Tom70/PNPT1线粒体转位调控在大鼠心肌细胞缺氧性损伤中的作用及其机制

目的 探讨线粒体外膜转位酶70(Tom70)/多核糖核苷酸核苷转移酶1(PNPT1)线粒体转位调控在大鼠心肌细胞缺氧性损伤中的作用及其机制。方法 (1)将大鼠H9C2心肌细胞分为对照组(常氧条件培养12 h)与缺氧组(缺氧干预12 h)，采用流式细胞术检测心肌细胞凋亡率，qPCR检测TUBA mRNA表达情况，Western blotting检测PNPT1蛋白表达情况。(2)利用携带Tom70序列的慢病毒载体转染H9C2细胞，分为NC组(慢病毒阴性对照组，转染慢病毒空载体)、Tom70过表达组(转染携带Tom70序列的慢病毒载体)、缺氧+NC组、缺氧+Tom70过表达组，采用Westernblotting检测各组Tom70、PNPT1蛋白表达水平，采用流式细胞术检测缺氧+NC组、缺氧+Tom70过表达组细胞凋亡率，qPCR检测缺氧+NC组、缺氧+Tom70过表达组TUBA mRNA表达情况，免疫共沉淀技术检测细胞中Tom70与PNPT1的相互作用情况。结果 (1)流式细胞术检测结果显示，与对照组比较，缺氧组细胞凋亡率明显增高(P<0.05)。qPCR检测结果显示，与对照组比较，缺...     

慢病毒介导的siRNA靶向CD47基因对人喉癌细胞Hep-2增殖、凋亡的影响

目的 探究慢病毒载体介导siRNA抑制CD47基因表达后对人喉癌细胞株Hep-2体外增殖凋亡的影响.方法 构建慢病毒载体,将靶向CD47基因的siRNA慢病毒转染至Hep-2细胞;用荧光显微镜行细胞形态学变化观察;RT-PCR检测细胞CD47 mRNA表达的变化;Western blotting检测CD47蛋白表达的变化情况;MTT法检测细胞的增殖凋亡情况.结果 CD47-siRNA慢病毒转染Hep-2细胞后,形态学观察显示CD47-siRNA能有效抑制Hep-2细胞增殖,细胞变形明显,体积变小,可见细胞坏死及凋亡.RT-PCR和Western blotting检测显示,CD47的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P＜0.05),使CD47 mRNA表达减少76％～82％,CD47蛋白表达减少77％;慢病毒转染细胞在48h后MTT检测细胞凋亡率明显提高(P＜0.01).结论 慢病毒介导的siRNA干扰CD47基因表达后,明显抑制了喉癌Hep-2细胞CD47的表达并且诱导了Hep-2凋亡.     

携带Bcl-2基因的慢病毒对原代培养的人卵巢颗粒细胞的影响

目的探讨携带Bcl-2基因的慢病毒对体外培养的原代人卵巢颗粒细胞感染效率及对细胞凋亡的影响。方法构建携带Bcl-2基因的慢病毒载体,包装成高滴度慢病毒,将重组慢病毒在体外分别以不同感染复数(MOI)值(10、50、100、200、400)感染人卵巢原代颗粒细胞,观察感染24、48、72、96h后的感染效率及细胞增殖情况;将人卵巢颗粒培养24h后,分为3组。实验组:加MOI值为100的重组慢病毒GC-FU-Bcl-2;空白对照组:不加病毒;空载体对照组:加空载病毒GC-FU-EGFP。转染后第3、7天,采用Western blotting及反转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测目的基因Bcl-2在人卵巢原代颗粒细胞中的蛋白及mRNA的表达水平。同时转染后第3天采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果原代培养的人卵巢颗粒细胞24h即贴壁,集落样生长,呈多角形或梭形;当MOI为100时,细胞的形态和生长不受影响,且感染效率较高,感染后72h达高峰,感染率达60%。携带Bcl-2基因的慢病毒感染靶细胞后,实验组中检测到Bcl-2基因及蛋白的表达,且卵巢颗粒细胞的凋亡率明显低于空载体对照组。结论携带Bcl-2基因的慢病毒感染原代培养的人卵巢颗粒细胞后可过度分泌Bcl-2蛋白,抑制细胞凋亡。     

DEK基因RNAi慢病毒表达载体的构建及其功能鉴定

目的：构建DEK基因的RNA干扰（ RNAi）慢病毒表达载体,并对其生物学功能进行初步检测。方法采用RNAi技术,根据DEK基因的序列,确定其有效靶序列,合成DEK基因的Oligo DNA,退火形成双链DNA,将其克隆到经BamHⅠ与EcoRⅠ酶切后的小干扰RNA（ siRNA）表达载体PSIH-H1上,产生PSIH-H1-DEK慢病毒载体,筛选阳性克隆并测序鉴定。与3个包装质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒后感染乳腺癌细胞ZR75-1,经嘌呤霉素（ puromycin,puro）筛选2周后,收集部分细胞利用实时聚合酶链反应（ real time-PCR,RT-PCR）和Western印迹分别检验DEK在信使RNA （ mRNA ）和蛋白水平的敲低效果,并通过细胞生长实验检测DEK对人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞生长的影响。结果 PCR和DNA测序结果证实,DEK siRNA慢病毒表达载体PSIH-H1-DEK构建成功。 RT-PCR和Western印迹结果显示,构建的DEK siRNA可有效抑制DEK基因的表达,并由此建立了敲低DEK的稳定克隆。生长曲线实验表明, DEK siRNA可抑制人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞的生长。结论成功构建了DEK基因的RNAi慢病毒表达载体,感染人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞后,有效沉默了ZR75-1细胞中的DEK基因的表达,为进一步研究DEK基因在乳腺癌中的作用奠定基础。     

PCGF1过表达慢病毒载体的构建及稳定过表达A549细胞系的建立

目的 构建人多梳家族环指蛋白1(PCGF1)基因的慢病毒载体,建立稳定表达PCGF1基因的细胞系.方法 根据人PCGF1序列设计并合成引物,以A549细胞cDNA为模板,PCR扩增目的基因.双酶切目的基因并插入pLVX-IRES-puro质粒,对重组质粒进行慢病毒包装,用包装好的病毒感染A549细胞系,通过嘌呤霉素筛选阳性表达细胞,Western blotting验证PCGF1表达情况.结果 重组质粒经测序分析正确,瞬时转染293T细胞后,Western blotting验证PCGF1表达明显升高.包装慢病毒颗粒后感染A549细胞,经嘌呤霉素筛选后,Western blotting验证得到PCGF1稳定过表达的A549细胞系.结论 成功构建了pLVX-IRES-PCGF1-puro慢病毒过表达载体和PCGF1稳定过表达的A549细胞系,为进一步研究PCGF1的功能奠定了基础.     

慢病毒载体介导HIF-1α RNAi对人胰腺癌细胞Patu8988相关基因表达的影响

目的 探讨慢病毒表达载体介导HIF-1α RNA干扰(RNAi)对人胰腺癌细胞Patu8988HIF-1α和Glut-1表达的影响.方法 构建针对HIF-1α基因的RNAi慢病毒表达载体LV-RNAi-HIF-1α.乏氧条件下体外培养4h,转染LV-RNAi-HIF-1α的Patu8988细胞为实验组;转染空病毒载体和未转染任何病毒载体Patu8988细胞分别为阴性对照组和空白对照组.采用荧光定量RT-PCR和Western印迹法检测Patu8988细胞HIF-1α表达情况,采用RT-PCR法检测转染LV-RNAi-HIF-1α后Patu8988细胞Glut-1的表达情况.采用SPSS 17.0软件行单因素方差分析和两样本t检验分析各组之间的差异.结果 构建的慢病毒表达载体LV-RNAi-HIF-1α,在常氧和乏氧状态下致HIF-1α mRNA表达分别下降65.1％(0.209/0.321)和80.6％ (0.791/0.982)(t=10.52和15.24,均P＜0.05),阴性对照组分别为0.6％(0.002/0.321)和7.2％(0.071/0.982)(t=5.26和7.38,均P＜0.05);乏氧状态下实验组、阴性对照组和空白对照组HIF-1α蛋白的表达分别为0.159±0.010、0.745±0.012和0.711±0.023,差异有统计学意义(F=35.52,t=6.72和10.56,均P＜0.05),实验组较其他2组表达下降;乏氧条件下实验组Glut-1 mRNA表达(0.040±0.003)较阴性对照组(0.054±0.003)和空白对照组(0.062±0.004)均有明显下降(F=35.28,t=5.94和8.55,均P＜0.01).结论 通过构建LV-RNAi-HIF-1α慢病毒表达载体沉默HIF-1α基因表达,可降低Patu8988胰腺癌细胞Glut-1 mRNA表达.     

TRPV1修饰BMSCs治疗脑缺血再灌注损伤大鼠的研究

目的探讨SPIO标记3.0T磁共振成像辅助示踪技术在TRPV1基因修饰BMSCs治疗脑缺血再灌注损伤大鼠的相关影响。方法提取并培养鼠源骨髓间充质干细胞(BMSCs),利用流式细胞仪进行鉴定。通过Cas-9技术构建TRPV1的过表达载体,利用慢病毒转染BMSCs,根据病毒转染情况将BMSCs分成3组,即空白对照组、阴性对照组和过表达载体组。利用RT-PCR和Western blot法检测TRPV1过表达载体转染后对BMSCs的促神经分化作用。利用超顺磁性氧化铁(SPIO)试剂盒标记BMSCs染色,构建缺血再灌注损伤SD大鼠模型。利用3.0T磁共振成像SPIO标记BMSCs的归巢检测。结果 1) BMSCs的表面蛋白CD44和CD29的表达为60.2%和58.3%; CD34和CD45表达为3.4%和2.6%;2)慢病毒可以将TRPV4过表达载体质粒转染至BMSCs细胞内,且效率较高,为90%以上; 3)体外细胞实验结果显示,过表达载体组TRPV4,Peripherin和NSE的mRNA相对表达量和蛋白表达量要明显高于空白对照组和阴性对照组(P 0.05); 4) BMSCs细胞可以与超顺磁性氧化铁(SPIO)相结合,从而可以作为示踪分子,检测后续BMSCs细胞尾静脉注射后BMSCs的示踪行为; 5)相较于BMSCs组,将TRPV1基因过表达载体转染BMSCs后,可以更好的保护脑组织。结论TRPV1过表达载体可以促进BMSCs向神经细胞分化,且对缺血再灌注损伤SD大鼠具有一定程度的保护作用。     

鞘鞍醇激酶-2在转化生长因子-β1诱导心脏成纤维细胞增殖与活化过程中作用

目的探讨鞘鞍醇激酶-2(SPHK2)在转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导心脏成纤维细胞增殖与活化中的作用。方法分离乳鼠心脏成纤维细胞并体外培养。利用慢病毒分别将对照或SPHK2小分子干扰RNA(siRNA)转染心脏成纤维细胞。采用Western blot检测siRNA对SPHK2蛋白的干扰效率;采用酶联免疫吸附法检测心脏成纤维细胞1-磷酸鞘鞍醇(S1P)水平;采用TGF-β1处理诱导对照组和SPHK2 siRNA组心脏成纤维细胞增殖与活化后,CCK8法检测心脏成纤维细胞增殖能力,Western blot检测心脏成纤维细胞活化的标记蛋白α-平滑肌激动蛋白(α-SMA)的表达,q-PCR检测心脏成纤维细胞胶原蛋白Ⅰ(ColⅠ)和胶原蛋白Ⅲ(ColⅢ)的mRNA水平。结果慢病毒转染SPHK2 siRNA后,心脏成纤维细胞SPHK2蛋白表达水平显著低于对照组,组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。SPHK2 siRNA组心脏成纤维细胞S1P水平显著低于对照组,组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。给予TGF-β1处理后,SPHK2 siRNA组心脏成纤维细胞增殖能力、α-SMA蛋白和mRNA表达、ColⅠ和ColⅢ的mRNA表达显著低于对照组,组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论下调SPHK2表达可抑制TGF-β1诱导心脏成纤维细胞的增殖与活化。     

人MDC1基因shRNA反转录病毒载体的构建及鉴定

目的 建立反转录病毒介导的MDC1基因RNA干扰表达体系并观察其在官颈癌细胞(HeLa)中对MDC1表达的影响.方法 将人MDC1基因的RNA干扰双链DNA片段重组到反转录病毒质粒pSilencer5.1-H1 Retro中,构建携带人MDC1基因的RNA干扰反转录病毒载体psiRNA-MDC1.经PT67细胞包装后,产生的莺组反转录病毒感染宫颈癌细胞株HeLa细胞,并用嘌呤霉素筛选稳定的细胞克隆.采用RT-PCR和Western blotting检测细胞中MDC1 mRNA和蛋白表达的变化.结果 重组psiRNA-MDC1质粒经测序鉴定正确;重组反转录病毒感染HeLa细胞后用嘌呤霉素筛选出稳定的细胞克隆;RT-PCR和Western blotting检测人MDC1 mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照组和未十扰组.结论 携带人MDC1基因RNA干扰双链DNA片段的反转录病毒感染HeLa细胞后能明显抑制MDC1 mRNA和蛋白表达,为进一步研究MDC1在宫颈癌中的作用奠定了基础.     

大鼠B细胞淋巴瘤-2基因的克隆及其慢病毒表达载体的构建

目的 克隆大鼠B细胞淋巴瘤-2(bcl-2)基因全长cDNA,构建及鉴定大鼠bcl-2基因慢病毒表达载体.方法 采用RT-PCR法从大鼠脾脏组织中扩增全长bcl-2 cDNA,将扩增产物克隆至pMD18-T载体中,测序正确后,将基因连接到慢病毒载体pGC-FU(含EGFP 基因)中,构建慢病毒载体表达质粒pGC-FU-bcl-2,将pGC-FU-bcl-2质粒和包装质粒(pHelper1.0、pHclp-er2.0)共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞后,细胞即可分泌携带bcl-2基凶的重组慢病毒.将重组慢病毒感染293T细胞,通过Western blot-ring鉴定目的 蛋白bcl-2的表达.结果 经DNA序列分析测定证实大鼠bcl-2基因序列与GenBank中一致;pGC-FU-bcl-2中携有正确的bcl-2基因,并能转染人胚肾上皮细胞;pGC-FU-bcl-2及包装质粒共转染包装细胞293T细胞能产生重组病毒pGC-FU-bcl-2;目的 基因bcl-2能被重组慢病毒高效地转导人人胚肾上皮细胞中,并达到稳定表达,荧光显微镜下能直接观察到荧光蛋白,Westernblotting能榆测到bcl-2蛋白在靶细胞中的表达.结论 成功克隆了大鼠bcl-2基因并构建了重组慢病毒载体,包装出高浓度慢病毒,转染人胚肾上皮细胞后能够稳定表达bcl-2基因,为进一步研究该基因的功能及细胞凋亡相关疾病的治疗奠定了基础.     

SHIP基因真核表达载体的构建、鉴定及对白血病细胞系K562的抑制作用

目的 构建真核表达质粒pCAC-IRESSHIP-GFP,并观察其在K562细胞中的表达. 方法 将SHIP基因的RT-PCR产物克隆入载体pCAG-IRES-GFP,经酶切、鉴定及测序分析,构建pCAG-IRESSHIP-GFP重组真核表达质粒.实验设置3个组:K562组(未转染)、K562/IRES组(转染宅载体pCAG-IRGA-GFP),K562/SHIP)组(转染重组质粒pCAC-IRES-SHIP-GFP).荧光显微镜和流式术榆测重组质粒的转染效率;Western blotting检测各组SHIP蛋白的表达及Akt磷酸化水平变化;MIT法和流式术分析SHIP基凶转染对细胞增殖的影响. 结果 重组质粒pCAG-IRESSHIP-GFP已成功载人SHIP的全长编码基凶,序列测定的结果与预期设计完全一致.荧光显微镜在K562/SHIP组町见绿色荧光,转染效率为4&2%±6.6%.Westem blotting显示K562/SHIP组有明显的SHIP蛋白表达,且p-Akt-308和p-Akt-473的水平(分别为0.182和0.381)较K562/IRES组(0.361和0.716)和K562组(0.365和0.725)明显下降(P＜0.01).流式术分析显示K562/SHIP组细胞生长减慢,G0/G1期细胞增多、G2/M期细胞减少,增殖指数降低. 结论 成功构建了3 585bp的SHIP基因真核表达质粒pCAG-IRES-SHIP-GFP,并在K562细胞中表达.外源性SHIP基因转染能使K562细胞增殖受抑,原因可能与Akt的磷酸化下调有关.     

醋酸铅对人肾小球系膜细胞凋亡及Caspase-3表达的影响

目的探讨醋酸铅对人肾小球系膜细胞(HRMC)凋亡及Caspase-3表达的影响。方法取对数生长期的HRMC,分别采用含0、5、10、20μmol/L醋酸铅的完全培养液培养,于6、12、24、48h后以MTT法检测细胞增殖情况,并于培养24h后采用Hochest33342-PI染色法观测细胞的形态学变化,RT-PCR检测Caspase-3 mRNA的表达,细胞免疫化学法和Western blotting检测Caspase-3蛋白的表达。结果与对照组(0μmol/L)相比,5、10、20μmol/L的醋酸铅可不同程度地抑制HRMC的增殖(P<0.01)。Hochest33342-PI染色显示醋酸铅作用后HRMC呈凋亡形态学改变,细胞数量减少,核染色质凝集,核膜破裂。RT-PCR显示醋酸铅作用后Caspase-3 mRNA表达升高。细胞免疫化学和Western blotting检测显示醋酸铅作用后Caspase-3蛋白表达升高。结论醋酸铅可促进人肾小球系膜细胞凋亡,Caspase-3参与了该过程。     

RGD修饰携带tumstatin及eGFP新型腺病毒载体的构建及其表达研究

目的 构建RGD修饰表达绿色荧光蛋白(eGFP)和肿瘤抑素(tumstatin)的新型腺病毒载体.方法 PCR扩增tumstatin基因,经克隆后构建pAd5-CMV/tumstatin穿梭载体.重叠PCR方法将RGD序列插入到Ad5纤维蛋白的HI环中,获得pMfiber-RGD穿梭载体.穿梭载体与腺病毒骨架载体线性化后共转化E.coli BJ5183,构建pAd-RGD-eGFP骨架载体.最后,使用磷酸钙法将pAd5-CMV/tumstatin穿梭载体和pAd-RGD-eGFP骨架载体共转化HEK293细胞.7～10d后收集细胞裂解物得到Ad-RGD-tumstatin/eGFP病毒.将经过修饰的Ad-RGD-tumstatin/eGFP和未修饰的Ad-WT-tumstatin/eGFP病毒分别感染脑胶质瘤U87MG细胞(病毒剂量分别为1、10、100Vp/细胞),通过观察其荧光强度评估其感染效率.以上两种病毒分别感染HeLa细胞,并分别采用RTPCR及Western blotting检测tumstatin细胞mRNA及培养上清中蛋白的表达水平.结果 病毒感染48h后,可观察到修饰后的腺病毒Ad-RGD-tumstatin/eGFP对U87MG细胞的感染效率明显高于未修饰的腺病毒Ad-WT-tumstatin/eGFP.RT-PCR及Westem blotting可检测剑感染Ad-RGD-tumstatin/eGFP后的HeLa细胞中tumstatin的转录和表达.结论 成功构建经RGD修饰并表达tumstatin和eOFP基因的新型腺病毒载体,为进一步研究tumstatin在低表达柯萨奇一腺病毒受体的肿瘤中的作用奠定了良好基础.     

人THAP11基因RNAi慢病毒表达系统的建立

目的构建人THAP11基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体,制备高滴度病毒颗粒,敲低K562细胞和脐带血CD34＋细胞中THAP11表达。方法采用第三代慢病毒包装系统,将含有特异性干涉THAP11的DNA序列克隆入穿梭质粒pSicoR中,构建siTHAP11-pSicoR质粒。在脂质体介导下,siTHAP11-pSicoR与包装质粒pLP1,pLP2,pLP/VSVG共转染HEK293T细胞,获得高滴度慢病毒颗粒。感染K562细胞,检测内源THAP11敲低效果。感染人CD34＋细胞,流式分选GFP阳性细胞,检测原代细胞中THAP11的敲低效果。结果成功构建针对THAP11两个位点的RNAi慢病毒载体siTHAP11-1和siTHAP11-2并获得慢病毒颗粒,病毒滴度检测可达1.8×108TU/ml。感染K562细胞后建立稳定株,THAP11的蛋白水平和mRNA水平均有下调。感染CD34＋细胞效率达30%以上,siT-HAP11-1可下调THAP11mRNA约80%,siTHAP11-2约下调85%。结论成功构建THAP11的RNAi慢病毒载体,包装后的病毒颗粒可有效敲低细胞株及原代细胞中内源性THAP11的表达,为后续研究THAP11对CD34＋细胞的影响奠定基础。     

Galectin-1 RNAi载体构建及其稳定转染LST-R1细胞系的建立

目的 构建galectin-1基因特异小分子干扰RNA(siRNAs)真核干扰载体,并获得干扰载体稳定转染的LST-R1细胞系.方法 设计2对galectin-1 mRNA(GenBank:NM002305)特异性siRNAs,两端分别带有BamH I/Hind Ⅲ酶切位点和一个9nt的发夹结构,通过基因克隆技术将其插入真核表达质粒pSUPgR-puro中,构建galectirt-1 siRNA表达载体,以EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切及测序验证重组载体的正确性.将重组载体与pcDNA6/TR共转染LST-R1细胞,以嘌呤霉素(0.8μg/ml)进行阳性克隆筛选.四环素(4μg/ml)诱导48h后,RT-PCR检测galectin-1 mRNA表达水平,Western blotting和细胞免疫化学方法检测galectin-1蛋白质水平的变化.结果 测序表明galectin-1 siRNA真核表达载体p-shRNA1和p-shRNA2干扰序列与读码框相符.p-shNRA1和p-shRNA2与pcDNA6/TR共转染LST-R1细胞,获得稳定的重组质粒转染细胞p-shRNA1-LST和p-shRNA2-LST.RT-PCR显示,galectin-1 mR-NA在LST-R1细胞、p-shRNA1-LST细胞、p-shRNA2-LST细胞以及p-LST细胞中的表达量分别为0.616、0.298、0.373和0.641,以p-shRNA1-LST的干扰效果最好.Western blotting结果显示,在LST-R1、p-shRNA1-LST、p-shRNA2-LST和p-LST细胞中galectin-1的表达量分别为1.00、0.07、0.38和0.97,以p-shRNA1-LST干扰效果最好,与免疫细胞化学的结果一致.结论 成功构建了galectin-1真核干扰载体,RNAi载体转染LST-R1细胞系的建立为进一步研究galectin-1在大肠侧向扩散型肿瘤中的作用奠定了实验基础.     

抑制整合素连接激酶(ILK)表达对大鼠肾小球系膜细胞细胞问隙连接蛋白43表达的影响

目的 研究抑制整合素连接激酶(ILK)表达对大鼠肾小球系膜细胞(RMC)细胞问隙连接蛋白43(Cx43)表达的影响.方法 将大鼠肾小球系膜细胞分为RMC组(n=6)、ILK-con siRNA转染组(n=6)和ILK-siRNA转染组(n=6).合成抑制ILK基因的siRNA,待细胞长至60%融合后,ILK-siRNA转染组和ILK-con sLRNA转染组分别用脂质体转染ILK-siRNA或ILK-con siRNA,RMC组仅加入脂质体,24h后收集细胞,提取总蛋白和总RNA,用RT-PCR和Western blotting观察ILK和Cx43 mRNA和蛋白的表达.转染后继续培养24、48、72h,MTT法检测细胞活力.结果 与RMC组和ILK-con siRNA转染组比较,ILK-siRNA组ILK mR-NA和蛋白的表达均下降30%～50%(P<0.05,P<0.01),Cx43 mRNA水平增加30%～40%(P<0.05),Cx43蛋白水平增加60%～70%(P<0.01).应用ILK-siRNA转染系膜细胞后24、48、72h,细胞活力均显著高于RMC组和ILK-con siRNA转染组(P<0.05,P<0.01).结论 抑制ILK途径可上调肾小球系膜细胞Cx43的表达,增强细胞活力;Cx43的调节可能是部分通过ILK途径实现的.     

Twist过表达在人腹膜间皮细胞转分化中的作用

目的探讨twist在人腹膜间皮细胞(HPMCs)转分化中的作用。方法取HPMCs细胞,分别用50mmol/L右旋葡萄糖(高糖组)和5.6mmol/L右旋葡萄糖(对照组)刺激48h,采用Western blotting检测twist、E-钙黏素(E-cadherin)、成纤维细胞特异性蛋白1(Fsp1)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达情况。另采用质粒pcDNA3.1-twist(pcDNA3.1-twist组)和空载体pcDNA3.1(空载体组)分别转染常规培养的HPMCs,使HPMCs过表达twist后,采用qRT-PCR、Western blotting方法检测twist、E-cadherin、Fsp1和α-SMA mRNA及蛋白的表达情况。再采用质粒twist小干扰RNA(阳性转染组)和空载体pcDNA3.1(空载体组)分别转染50mmol/LD-葡萄糖培养48h后的HPMCs细胞,另选择未转染质粒的细胞作为亲本细胞组,采用Western blotting检测twist下调后,E-cadher-in、Fsp1、α-SMA蛋白水平的表达情况。结果与对照组相比,高糖组twist、Fsp1和α-SMA蛋白表达明显增加,E-cadherin表达减弱(P<0.05)。与空载体组相比,HPMCs过表达twist后,pcDNA3.1-twist组E-cadherin mRNA及蛋白表达减弱,Fsp1和α-SMA mRNA及蛋白表达增强(P<0.05)。用小干扰RNA使twist沉默后,与亲本细胞组及空载体相比,E-cadherin蛋白表达增加,Fsp1和α-SMA蛋白表达减弱(P<0.05)。结论 Twist过表达促进了HPMCs的转分化。     

上调microRNA-150表达对肝癌SMMC7721细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨上调microRNA- 150 (miR- 150)表达对肝癌SMMC7721细胞增殖和凋亡的影响及其可能机制.方法 SMMC7721细胞分成miR-150感染组(加入pGIPZ-miR-150慢病毒表达载体)、阴性对照组(加入只含GFP的慢病毒载体)和空白对照组(不转染).采用荧光定量PCR检测miR-150的表达情况,Western blotting检测靶基因c-Myb蛋白的表达,CCK-8法检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡情况.结果 荧光定量PCR结果显示,转染miR-150pGIPZ后,SMMC7721细胞miR-150表达量(2.48±0.15)较阴性对照组(0.81±0.09)增加了2倍(p＜0.01).CCK-8法检测结果显示,与阴性对照组和空白对照组比较,miR-150组的细胞增殖率显著降低(P＜0.05).Western blotting检测结果表明,miR-150组细胞c-Myb蛋白表达(0.31±0.07)与空白对照组(0.80±0.09)及阴性对照组(0.81±0.08)相比明显减少(P＜0.0l).流式细胞仪检测结果显示,miR-150组细胞凋亡率(19.36％±1.78％)与阴性对照组(5.12％±0.54％)及空白对照组(4.68％±0.35％)相比明显增加(P＜0.01).结论 上调miR-150表达可通过降低靶基因c-Myb的表达,抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,miR-150可能成为肝癌靶向治疗新的靶基因.     

慢病毒载体介导survivin小分子干扰核糖核酸对裸鼠肺癌移植瘤的影响

目的观察慢病毒载体介导的survivin小分子干扰核糖核酸(small interfering RNA,siRNA)能否在裸鼠体内抑制肺癌移植瘤的生长。方法裸鼠随机分为3组,分别将A549细胞、无关序列及survivin siRNA慢病毒载体感染A549细胞接种于裸鼠右侧背部近腋窝皮下,观察survivin siRNA对移植瘤生长的影响。采用逆转录酶聚合酶链反应和Western blotting测定移植瘤组织survivin基因及其蛋白表达。结果成功建立人肺癌裸鼠皮下移植瘤模型。survivin siRNA组移植瘤体积及质量明显低于其他2组(P<0.01),抑瘤率为63.6%(基于体积)或58.8%(基于质量),survivin mRNA和蛋白表达分别减少53.7%、57.6%。结论慢病毒载体介导survivin siRNA可明显下调裸鼠体内survivin基因表达,抑制肺癌移植瘤的生长。     

小鼠Islet-1基因RNAi慢病毒载体的构建

目的构建高效沉默小鼠Islet-1基因的慢病毒载体。方法针对小鼠Islet-1基因设计3个RNAi靶序列,合成相应的短发卡RNA(shRNA)寡核苷酸序列(oligo):Sh1、Sh2、Sh3,分别插入经酶切后的PLVTHM载体。经PCR和测序方法筛选阳性克隆,抽提阳性克隆质粒经大肠埃希菌扩增后,与其辅助包装质粒共同感染293T细胞制备慢病毒载体,利用斑形成试验测定病毒滴度。感染C3H10T1/2细胞株,以流式细胞仪检测其感染效率、荧光定量PCR检测其干扰效率。结果与正常C3H10T1/2细胞比较,测序及PCR结果显示目的片段插入正确;病毒滴度值为3.87×108TU/ml;慢病毒载体对C3H10T1/2细胞感染效率达90.36%;3个靶点(抑制效率分别为76.8%5、5.1%和11.7%)均有干扰效果,与正常细胞比较,Sh1靶点干扰效果最为显著(76.8%,P<0.05)。结论成功构建高效沉默Islet-1基因慢病毒载体。