1.17 g/kg)促进卵泡发育并诱发排卵,实时荧光定量PCR、Western blot、免疫组化分析注射h CG后0、8、12h卵巢GDF-9、BMP-15蛋白及其mRNA的表达。结果与对照组比较,补肾调经方、逍遥丸均可使促排卵小鼠在注射h CG后8、12 h GDF-9、BMP-15 mRNA及其蛋白的表达均升高(均P0.05)。结论补肾调经方、逍遥丸通过对促排卵小鼠排卵前卵巢卵母细胞分泌因子GDF-9、BMP-15蛋白及其mRNA表达的影响,促进卵泡颗粒细胞增殖、卵丘扩散、卵母细胞成熟,进而发挥促进诱发排卵的作用。     

人精子激活卵细胞包相关因子检测方法的建立

目的:建立卵胞浆内单精子注射技术(ICSI)前人精子激活卵细胞相关因子检测方法.方法:选用20～25 g昆明雌性白鼠,超排卵取卵细胞,上游法优选人正常精子显微注射,对实验中一些环节进行观察比较.结果:显微注射针内径5～7 μm较适合人精子与鼠卵细胞之间的注射,小鼠卵细胞体外培养2 h左右进行显微注射效果较好,显微注射人精子的鼠卵细胞激活率与实验对照组、空白对照组比较,前者有较高的激活率,激活过程不易受操作程序及自发激活的影响,与人卵细胞接近.结论:此模型可用于ICSI前人精子激活能力的检测.     

人卵母细胞成熟过程中卵丘细胞与卵母细胞关系的研究进展

人卵母细胞和卵丘细胞（cumulus cell, CC）之间存在双向通讯,在卵泡内,卵母细胞的发育高度依赖于与卵丘细胞的联系。卵母细胞通过分泌有效的生长因子（oocyte-secreted factors, OSFs）介导卵丘细胞分化,卵丘细胞则通过缝隙连接传递信号并在卵泡发育的后期阶段支持卵母细胞的生长,进一步促进卵母细胞成熟和受精。本文将综述人卵母细胞成熟中卵丘细胞与卵母细胞之间的重要关系及有关作用机制,为提高体外成熟（IVM）技术中卵母细胞的质量提供新的帮助。     

一种简易的促排卵周期挽救性卵子体外成熟培养技术

【目的】 探讨人类成熟卵丘细胞在未成熟卵母细胞体外成熟培养中的作用,并建立一种简易的实施技术&#65377;【方法】 在控制性促排卵周期有未成熟卵母细胞时,将同周期成熟卵丘复合体切出部分卵丘细胞,用1 mL注射器抽打分散细胞,贴壁培养&#65377;113个治疗周期中,298枚生发泡期卵母细胞经3种不同培养液(A&#65380;B&#65380;C)体外成熟培养(同一病人的生发泡期卵被随机分到某同一组中):第1组28个周期中73枚(A液):基础培养液+卵泡液;第2组40个周期中115枚(B液):A液 + 分散贴壁的卵丘细胞;第3组45个周期中110枚(C液):A液 + 分散贴壁的卵丘细胞 + 促卵泡生成激素 + 表皮生长因子&#65377;观察其成熟率&#65380;受精率及可用胚胎获得率等&#65377;【结果】 24 h成熟率:组间比较有显著性差异(A: 45.2%, B: 61.7%, C: 78.2%, P < 0.05); 25 ~ 48 h无显著意义&#65377;成熟卵的正常受精率在59% ~ 67%之间,组间比较无显著差异;与第1组(54.5%,11.0%)相比,第2组(83.3%,25.2%)&#65380;第3组(90.7%,37.3%)的卵裂率和挽救率均有显著性差异(P < 0.05),可用胚胎获得率组间比较依次呈现上升趋势(66.7%,82.9%,83.7%)&#65377; 【结论】 来自控制性促排卵周期的成熟卵丘细胞经简易吹打分散后贴壁培养,可能能协同卵泡液中或外加的生长因子,促进未成熟卵母细胞的体外成熟,而本研究技术简易有效,可用于挽救促排卵周期的未成熟卵&#65377;     

小鼠卵母细胞玻璃化冷冻的研究

目的　对小鼠卵母细胞玻璃化的方法和冷冻液进行研究。方法　用两种玻璃化冷冻液EFS4 0 (高钠 )、DEFS4 0 (低钠 )对ICR、C57BL 6J小鼠卵母细胞进行冷冻 ,0 5mol L蔗糖液解冻 ,体外授精前对部分解冻后的C57BL 6J小鼠卵母细胞进行透明带切割。结果　DEFS4 0冷冻液冷冻效果明显高于EFS4 0冷冻液 ,ICR小鼠卵母细胞解冻后成活率达 75 2 %、体外授精率 (2 4 6 % )与对照组相比差异无显著性 ,C57BL 6J小鼠卵母细胞解冻后成活率为 87 1%、卵母细胞切割后体外受精率 (36 0 % )与对照组相比差异也无显著性。结论　冷冻液中钠离子浓度影响小鼠卵母细胞冷冻效果 ,用DEFS4 0 (低钠 )冷冻液进行玻璃化冷冻可以取得理想的冷冻效果。     

改进的核移植方法完成小鼠卵丘细胞重组胚的早期发育

目的建立一种快速、简便、有效且损伤小的核移植方法，研究来源于小鼠体细胞重组胚的早期发育。方法用尖锐的去核针在MⅡ期卵母细胞透明带上切开一个25mm左右的小口，首先将第一极体挑出．再轻轻地挤压和负压吸引卵母细胞，去除包含有MⅡ期染色体．纺锤体复合体的最少量细胞质。随后，将直径为10～12mm的C57BL／6j小鼠卵丘细胞核注射到去核卵母细胞透明带下，构建供体核．卵母细胞复合体。用电融合的方法诱导复合体融合．并对重组胚激活。体外培养72h．对重组胚发育到2细胞、4～8细胞和桑椹胚期等各阶段进行观察和计数。结果完成一个MⅡ期卵母细胞去核的平均时间为15s；Hoechst 33342染色证明可以完全去除MⅡ期卵母细胞细胞核；去核成功率为95．5％，注核成功率为76．7％，供体核．卵母细胞复合体融合和重组胚原核形成率分别为68.2％和62.2％；重组胚体外培养72h内发育到2细胞、4-8细胞和桑椹胚期的比率分别为57．5％、39．1％和27．6％；用2个微卫星位点D7Mit22和D4Mit204引物，扩增不同发育阶段重组胚的DNA片段，表明重组胚来源于供体卵丘细胞。结论应用改进的核移植方法，不仅可以有效地去除卵母细胞细胞核，去核成功率高，而且操作简便，去核迅速，对卵母细胞损伤小．是研究小鼠体细胞核移植的一种简便可行的新方法。     

昆明小鼠成熟卵母细胞体外受精及受精卵体外培养的研究

目的通过比较获能受精液成分及成熟卵母细胞的处理方法，观察对昆明小鼠体外受精(IVF)效果的影响和用于早期胚胎培养的三种发育培养液培养效果，探讨并建立起适合于昆明小鼠卵子体外受精与受精卵体外发育的实验体系。方法用T6或FM两种获能受精液对采自昆明雄鼠附睾尾的精子与成熟卵母细胞进行体外受精(IVF)，受精前对成熟卵母细胞选用透明质酸酶去除卵丘细胞和不去卵丘细胞(对照组)两种方法进行处理，受精卵分别用M16、改良的CZB液(mCZB)和改良的M16液(mM16)三种发育培养液对体外受精胚进行培养。结果选用FM获能受精液的受精率极显著高于T6液(92．3％对64．7％)，且体外受精前先用透明质酸酶处理的成熟卵母细胞比对照组成熟卵母细胞受精率要低(59．2％对64．7％)，但差异不显著；用mM16培养液进行培养时桑胚率及囊胚率(55．3％和35．6％)显著高于mCZB(13．3％和8．1％)和M16培养液(17．3％和14．7％)，后两者差异不显著。结论昆明小鼠卵子体外受精时宜选用FM受精获能液，不宜用透明质酸酶去除卵丘细胞，且宜选用mM16培养液对昆明小鼠体外受精卵进行早期培养，其中的亚硫磺酸钠可有效的克服2-细胞胚后的体外发育阻滞现象。