FQ-PCR检测人巨细胞病毒方法的建立及临床初步应用

目的:建立快速、敏感、特异的人巨细胞病毒(HCMV)实时荧光定量聚合酶链(FQ-PCR)反应检测巨细胞病毒.方法:选择HCMV的IE(立早基因)片段,设计出上下游引物和对应的TaqMan探针建立FQ-PCR反应体系,应用克隆的质粒对体系进行优化,建立标准品并制作出标准曲线,进行重复性检测,并以其他微生物为对照进行特异性检测,最后检测50例临床乳汁标本.结果:当HCMV质粒标准品浓度在1010-106 copy/L时,相关系数R＝0.997,相关性良好,各浓度标准品的Ct值变异系数小于5％,重复性较好.其他种类的细菌、病毒均未出现特异性扩增.50例临床乳汁标本中有43例扩增出阳性,检出率为86％(43/50).结论:实时FQ-PCR检测HCMV,具有快速,灵敏,方便的特点,有助于HCMV感染的病理机制和流行病学研究.     

宏基因组二代测序技术在临床应用中的研究进展

感染性疾病给人类带来了严重的疾病负担,传统的病原体实验室诊断技术存在着灵敏度和特异性差、检测周期长的问题。病毒和非典型病原体导致的感染对临床感染诊断技术提出更高要求。宏基因组二代测序(metagenomic next-generation sequencing, mNGS)是对样本中的微生物和宿主的遗传物质(DNA和RNA)进行高通量测序和综合分析的一种诊断技术,mNGS正在改变临床微生物检验的格局以及传统诊断和治疗感染性疾病的模式。推广mNGS需解决多种技术问题,如宿主的核酸可导致病原体检测灵敏度降低,目前已开发了多种去除宿主核酸的方法以降低测序干扰;在mNGS数据中准确识别病原体序列需建立可靠的微生物数据库以及数据分析算法;对检测结果的分析需要不断优化知识库、“完善策略”、检测操作的便捷性和出具报告的时效性也影响该技术的应用,尤其是缩短检测报告时间对及时明确感染病原、实施精准诊疗至关重要。由mNGS衍生的纳米孔测序技术测序速度快、可实时分析数据、便携性强,有助于实现病原的快速诊断。现从mNGS发展和应用进展、mNGS技术临床应用的关键问题及解决方案、未来mNGS在临床应用中的延伸价...     

浅析分子生物学技术在临床常见病原微生物快速检测中的应用

目的:研究分析分子生物学技术在临床常见病原微生物快速检测中的应用。方法:选取我中心在2011年12月至2012年11月中临床常见病原微生物快速检测中使用分子生物学技术的资料进行回顾性研究分析。结果:随着生物学技术的快速发展,研究开发出生物传感器、基因芯片以及聚合酶链反应等三种新的技术。这三种新型技术彼此具有相应的有点,并且其在临床常见病原微生物快速检测中具有自身独特的特点,从而在一定程度上为病原微生物检测提供极为便利的条件。结论:分子生物学技术在临床常见病原微生物快速检测中发挥着极其重要的作用。     

黄热病病毒检测基因芯片的研究制备

目的制备黄热病病毒寡核苷酸检测芯片。方法根据黄热病病毒基因组序列,并应用生物信息学软件设计出22条寡核苷酸探针用于制备基因芯片。克隆于质粒上的黄热病病毒全长基因经限制性显示技术完成扩增并标记,杂交清洗后对芯片进行扫描和数据分析。结果大部分黄热病病毒寡核苷酸探针检测出阳性信号,阴性对照和空白对照检出阴性信号。结论基因芯片技术为黄热病病毒检测提供了一种早期、快速、可靠的方法。     

分子信标PCR检测志贺菌ipaH基因

目的用分子信标探针PCR快速检测志贺菌属(Shigella)。方法根据GenBank上公布的福氏志贺菌M32063株ipaH基因序列,设计引物和分子信标探针,以4种细菌进行对照,进行特异性和灵敏度分析,建立Shigella的实时PCR技术快速检测,应用于食物中毒和食品检测。结果检测20个样本,Shigella呈阳性,其它呈阴性,时间约2h。结论Shigella分子信标探针技术具有快速、灵敏度高、特异性强等特点,可用于Shigella食物中毒快速诊断和食品微生物检测,为食源性疾病的早期、准确诊断提供新的检测手段。     

病原宏基因组检测平台的建设以及质量保证

早期诊断是防控感染性疾病的关键, 病原宏基因组高通量测序(mNGS)技术突破了传统的培养方法或靶向分子检测手段的局限性, 利用鸟枪法高通量测序技术对临床标本中的微生物进行无偏倚的快速检测, 提升了疑难、罕见感染性病原体的诊疗水平, 目前已经得到了临床的广泛认可。mNGS检测流程复杂, 目前尚无统一的规范和要求, 而多数实验室在建立平台初期缺乏相关人才的储备, 致使mNGS平台建设和质量控制面临严峻挑战。本文从北京协和医院mNGS实验室本地化建设和运行过程中的实际经验出发, 从建立mNGS实验室的硬件要求、mNGS检测体系的建立和评估方法以及mNGS临床应用后的质量保证三个方面进行概述, 相对系统地介绍了mNGS检测平台和质量管理体系规范化建设和运行的建议。     

浅析临床常见病原微生物快速检测方法及应用

目的:探讨分子生物学技术在临床常见病原微生物快速检测中的应用价值。方法:回顾性分析某院实验室对2014年8月-2016年10月期间的临床常见微生物检测汇总报告资料,评价分子生物学技术在临床常见病原微生物检测中的应用情况,以165例患者的检测结果为例,对比实时荧光定量RT-PCR法与常规方法的阳性检出率。结果:近年来该院实验室在生物传感器、基因芯片、聚合酶链反应等几种新型技术的应用方面取得了长足发展,为临床病原微生物检测创造了便利条件,实时荧光定量RT-PCR法的阳性检出率为78.18%,明显高于常规方法(P0.05)。结论:分子生物学技术在临床常见病原微生物快速检测中的应用能够有效提高检测结果的准确性,值得推广并加大研究力度。     

荧光探针定量PCR及其临床应用

荧光探针定量ＰＣＲ（ＦＱ－ＰＣＲ）由ＰＣＲ与荧光素标记的探针杂交技术相结合，可用来检测临床标本中各种病原微生物的ＲＮＡ／ＤＮＡ。具有快速、简便、敏感、特异之优点。因其在单一试管内进行ＰＣＲ扩增，可避免普通ＰＣＲ由于污染所造成的假阳性，并可定量检测各种病原微生物的ＲＮＡ／ＤＮＡ含量。     

分子生物学技术应用于病原微生物检验工作中 发挥的作用分析

目的 观察、分析、比较分子生物学技术应用于病原微生物检验工作中发挥的作用.方法 将2014年10月~2015年10月期间,本院在临床常见病原微生物的快速检测中所应用的分子生物学技术作为研究对象,回顾性分析相关资料.结果 本院所应用的分子生物学技术主要有三种,即聚合酶链反应(PCR)技术、基因(DNA)芯片技术以及生物传感器技术,上述三种新兴的分子生物学技术都具有自身独特的优点,都能够给临床常见病原微生物的快速检测给予一定的便利条件.结论 在临床常见病原微生物的快速检测中,分子生物学技术发挥着关键的作用,合理应用分子生物学技术,具有重要的意义,值得临床上进一步推广、应用.     

结核分枝杆菌自身淬灭探针荧光定量PCR检测方法的建立

目的利用自身淬灭探针技术建立敏感、特异、快速、价廉且能广泛应用的结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法。方法构建重组质粒PET-32a（＋）-16srRNA作为标准品,自行设计自身淬灭探针,建立、优化定量PCR体系。并进行方法学评价及临床应用。结果所建立方法的线性检测范围为102～109copies／μL,灵敏度为lcopy／μL,特异性为100％。高拷贝样品的天问CV为2．65％、批内CV为1．86％,低拷贝样品的天间CV为2．12％、批内CV为0．78％。该方法比培养方法更快速、灵敏。结论以自身淬灭探针技术为平台的结核分枝杆菌荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性好,对结核病的早期快速诊断有较高价值。     

五种生物恐怖细菌基因悬浮芯片多重检测方法的建立

目的 建立5种生物恐怖细菌的快速、高通量的基因悬浮芯片检测方法 ,即炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、土拉弗朗西斯菌和类鼻疽伯克霍尔德菌的多重检测.方法 针对炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、土拉弗朗西菌、类鼻疽伯克霍尔德菌的特异性基因序列设计6对引物和相应的特异性探针,经多重PCR扩增并用生物素标记相应的基因片段,标记的PCR产物与包被在不同编码微球上的相应探针杂交,用悬浮芯片扫描仪检测.结果 多重PCR悬浮芯片检测体系能够正确的检测和鉴定5种生物恐怖细菌,特异性好,灵敏度高,可用于恐怖样本的高通量筛查.结论 建立了多重PCR基因悬浮芯片快速检测几种生物恐怖细菌的方法 .     

临床常见致病菌快速诊断用芯片的初步构建

目的:构建针对21种常见致病菌的快速诊断用芯片.方法:针对细菌的高度保守区域设计特异探针,优化条件下与细菌的PCR扩增产物进行杂交.结果:得到特异的杂交结果.结论:芯片方法可用于快速鉴别不同种类的细菌,该方法简便可行,优于传统诊断方法.     

诊断性传播疾病寡核苷酸芯片的研制

目的:探索寡核苷酸芯片的制备方法,并利用芯片技术进行性传播疾病的快速、平行诊断。方法:借助生物信息学方法,设计引物及特异性探针,制备芯片,与收集的性病阳性标本进行杂交,经显色,分析结果。结果:经过对收集到的19例性病的阳性标本进行杂交分析,都能显出特异性的斑点。结论:本研究用生物信息学方法设计的引物、探针是合理的,芯片用于性传播疾病的诊断是可行的。     

晚期肿瘤并发呼吸道感染70例痰培养临床分析

目的:探索晚期肿瘤患者并发呼吸道感染的特点。方法:针对不同的肿瘤患者,根据病情对口腔分泌物进行痰培养,检测并鉴定致病菌。70例患者中:男44例,女26例;年龄>60岁48例,50～60岁12例,<50岁10例。结果:晚期肿瘤患者并发呼吸道感染中G~-菌阳性率54.2%,G~+菌阳性率14.3%,真菌感染的阳性率为31.4%。结论:晚期肿瘤患者呼吸道较常见的感染致病菌种为真菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、大肠杆菌和铜绿假单胞杆菌,发病年龄主要集中在60岁以上男性患者。因此对于晚期肿瘤患者,应根据病情实时、正确留取标本,进行病原体检测并结合既往用药史,选择合理的治疗方案。     

单纯性室间隔缺损血清学诊断方法的探索

目的 探索并发展一种单纯性室间隔缺损的血清学诊断方法。方法 采用病例对照研究设计，用CM10蛋白质芯片检测56例单纯性室间隔缺损患儿和85例儿科常见病患儿血清，筛选血清差异蛋白，以血清差异蛋白质峰为预测变量构建单纯性室间隔缺损的血清诊断模型。结果 简化血清诊断模型ROC曲线下面积、预测准确率、灵敏度、特并度、阳性预测值及阴性预测值分别为0、913、88.37％、97.06％、82.69％、78.57％和97．73％。结论 血清诊断模型能够较好地区分病例与对照，对诊断室间隔缺损具有一定的实际意义。     

湖州地区妇女宫颈病变人乳头瘤病毒亚型感染情况分析

目的:研究湖州地区妇女宫颈病变患者人乳头瘤病毒(HPV)感染率及型别分布情况。方法:采用悬浮芯片技术对720例湖州地区妇女宫颈分泌物或脱落细胞进行18种高危型HPV和8种低危型HPV检测。结果:720例患者中HPV感染183例,占25.42%。单一感染135例,占18.75%;双重感染33例,占4.58%;三重以上感染15例,占2.08%。183例阳性标本主要为高危型HPV 16、58型,低危型HPV 11、6型。结论:湖州地区妇女宫颈病变患者HPV感染率为25.42%,并明确了HPV 16、HPV 58为该地区宫颈病变组织中HPV主要的流行亚型。     

P43基因在造血干细胞移植患者弓形虫感染诊断中的应用

目的 建立快速、特异、敏感诊断造血干细胞移植(HSCT)患弓形虫感染情况的DNA检测方法，并讨论其临床意义。方法 利用ELISA和PCR方法对56例造血干细胞移植受及20例正常供同时进行检测。结果 检测造血干细胞移植受56例，PCR和ELISA方法检测弓形虫P43基因片段和其抗原，阳性各为10及7例；其阳性率分别为17．86％和14．3％。作为阴性对照的20名正常同时进行弓形虫的检测，其结果均为阴性。结论 体外扩增弓形虫P43基因的方法具有准确、快速、特异和敏感的优点，可以作为造血干细胞移植患弓形虫感染诊断的有价值的方法之一。     

原发性肝癌患者血浆凝血酶原测定的研究

目的：研究原发性肝癌患血浆凝血酶原的变化，并探讨其诊断价值。方法：原发性肝癌病人15例，并设健康成人对照组30例。用Ecarin—发色底物法检测其凝血酶原总量与吸附后凝血酶原量，用一期法测定PT。结果：患PT、凝血酶原总量与吸附后凝血酶原量均高于对照组，后在原发性肝癌的阳性率为93．33％(14／15)，如以超过正常值一倍为诊断值，其阳性率为73．33％(11／15)。结论：原发性肝癌患血浆中异常凝血酶原量明显增多，可作为诊断标志物之一。     

多参数流式细胞术在多发性骨髓瘤诊断中的价值

目的:探讨多发性骨髓瘤(MM)患者免疫表型表达特点。方法:应用多参数流式细胞术(MP-FCM)测定30例MM患者和8例继发性单克隆免疫球蛋白血症骨髓细胞免疫表型。结果:骨髓瘤细胞CD138和CD38均阳性,86.7%CD56阳性,而CD45阴性或弱阳性,93.3%CD19阴性;继发性单克隆免疫球蛋白血症患者CD19、CD38、CD138、CD45均阳性,CD56阳性率12.5%。结论:应用MP-FCM同时检测细胞表面CD38、CD138、CD19、CD56、CD45表达情况,可方便区分骨髓瘤细胞与良性浆细胞,是MM的重要诊断依据。     

Use of polymerase chain reaction and nonradioactive DNA probes to diagnose Entamoeba histolytica in clinical samples.

E. histolytica parasites in Mexican children's stools were identified and typed as pathogenic or non-pathogenic using the polymerase chain reaction (PCR) and nonradioactive probes. PCRs were performed with primers specific for 145 base pair (bp) pathogenic or 133 bp non-pathogenic DNA sequences, which are highly repeated in E. histolytica parasites with pathogenic or non-pathogenic isoenzyme patterns, respectively. Dot-blotted PCR products were identified with a horseradish peroxidase-conjugated oligonucleotide probe specific for either the 145 bp pathogenic or 133 bp non-pathogenic sequences. The PCR and the 145 bp pathogenic probe correctly identified eight cultures with pathogenic isoenzyme types and none of nine cultures with non-pathogenic isoenzyme. The PCR and 133 bp non-pathogenic probe identified all of the non-pathogenic cultures, none of the axenized pathogenic cultures, and three of five xenic cultures with pathogenic isoenzymes. The two probes together identified all 49 stools containing E. histolytica by light microscopy (sensitivity = 1.0), which represented the entire set of the E. histolytica-positive stools diagnosed at the Hospital Infantil over a 10 week period. Most patient isolates were positive with both 145 bp pathogenic and 133 bp non-pathogenic probes, suggesting that these children, 60% of whom were dysenteric, are infected with mixed populations of amebas.