自体卵巢组织冷冻在女性肿瘤患者生育力保存中的应用

目的探讨适合育龄期女性肿瘤患者的生育力保存方案。方法回顾性分析2017年12月至2019年9月在安徽医科大学第一附属医院生殖中心生育力保存库进行生育力保存的14例肿瘤患者的临床治疗资料,并结合相关文献,探讨合适的生育力保存方案。结果 14例女性肿瘤患者中,已婚和未婚女性各7例,平均年龄(27.35±1.52)岁,包括8例乳腺癌患者、4例卵巢交界性肿瘤患者,以及结肠癌、子宫内膜癌患者各1例。14例患者均未进行促排卵治疗,仅经腹腔镜手术取部分卵巢皮质组织进行冷冻保存。7例患者体外获取的未成熟卵母细胞经体外成熟(IVM)技术于体外培养得到成熟卵母细胞,平均成熟率为54.05%(40/74);其中2例患者(未婚)进行了卵母细胞冻存,5例患者(已婚)进行了胚胎冻存,平均冻胚(3.2±1.92)枚。结论卵巢组织、卵母细胞及胚胎冷冻技术均可用于育龄期女性肿瘤患者的生育力保存。     

兔卵巢组织慢速冷冻和玻璃化冷冻保存方法的研究

目的比较不同冷冻方法对兔卵巢组织的保存效果。方法15只新西兰雌兔,取卵巢皮质切块后,随机分成5组：新鲜组（A组）、二甲亚砜慢速冷冻组（B组）、丙二醇慢速冷冻组（C组）、冷冻管玻璃化冷冻组（D组）及固相表面玻璃化冷冻组（E组）。比较各组卵巢组织的原始和初级卵泡形态正常率;通过体外培养测定培养液中雌二醇（E2）水平;比较冻融后卵巢组织的内分泌功能;通过TdT介导的dUTP缺口末端标记技术,检测细胞凋亡情况。结果原始卵泡正常形态率与A组相比,B、D组显著降低（P〈0.05）,C、E组无显著性差异;初级卵泡正常形态率5组间无显著性差异。培养14d后,各实验组原始卵泡形态正常率均低于A组（P〈0.001）,各实验组间无显著性差异;组间初级卵泡形态正常率无明显差异。体外培养过程中,培养液E水平不断增加（P〈0.001）,慢速冷冻和玻璃化冷冻的E2平均浓度有显著性差异（P〈0．05）。细胞凋亡检测显示,无论是原始卵泡还是初级卵泡,与A组相比,各实验组的卵泡凋亡率均无显著性差异。结论本实验中,慢速冷冻和固相表面玻璃化冷冻均能很好地保存兔卵巢组织,经过体外培养,能保持一定的内分泌功能。     

卵母细胞和卵巢组织的冷冻

精子冻存已取得了一定的成功 ,但是冻存的卵母细胞体外发育的成功率很低 ,因为卵母细胞冻存与许多因素有关 ,成熟的卵母细胞对冻存非常敏感 ,很容易出现非整倍体现象。为了提高卵母细胞的受精率 ,人们已着手研究不成熟卵母细胞及卵巢的冻存。要建立一个方法 ,使生长完全的生殖泡 ( germinal vesicle,GV)和MII卵母细胞暴露于与冻存有关的物理和化学逆境后 ,仍然具有很高的存活率、受精率和发育率。目前还没有一个简单可行的冻存方法 ,而且主要困难在于如何使原始卵泡中的未成熟卵母细胞发育为成熟的卵母细胞。成熟卵母细胞的冻存　　当细胞…     

小鼠卵巢组织在不同冷冻方案中形态学比较

目的　比较小鼠卵巢组织在不同降温过程中组织形态学变化。　方法　取21 d 10只 ICR小鼠双侧卵巢,随机均分为对照、快速、中速和慢速4组进行冷冻保存。5 d后解冻复苏,光镜下观察组织切片,比较各组不同发育阶段卵泡的比例以及卵泡、卵子和颗粒细胞形态、分布情况。　结果　4组不同发育阶段卵泡构成比无明显差异,初级卵泡占5.3%、次级卵泡占7.6%、窦前卵泡占85.7%及偶见少量窦卵泡,均未见典型的原始卵泡。4 组皱缩卵子的比例分别为 3. 9%、42. 6%、41.6%和34.9%;卵子保持圆形但胞浆内空泡体积>10%的分别占16.2%、57.2%、59.6%和19.5%;形态基本正常的卵子分别为80.6%、24.3%、23.6%和52.4%,在所有冷冻组中慢速组最高,但明显低于对照组。　结论　慢速冷冻结合植冰是小鼠卵巢组织冷冻保存比较有效的方案,但是冷冻方案尚需进一步完善。     

女性儿童和青少年肿瘤患者生育力保存研究进展

近年来随着儿童和青少年肿瘤远期生存率的不断提高,这些肿瘤患者的生育力保存受到越来越多人关注。化疗和放疗可能会损害儿童和青少年肿瘤患者的生育力,使其在成年后发生卵巢早衰和不孕的风险增大,严重影响了成年幸存者的生活质量。卵子冷冻是青春期后患者保存生育力的标准方案,卵巢组织冷冻是青春期前儿童保存生育力的主要方法。对于移植卵巢组织有肿瘤细胞种植风险的患者,卵泡体外培养和人工卵巢可能是未来生育力保存发展的方向。本文综述女性儿童和青少年肿瘤患者生育力保存的现状和研究进展,为临床工作和进一步研究提供参考。     

生育力保存中国专家共识

生育力保存在我国处于起步阶段,缺乏相应的规范及共识指导专科医生及基层医生开展相应的诊疗活动.生殖科、妇产科、男科及肿瘤专科的32位临床专家,参考新近的国际指南及文献,共同编写了中国生育力保存专家共识.对生育力保存的指征、方法以及临床诊疗策略提出了专家建议,以此来规范和发展我国生育力保存临床诊疗工作.     

冷冻卵巢组织移植研究进展

卵巢是人体重要的内分泌以及生育器官。妇科恶性肿瘤发病率近年来呈逐渐年轻化趋势,保留生育功能的年轻患者越来越多,进而有生育以及内分泌需求的患者逐年上升。卵巢移植不仅可以解决患者的生育问题,还可以改善其最重要的内分泌功能。本文对冷冻卵巢组织移植的研究进展,包括卵巢组织移植的类型、移植部位的选择、如何改善移植成功率、移植后的免疫抑制剂的应用等方面进行综述。     

不同方法冻融山羊卵巢组织的研究

目的探讨山羊卵巢组织不同玻璃化冷冻方法对其卵母细胞体外成熟、体外受精及胚胎发育的影响。方法采用三种不同的冷冻保护液(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)保存的卵巢组织吸入0.25ml麦管中直接投入液氮中冷冻保存。采用慢速解冻法解冻后对卵巢组织进行形态学观察;收集卵母细胞进行体外培养。结果三种不同冷冻方法冷冻卵巢组织解冻后收集的卵母细胞存活率分别为55.2%、48.9%和46.7%,组间比较无显著性差异(P>0.05);成熟率分别为58.5%(I组)、28.9%(II组)、33.3%(III组),I组显著高于Ⅱ、Ⅲ组(P<0.01);三组的受精率、卵裂率、8细胞胚胎的形成率均无显著性差异(P>0.05);卵巢组织解冻后形态学分析表明,I组效果好于Ⅱ、Ⅲ组。结论采用玻璃化方法冷冻卵巢组织,在冷冻保护液中加入卵黄可提高冷冻保护效果。     

小鼠卵巢组织冷冻保存方法对组织内分泌功能的影响

目的比较不同的冷冻方法对小鼠卵巢组织的保存效果及对组织内分泌功能的影响。方法 25只6周龄ICR雌鼠,取卵巢皮质切块后,根据不同冷冻方法随机分成5组:新鲜对照组、二甲亚砜慢速冷冻组(A组)、丙二醇慢速冷冻组(B组)、冷冻管玻璃化冷冻5min组(C组)及冷冻管玻璃化冷冻8min组(D组)。分别进行卵巢组织冷冻复苏,复苏后体外培养2周以及复苏后同种移植饲养2周实验。比较各组体外培养液中以及复苏移植后小鼠静脉血中雌二醇(E2)水平。结果体外培养过程中,各组培养液中E2水平均随培养时间不断增加(F=14.146,P0.001);同一天的E2水平比较,A、B组显著高于对照组及C、D组(P0.05),C、D组与对照组无统计学差异(P0.05)。移植饲养2周后,DMSO慢速冷冻复苏移植组、PROH慢速冷冻复苏移植组的平均E2水平显著高于两组玻璃化复苏移植组、新鲜组织移植对照组、未处理自然对照组及去势未移植对照组(P0.05),新鲜移植对照组、两组玻璃化复苏移植组及去势未移植对照组的平均E2水平显著低于未处理的自然对照组(P0.05)。结论慢速冷冻及玻璃化冷冻的小鼠卵巢组织复苏后,经过体外培养及同种移植均能保持一定的内分泌功能;慢速冷冻效果可能优于冷冻管玻璃化冷冻。     

促进自体冻存卵巢组织移植存活的方法研究进展

随着癌症治疗技术的发展,癌症患者的生存率显著提高。但化学药物治疗（化疗）和放射治疗（放疗）可能导致年轻女性癌症患者发生卵巢早衰和不孕,而自体冻存卵巢组织移植是这类患者保存生育能力的有效方法。目前,该技术最大的挑战是移植后卵泡大量丢失。本文综述了自体冻存卵巢组织移植存活的影响因素及改善方法。     

人类卵巢组织冷冻与移植研究进展

不断改进的化学疗法、放射疗法和骨髓移植疗法,使恶性肿瘤的治愈率和年轻患者的长期存活率明显提高。但是,这些疗法往往导致女性患者卵巢功能衰竭,损害患者的生殖能力。在肿瘤治疗前,将患者卵巢组织冷冻保存,是一项旨在保存女性生育力的新技术。本文就国外近年有关人类卵巢组织冷冻、移植的研究进展作一综述。     

人类卵巢组织条厚度对超低温冷冻效果影响的研究

目的 探索不同卵巢组织条厚度对超低温冷冻效果的影响,同时评估卵巢组织的凋亡情况.方法 卵巢组织取自10例手术的妇女.冷冻前行卵巢组织切片,按最小厚度随机分成1.0、0.5、0.25 mm 3组.采用二甲基亚砜（DMSO）为冷冻保护剂的程序慢速冷冻法进行超低温冷冻保存.冻融后进行卵泡计数及各组间正常卵泡形态学分析比较,使用TdT介导的dUTP缺口末端标记技术（TUNEL）进行组织细胞凋亡检测.上述结果与新鲜卵巢组织进行比较.结果新鲜卵巢组中97.6%原始卵泡保持形态学正常,切片厚度为1.0、0.5、0.25 mm三组形态正常率分别为71.1%、73.9%和72.7%,与新鲜组比较,三实验组下降明显,差别有统计学意义（χ2=15.66,P〈0.001）;而三冷冻组间相比差别无统计学意义（χ2=0.153,P=0.926）.TUNEL原位杂交显示窦前卵泡颗粒细胞中未见凋亡阳性信号,窦卵泡中可见散在阳性信号细胞,卵巢间质细胞亦有散在凋亡信号.结论 0.5～1.0 mm厚度卵巢组织为行超低温冷冻保存是较合理厚度,卵泡闭锁的机理值得进一步研究.     

冻融人胎儿卵巢组织异种移植的实验研究

目的探求冻融人胎儿卵巢组织异种移植后的生长发育能力。方法胎儿卵巢组织分为新鲜胎儿卵巢组织(新鲜组),慢冻-快融胎儿卵巢组织(冻融组),解冻的胎儿卵巢组织异种移植到8只裸鼠肾被膜下(移植组)三组。2个月后开始隔天注射孕马血清促性腺激素(PMSG),持续5个月。注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)36 h后裸鼠处死取得移植物。胎儿卵巢组织石蜡包埋后连续切片,进行组织学评价和增殖细胞核抗原(PCNA)的检测。结果冻融组和新鲜组中绝大多数是原始卵泡。与新鲜组相比,冻融组中正常及总的原始卵泡数虽有下降,异常原始卵泡数虽有升高,但均无显著性差异。移植组的原始卵泡数明显少于新鲜组和冻融组(7.2±1.64,20.4±5.68,17.2±4.27,P<0.05),但可见到数个形态正常的初级卵泡、次级卵泡和窦卵泡。三组的原始卵泡均未见有PCNA阳性表达,PCNA阳性表达见于移植组初级卵泡的颗粒细胞和卵母细胞、次级卵泡和窦卵泡的颗粒细胞。结论冻融人胎儿卵巢组织异种移植后能存活,卵泡能正常发育到窦卵泡。     

Modified cryopreservation and xenotransplantation of human parathyroid tissue

Introduction: A modified cryopreservation technique for human parathyroid tissue was compared with the standard method using a programmed freezer. Methods: Total parathyroidectomy was performed in three groups of 6-week-old Rowett nude rats. Group I (control) underwent no transplantation of parathyroid tissue (n=9). After 10 days, the rats of groups II (n=15) and III (n=15) underwent xenotransplantation of 20 mg cryopreserved human parathyroid tissue, which had been stored in liquid nitrogen at –196°C for 1–22 months prior to xenotransplantation. The parathyroid tissue was derived from 15 parathyroidectomized patients with renal hyperparathyroidism. Two tissue samples were obtained from every patient. One sample from every patient was cryopreserved by means of the technique of programmed cryopreservation: programmed freezing of human parathyroid tissue at a controlled rate of –1°C/min to –80°C prior to transfer to liquid nitrogen (group II). The second sample from every patient was cryopreserved by means of a modified cryopreservation technique: immediate placement of human parathyroid tissue in a freezer at –20°C and transfer to liquid nitrogen after 2 h (group III). Calcium and intact parathyroid hormone concentrations in serum were determined over a period of 60 days. Furthermore, individual differences in the calcium concentrations were assessed for each rat on the basis of the calcium levels recorded preoperatively and at day 60. Results: All animals in the control group developed hypocalcemia. Serum calcium concentrations returned to normal levels 60 days after xenotransplantation of parathyroid tissue, which had been cryopreserved using the modified technique (group III) in 12 of 15 rats (80%). At day 60, serum calcium had normalized in 10 of 15 rats (67%) after xenotransplantation of parathyroid tissue cryopreserved using programmed freezing (group II). After modified cryopreservation (group III), the median individual difference in the calcium concentrations was –0.16 mmol/l after programmed freezing (group II). At the end of the study, a median level of human intact parathyroid hormone of 3.5 pg/ml and 2.4 pg/ml was estimated for groups II and III, respectively. There was no statistical significant difference of the individual differences in the calcium concentrations or of the levels of human intact parathyroid hormone between groups II and III. Conclusion: Human parathyroid tissue was successfully xenografted in the present experimental study. The results obtained after cryopreservation using the described modified technique were equivalent to those recorded after controlled freezing in a programmed freezer. The simplified cryopreservation technique therefore appears to be suitable for human parathyroid tissue. Received: 8 July 1998 Accepted: 11 February 1999     

冻融和移植过程对人胎儿卵巢组织及超微结构的影响

目的探讨冻融和移植过程对人胎儿卵巢组织超微结构的影响。方法6例23~34w引产的胎儿卵巢慢冻速融,并移植到裸鼠肾被膜下,分别于移植后48 h、7和28 d回收移植物。卵巢组织分为新鲜对照组、冻融组、移植后48 h、7 d及28 d组。电镜和光镜下观察各组形态学改变。结果胎儿卵巢组织冻融前后光镜下的卵泡密度(23.92±3.94)及(22.70±4.18)无显著差异,移植后48 h卵泡密度(16.70±3.98)与移植前比较显著下降(P<0.01)。各组卵泡超微结构整体上保存良好。冷冻对卵巢间质损伤较大且局部差异大,移植后48 h间质细胞稀疏,白细胞浸润;移植后7及28 d,间质内可见较多胶原纤维束,大量微小血管生长。结论人胎儿卵巢组织的冻融损伤主要表现在间质,而移植损伤在移植后48 h内最严重;结合光镜和电镜观察手段能更全面评价冻融过程和移植过程对胎儿卵巢组织的影响。     

Laparoscopic unilateral oophorectomy for ovarian tissue cryopreservation in children

Background/Purpose

Many survivors of childhood cancer will experience premature gonadal insufficiency or infertility as a consequence of their medical treatments. Ovarian tissue cryopreservation (OTC) remains an experimental means of fertility preservation with few reports focused on the surgical technique and postoperative outcomes for OTC in children.

不同玻璃液冻存卵巢组织移植于鸡胚前后的氧化应激和细胞凋亡研究

目的研究不同玻璃液(VS)保护下冻存的卵巢组织移植于鸡胚前后的氧化应激和细胞凋亡情况,以评估不同玻璃液的冷冻保护效果。方法将卵巢组织分割成1~2mm×1mm×1mm的小块分别放入VS1、VS2、VS3、VS4 4种不同的玻璃液中,经过4种玻璃液平衡后冻存并复苏的卵巢组织称为冻存卵巢组织(FOT),分别将经4种玻璃液冻存的FOT移植到胚龄10d的鸡卵绒毛尿囊膜(CAM)上培养,于鸡卵胚龄16d取出移植于CAM的卵巢组织(TOT),以未经玻璃液平衡的新鲜卵巢组织为对照(COT),分析4种玻璃液保存的FOT、TOT、COT中线粒体活性、细胞内活性氧自由基(ROS)水平和间质细胞凋亡情况。结果线粒体活性:经过VS1、VS3和VS4冻存的FOT和TOT中的线粒体活性低于COT,差异有统计学意义(P0.05);经VS2冻存的TOT与COT中线粒体活性无显著性差异(P0.05)。细胞内ROS水平:经过VS1、VS3和VS4冻存的FOT和TOT细胞内ROS水平低于COT,有统计学差异(P0.05);经VS2冻存的FOT细胞内ROS水平与COT组比较无显著性差异(P0.05)。间质细胞凋亡情况:经过VS1、VS2、VS3和VS4平衡的FOT间质细胞凋亡率和COT组之间的差异无统计学意义(P0.05)。结论由玻璃液VS2保护冻存卵巢组织的冷冻损伤小、移植后缺血损伤轻,是本研究优化的卵巢冷冻保护玻璃液;玻璃化冷冻对间质细胞损伤小,适于人卵巢组织的冷冻保存。