兔卵巢组织慢速冷冻和玻璃化冷冻保存方法的研究

目的比较不同冷冻方法对兔卵巢组织的保存效果。方法15只新西兰雌兔,取卵巢皮质切块后,随机分成5组：新鲜组（A组）、二甲亚砜慢速冷冻组（B组）、丙二醇慢速冷冻组（C组）、冷冻管玻璃化冷冻组（D组）及固相表面玻璃化冷冻组（E组）。比较各组卵巢组织的原始和初级卵泡形态正常率;通过体外培养测定培养液中雌二醇（E2）水平;比较冻融后卵巢组织的内分泌功能;通过TdT介导的dUTP缺口末端标记技术,检测细胞凋亡情况。结果原始卵泡正常形态率与A组相比,B、D组显著降低（P〈0.05）,C、E组无显著性差异;初级卵泡正常形态率5组间无显著性差异。培养14d后,各实验组原始卵泡形态正常率均低于A组（P〈0.001）,各实验组间无显著性差异;组间初级卵泡形态正常率无明显差异。体外培养过程中,培养液E水平不断增加（P〈0.001）,慢速冷冻和玻璃化冷冻的E2平均浓度有显著性差异（P〈0．05）。细胞凋亡检测显示,无论是原始卵泡还是初级卵泡,与A组相比,各实验组的卵泡凋亡率均无显著性差异。结论本实验中,慢速冷冻和固相表面玻璃化冷冻均能很好地保存兔卵巢组织,经过体外培养,能保持一定的内分泌功能。     

以细胞筛为载体的玻璃化冷冻和慢速程序化冷冻保存人卵巢组织的效果比较

目的比较以细胞筛为载体的玻璃化冷冻与慢速程序化冷冻用于人卵巢组织冷冻的效果。方法人卵巢组织取皮质切块后,随机分为3组:新鲜组织对照组(F组)、慢速程序化冷冻组(S组)及以细胞筛为载体玻璃化冷冻组(V组)。卵巢组织冷冻复苏后,固定切片后行苏木素-伊红染色,观察卵泡形态;使用TdT介导的dUTP缺口末端标记技术,观察卵泡凋亡情况;部分卵巢组织体外培养,隔日采集培养液后检测雌二醇(E2)浓度。比较三组卵泡正常形态率、卵泡凋亡率及E2浓度。结果与F组原始卵泡正常形态率(91.1%)相比,V组原始卵泡正常形态率(88.1%)无显著差异(P0.05),而S组原始卵泡正常形态率(79.6%)显著下降(P0.001);V组初级卵泡正常形态率(74.2%)与S组(73.6%)相似,但两组均低于F组(89.0%)(P0.05);凋亡检测中,3组凋亡率无显著差异(P0.05);体外培养2周,各组E2浓度持续上升,F组E2浓度显著高于S组、V组(P0.001),而S组与V组E2浓度无显著差异(P0.05)。结论以细胞筛为载体的玻璃化冷冻能较好地保存人卵巢组织,复苏后组织体外培养后,还可持续分泌E2。     

人类卵巢组织条厚度对超低温冷冻效果影响的研究

目的 探索不同卵巢组织条厚度对超低温冷冻效果的影响,同时评估卵巢组织的凋亡情况.方法 卵巢组织取自10例手术的妇女.冷冻前行卵巢组织切片,按最小厚度随机分成1.0、0.5、0.25 mm 3组.采用二甲基亚砜（DMSO）为冷冻保护剂的程序慢速冷冻法进行超低温冷冻保存.冻融后进行卵泡计数及各组间正常卵泡形态学分析比较,使用TdT介导的dUTP缺口末端标记技术（TUNEL）进行组织细胞凋亡检测.上述结果与新鲜卵巢组织进行比较.结果新鲜卵巢组中97.6%原始卵泡保持形态学正常,切片厚度为1.0、0.5、0.25 mm三组形态正常率分别为71.1%、73.9%和72.7%,与新鲜组比较,三实验组下降明显,差别有统计学意义（χ2=15.66,P〈0.001）;而三冷冻组间相比差别无统计学意义（χ2=0.153,P=0.926）.TUNEL原位杂交显示窦前卵泡颗粒细胞中未见凋亡阳性信号,窦卵泡中可见散在阳性信号细胞,卵巢间质细胞亦有散在凋亡信号.结论 0.5～1.0 mm厚度卵巢组织为行超低温冷冻保存是较合理厚度,卵泡闭锁的机理值得进一步研究.     

家兔卵巢组织玻璃化冷冻保存的实验研究

目的采用直接覆盖玻璃化冷冻(DCV法)和半麦管法玻璃化冷冻(HS法)处理家兔卵巢组织,探讨两种冷冻方法对卵泡组织形态学及超微结构的影响。方法将10只健康雌性新西兰家兔的卵巢组织块随机分配组成新鲜对照组、DCV法和HS法玻璃化冷冻组3个实验组,观察和比较各组间卵巢内卵泡的组织形态学和超微结构变化。结果 (1)与对照组卵巢组织中的原始卵泡及初级卵泡的形态正常率(分别为88.11%和72.86%)相比,冷冻复苏后的原始卵泡及初级卵泡形态正常率在DCV法(分别为72.66%和55.08%)和HS法(分别为71.73%和56.18%)均显著降低(P0.05),且初级卵泡的形态正常率均显著低于原始卵泡(P0.05),但两个冷冻组间无显著差异(P0.05);(2)观察卵泡超微结构的改变:两种玻璃化冷冻法主要损伤的是细胞浆中的线粒体,细胞核也会出现核固缩现象。结论 DCV法和HS法玻璃化冷冻均能保存家兔卵巢组织内的卵泡,但冷冻所导致的原始卵泡和初级卵泡损伤仍不可避免,其中初级卵泡损伤更明显。这两种冷冻法处理后的卵泡组织形态学无显著性变化,但在一定程度上会损伤卵泡中各组成部分的细胞超微结构。     

小鼠卵巢组织冷冻保存方法对组织内分泌功能的影响

目的比较不同的冷冻方法对小鼠卵巢组织的保存效果及对组织内分泌功能的影响。方法 25只6周龄ICR雌鼠,取卵巢皮质切块后,根据不同冷冻方法随机分成5组:新鲜对照组、二甲亚砜慢速冷冻组(A组)、丙二醇慢速冷冻组(B组)、冷冻管玻璃化冷冻5min组(C组)及冷冻管玻璃化冷冻8min组(D组)。分别进行卵巢组织冷冻复苏,复苏后体外培养2周以及复苏后同种移植饲养2周实验。比较各组体外培养液中以及复苏移植后小鼠静脉血中雌二醇(E2)水平。结果体外培养过程中,各组培养液中E2水平均随培养时间不断增加(F=14.146,P0.001);同一天的E2水平比较,A、B组显著高于对照组及C、D组(P0.05),C、D组与对照组无统计学差异(P0.05)。移植饲养2周后,DMSO慢速冷冻复苏移植组、PROH慢速冷冻复苏移植组的平均E2水平显著高于两组玻璃化复苏移植组、新鲜组织移植对照组、未处理自然对照组及去势未移植对照组(P0.05),新鲜移植对照组、两组玻璃化复苏移植组及去势未移植对照组的平均E2水平显著低于未处理的自然对照组(P0.05)。结论慢速冷冻及玻璃化冷冻的小鼠卵巢组织复苏后,经过体外培养及同种移植均能保持一定的内分泌功能;慢速冷冻效果可能优于冷冻管玻璃化冷冻。     

人卵巢组织玻璃化冻存方案优选的实验研究

目的评价4种玻璃化冷冻保存液对人卵巢组织的冻存效果,以筛选出较优的玻璃化冷冻保存液配方。方法收集2018年3月至2019年12月期间在北京大学深圳医院妇科因疾病手术治疗的4例患者的卵巢组织,将人卵巢分割为(5~10)mm×10 mm×1 mm大小的组织块进行玻璃化冷冻保存,根据玻璃化冷冻保存液组成成分不同将组织块随机分为4组[A组为20%乙二醇(EG)+20%二甲基亚砜(DMSO)+0.5 mol/L蔗糖+20%人工合成血清替代品(SSS)+M199培养基;B组为38%EG+0.5 mol/L海藻糖+6%SSS+M199培养基;C组为15%EG+15%DMSO+0.5 mol/L蔗糖+20%SSS+M199培养基;D组为商品化Cryotissue Kit VT301/VT302成品]以及对照组(未经冻融处理的新鲜卵巢组织)。采用液氮液滴法在显微镜下观察4种保存液在快速降温和复融时的玻璃化状态;HE染色比较冻存后各组卵巢组织形态学改变;采用免疫组化法检测各组中凋亡标志物细胞色素C(Cytochome C)与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的表达情况。结果液滴法检测发现,在液氮中快速降温时A、B和D组冻存液均能保持完全玻璃化状态,C组冻存液呈部分结晶;在复融过程中,A、B和C组冻存液均出现结晶,D组冻存液则绝大部分保持透明的玻璃化状态。HE染色结果发现,A、B、C和D组人卵巢组织中的正常卵泡率与对照组比较均无显著性差异(P>0.05);免疫组化结果显示,D组和对照组卵泡中Cytochome C显著低于C组(P<0.05),C组卵泡Caspase-3阳性率显著高于其他组(P<0.05)。结论通过液氮液滴法观察冻存液在快速降温和复融时的玻璃化状态方便直观,可用于对人卵巢组织玻璃化冷冻液的初步筛选;商品化Cryotissue Kit VT301/VT302冻存液冻融后人卵巢组织细胞凋亡较少,为较优的冻存液配方。     

来曲唑联合人绝经期促性腺激素对多囊卵巢综合征患者促排卵的临床研究

目的比较来曲唑（LE）联合人绝经期促性腺激素（HMG）与单独LE或HMG对多囊卵巢综合征（PCOS）患者的促排卵效果。方法拟行促排卵治疗的111例PCOS患者随机分为三组,A组为LE组（40例、49周期）、B组为LE＋HMG组（42例、56周期）、C组为HMG组（29例、40周期）。患者在月经周期第3～5天开始,A组口服LE2．5mg／d×5d;B组口服LE2．5mg／d×5d后继续予肌注HMG75U／d;C组肌注HMG,起始剂量为75U／d。比较三组的卵泡发育情况、子宫内膜厚度、绒毛膜促性腺激素（hCG）日血雌二醇（E2）值和临床妊娠率。结果三组临床特征具有可比性。卵泡成熟时间、直径≥17mm卯泡数、hCG日子宫内膜厚度,A组与B、C两组比较均有显著性差异（P〈0．05）。直径≥14mm卵泡数、hCG日E2水平三组间比较均有显著性差异（P〈O．05）。A组无反应取消率明显高于B组（P〈O．05）。为防止发生卵巢过度刺激综合征（0HsS）放弃注射hCG者C组发生率明显高于A、B两组（P〈0．05）。但三组临床妊娠率无显著性差异（P〉0．05）。结论对于PCOS患者,LE＋HMG是有效的促排卵方案,且可避免常规促排卵治疗中的子宫内膜变薄。     

玻璃化法保存异体肌腱移植的组织学研究

[目的]对玻璃化法与程序冷冻法保存异体肌腱移植后的组织学演变及特性进行观察、分析,以了解其临床应用的可行性及影响因素.[方法]家兔36只,平均分为A组为新鲜自体肌腱移植组,B组为玻璃化法保存异体肌腱移植组,C组为程序冷冻法保存异体肌腱移植组,对术前、术后3、8、12周异体肌腱的形态学、组织学演变进行观察.[结果]玻璃化法保存肌腱完整率高于程序冷冻法,差异有显著性.A、B组移植后较C组粘连轻,光泽好.新生血管、腱细胞成熟早,愈合进程快.[结论]玻璃化法较好地保存了肌腱的细胞外结构,玻璃化法保存异体肌腱移植具有接近正常肌腱的组织学特性,其效果优于程序冷冻法.     

玻璃化冷冻囊胚复苏移植与新鲜胚胎移植的围产期状况比较

目的比较体外受精-胚胎移植（IVF-ET）治疗中玻璃化冷冻囊胚复苏移植与新鲜胚胎移植的围产期状况。方法回顾性分析2005年5月至2007年11月经我院生殖中心实施玻璃化冷冻囊胚复苏移植术后妊娠分娩132例（A组）的围产结局,以同期IVF-ET新鲜卵裂球期胚胎移植250例（B组）的围产期状况作为对照。比较两组的早产率、双胎出生率、剖宫产率、新生儿男女性别比;另外对两组单、双胎妊娠的新生儿胎龄、出生体重、身长、新生儿窒息、新生儿出生缺陷及新生儿死亡的发生率等进行比较。结果A组132例共分娩163个新生儿,男女性别比为1．26：1;B组250例分娩332个新生儿,男女性别比为0．91：1;两组比较无统计学差异（P〉O．05）。单胎新生儿分析：A组单胎新生儿共有101个,平均胎龄为（277．4±15．1）d,平均体重和身长分别为（3,377．1±580．0）g和（49．9±2．6）cm;B组单胎新生儿共有165个。平均胎龄为（273．4±17．7）d,平均体重和身长分别为（3,257．9±542．6）g和（49．3±2．8）cm;两组比较无统计学差异（P〉0．05）。巨大儿出生率A组（15．8%）显著高于B组（7.3％）（P〈0．05）;两组低体重出生率、极低体重出生率、新生儿窒息率、新生儿出生缺陷和新生儿死亡率比较无统计学差异（P〉O．05）。双胎新生儿分析：A组和B组中双胎分别有62个和168个新生儿,两组的新生儿平均胎龄、平均体重和身长,分别为（266．7±15．1）d和（258．9±17．8）d;（2.643．6±642．6）g和（2.468．6±501．7）g;（47．7±2．7）cm和（46．8±3．1）cm;低体重出生率分别为21％和37．1％,两组比较均有统计学差异（P〈0．05）。两组双胎新生儿的极低体重、巨大儿、新生儿窒息、新生儿出生缺陷及死亡率之间无统计学差异（P〉0．05）。结论玻璃化冷冻囊胚复苏移植后妊娠分     

玻璃化法保存异体动脉的实验研究

目的　探讨玻璃化法保存动脉的可行性和异体移植的有效性。　方法　家兔6 0只。其中2 4只切取双侧股动脉共计4 8条,平分为2组,分别采用玻璃化法和低温冷冻法保存14 d,作为移植材料。其余36只作为移植对象,平分为3组,每组12只2 4条动脉。A组行新鲜家兔动脉自体移植,B组行玻璃化保存家兔动脉异体移植,C组行低温冷冻保存家兔动脉异体移植。移植前对动脉进行大体和组织学观察。术后行动脉造影了解移植后动脉的通畅率,并分别于术后14、30、6 0和12 0 d取材,对动脉进行大体和组织学观察,测定内膜/中膜比值,并进行组间比较。　结果　移植前B组的动脉完整率为91.6 7% ,优于C组的5 4 .17% ,二者差异有统计学意义(P<0 .0 1)。移植后B组的累计通畅率达到87.5 0 % ,与A组差异无统计学意义,但优于C组的6 6 .6 7% ,二者差异有统计学意义(P<0 .0 5 )。B组的内膜/中膜比值与A、C组比较,差异有统计学意义(P<0 .0 5 )。　结论　玻璃化法保存动脉在降温和复温过程中冰晶较少,对动脉整体结构和活性影响较小,能较好地保存动脉的组织结构;玻璃化法保存的动脉异体移植的效果优于低温冷冻法保存的动脉异体移植。     

能量限制下SIRT1高表达对大鼠卵巢生殖寿命的影响

目的观察能量限制后成年大鼠卵巢SIRT1高表达对卵巢功能和寿命的影响。方法 24只10周龄雌性SD大鼠,随机分为35%能量限制组和对照组。对照组不给予特殊处理自由取食,能量限制组予对照组食量的65%,每日调整饲料量,每周称体重。HE染色卵巢组织形态学观察及卵泡分类计数,免疫组织化学法观察SIRT1蛋白定位,Western blot检测SIRT1蛋白表达。结果能量限制组大鼠摄入能量少,体重的增长速度要低于对照组(P0.05),腹部脂肪明显少于对照组(P0.01);卵巢外观形态与对照组无异,原始卵泡数明显多于对照组(P0.01),窦状卵泡少于对照组(P0.01);SIRT1蛋白表达定位于卵母细胞的胞核,弱表达于胞浆,免疫印迹检测显示能量限制诱导大鼠卵巢组织SIRT1高表达,灰度值扫描与对照组有显著性差异(P0.05)。结论内源性SIRT1高表达可能是抑制原始卵泡的转化和发育,能量限制诱导SIRT1高表达可能对于延长卵巢的生殖寿命及提高卵巢的储备有积极作用。     

移植冻融小鼠卵巢组织后显微及超微结构的变化

目的探讨移植过程对冻融小鼠卵巢组织光镜结构及超微结构的改变情况,研究其对小鼠卵巢组织的影响。方法采用4周龄小鼠全卵巢慢冻速融,并移植到同种异体小鼠肾脏被膜下,分别于移植后24h、48h、7d回收移植物。卵巢组织分为新鲜组、冻融组、移植后24h、48h及7d组。光镜和电镜下观察各组形态学的改变。结果光镜下各组小鼠卵巢各级卵泡数具有显著性差异（P〈0．01）,随着移植后时间的推移各级卵泡数和卵泡存活率逐渐下降;各组卵泡超微结构具有差异性,移植对小鼠卵巢卵泡和间质都有损伤,移植后48h间质稀疏,大量红细胞渗出,组织损伤最严重;移植后7d可见有微血管生成,卵泡、细胞器及细胞骨架系统修复良好。结论冻融小鼠卵巢随着移植后时间的推移各级卵泡数和卵泡存活率逐渐下降,组织损伤主要在卵泡和问质,以移植后48h损伤最严重;光镜结合电镜观察能更全面地评价移植过程对冻融小鼠卵巢组织的影响。     

冻融人胎儿卵巢组织异种移植的实验研究

目的探求冻融人胎儿卵巢组织异种移植后的生长发育能力。方法胎儿卵巢组织分为新鲜胎儿卵巢组织(新鲜组),慢冻-快融胎儿卵巢组织(冻融组),解冻的胎儿卵巢组织异种移植到8只裸鼠肾被膜下(移植组)三组。2个月后开始隔天注射孕马血清促性腺激素(PMSG),持续5个月。注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)36 h后裸鼠处死取得移植物。胎儿卵巢组织石蜡包埋后连续切片,进行组织学评价和增殖细胞核抗原(PCNA)的检测。结果冻融组和新鲜组中绝大多数是原始卵泡。与新鲜组相比,冻融组中正常及总的原始卵泡数虽有下降,异常原始卵泡数虽有升高,但均无显著性差异。移植组的原始卵泡数明显少于新鲜组和冻融组(7.2±1.64,20.4±5.68,17.2±4.27,P<0.05),但可见到数个形态正常的初级卵泡、次级卵泡和窦卵泡。三组的原始卵泡均未见有PCNA阳性表达,PCNA阳性表达见于移植组初级卵泡的颗粒细胞和卵母细胞、次级卵泡和窦卵泡的颗粒细胞。结论冻融人胎儿卵巢组织异种移植后能存活,卵泡能正常发育到窦卵泡。     

小鼠卵巢组织在不同冷冻方案中形态学比较

目的　比较小鼠卵巢组织在不同降温过程中组织形态学变化。　方法　取21 d 10只 ICR小鼠双侧卵巢,随机均分为对照、快速、中速和慢速4组进行冷冻保存。5 d后解冻复苏,光镜下观察组织切片,比较各组不同发育阶段卵泡的比例以及卵泡、卵子和颗粒细胞形态、分布情况。　结果　4组不同发育阶段卵泡构成比无明显差异,初级卵泡占5.3%、次级卵泡占7.6%、窦前卵泡占85.7%及偶见少量窦卵泡,均未见典型的原始卵泡。4 组皱缩卵子的比例分别为 3. 9%、42. 6%、41.6%和34.9%;卵子保持圆形但胞浆内空泡体积>10%的分别占16.2%、57.2%、59.6%和19.5%;形态基本正常的卵子分别为80.6%、24.3%、23.6%和52.4%,在所有冷冻组中慢速组最高,但明显低于对照组。　结论　慢速冷冻结合植冰是小鼠卵巢组织冷冻保存比较有效的方案,但是冷冻方案尚需进一步完善。     

空卵泡综合征71例临床分析

目的探讨超促排卵周期中空卵泡综合征(EFS)发生的可能因素及复发的可能性。方法回顾性分析本院71例空卵泡综合征患者的病历资料,并对其中42例再次接受促排卵周期者的临床资料同第1次进行了比较,分析空卵泡综合征发生的可能因素。结果 71人平均年龄(36.0±4.8)岁,平均不孕年限7.2±4.8年;窦卵泡数(AFC)(5.2±3.8)个;基础卵泡刺激素(bFSH)(10.0±4.7)U/L;直径≥17mm的卵泡数(3.7±3.0)个。再次促排卵患者的控制性促排卵(COH)天数、COH用药总量、HCG日雌二醇(E2)水平、≥12mm卵泡数、≥14mm卵泡数、≥17mm卵泡数、HCG后至取卵时间,与第1次比较均无统计学差异(P0.05),但HCG用量和取卵日HCG水平显著高于第1次(P0.05),且97.6%(41/42)获得了卵母细胞。结论高龄(年龄≥35岁)、不孕年限长、卵巢低反应可能与EFS有关;对于某些促排卵患者,可能常规剂量的HCG不足以启动她们的卵母细胞减数分裂,增加HCG剂量有助于避免第2次发生空卵泡综合征;一次EFS并不意味着再次促排时有复发EFS高风险。     

冻融液的温度对人未成熟卵母细胞玻璃化冻融效果的影响

目的探讨冻融液的操作温度对未成熟人卵母细胞（GV、MI）玻璃化冻融效果的影响。方法收集卵胞浆内单精子注射（ICSI）患者的GV、MI卵母细胞,根据冻融液操作温度的不同分为A、B、C组。冻融后存活及未冷冻对照组（D组）卵母细胞体外成熟（IVM）培养,成熟的M11卵母细胞固定后进行免疫荧光染色,然后用NikonCISI激光扫描共聚焦显微镜观察纺锤体、染色体形态。结果实验组GA、GB、GC卵母细胞冻融后的存活率和体外成熟率分别为100％、81．3％、68．8％和33．3％、83．3％、72．7％,仅GC组的存活率与对照比较存在显著性的差异（P〈70．05）;实验组中只有GB组获得了纺锤体（20％）和染色体（10％）形态正常卵母细胞。实验组MA、MB、MC卵母细胞冻融后的存活率分别为71．4％、100％、83．3％,各实验组与对照组比较无显著性差异（P〉0．05）;MA组体外成熟率与对照组比较存在极显著性的差异（0％比57．1％,P〈0．01）,MB、MC与对照组的体外成熟率比较无显著性的差异（66．7％、80％比57．1％,P〉0．05）;仅MC获得1个正常纺锤体和染色体形态卵子。结论冻融液的合适操作温度可以提高未成熟卵子的冻融效果。