抗人F蛋白单克隆抗体的制备和鉴定

Ｆ蛋白是存在于哺乳动物肝细胞质中的一种水溶性不稳定的单链蛋白质,相对分子质量（Ｍｒ）为４４０００。正常人肝组织中大约含Ｆ蛋白２７４ｍｇ／ｇ〔１，２〕,而血清中仅含０．２ｍｇ／Ｌ,提示血清Ｆ蛋白作为判断肝损伤程度的可能性。为对Ｆ蛋白进行深入研究,并提高对其检测的灵敏度,１９９５年以来,我们先后制备了３株抗人Ｆ蛋白的单克隆抗体（ｍＡｂ）,并进行了初步鉴定。１材料和方法１．１材料人Ｆ蛋白抗原的制备〔３〕：取肝外伤手术切除的新鲜肝组织５０ｇ,剪成约５ｍｍ３的组织碎块后,置于含有１ｇ／ＬＩＶ型胶原酶（Ｓｉｇｍａ）…     

骨髓瘤蛋白(IgDλ)独特型单克隆抗体的制备

本文用从1例骨髓瘤患者(IgDλ)尿中提取的λ链作为抗原,免疫Balb/c小鼠,通过两次融合,分别经3～4次克隆后获得86株分泌单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞,经鉴定其中15株为抗独特型McAb。其中12株仅与同源性λ链和IgD反应,不与正常人λ链,k链,IgG、IgA、IgM、IgD、IgE及白蛋白(HSA)和一系列副球蛋白反应.间接免疫荧光法证明,抗独特型McAb与骨髓瘤患者外周血淋巴细胞和骨髓细胞阳性率高达23%,不与正常人群外周血淋巴细胞和骨髓细胞反应,其中部分McAb与实验室培养的浆细胞瘤株呈现阳性反应.     

抗人C-反应蛋白单克隆抗体的制备

C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)微量存在于正常人血清中,急性炎症,肿瘤或组织破坏时,含量增高。近年来人们越来越重视它在自身免疫性疾病、恶性肿瘤、心肌梗死和肾移植等疾病的诊断意义。为探索单克隆抗体用于临床及免疫机制研究的可能性,我们制备了抗人 CRP单克隆抗体。本文重点报告人 CRP 单克隆抗体的制备及鉴定。     

人颗粒蛋白前体F片段结构域单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗人颗粒蛋白前体F片段(GrnF)的单克隆抗体(mAb),并初步鉴定其生物学特性。方法通过分子生物学技术构建含人GrnF编码序列的酵母表达载体,表达并纯化酵母来源的融合人血清白蛋白(HSA)的GrnF片段HSA-GrnF。用纯化的HSA-GrnF免疫BALB/c小鼠,然后将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0进行融合,用ELISA筛选阳性克隆,并采用有限稀释法进行亚克隆;采用免疫荧光染色及Westernblot法对所获得的mAb的特异性进行鉴定,并用抗体亚类测定试剂盒检测所获得单克隆抗体亚类。结果成功获得2株可分泌特异性抗GrnF的杂交瘤细胞株(1G6及4E8),经鉴定这2株抗体重链亚类均为IgG1亚类。结论成功制备了抗人GrnF片段结构域的单克隆抗体。     

小鼠抗人亲环蛋白A(CypA)单克隆抗体的制备和应用

目的原核表达人亲环蛋白A (CypA)、制备抗人亲环蛋白A (CypA)单克隆抗体(mAb)并初步探索其在结肠癌发生发展中的作用。方法根据CypA基因序列,以原核表达系统表达CypA重组蛋白,经镍亲和层析柱纯化,免疫小鼠,杂交瘤法制备mAb;采用免疫组织化学染色法检测CypA在结直肠癌与癌旁组织中的差异表达,并分析与临床病理参数的相关性。结果成功构建了CypA原核表达载体,获得纯化的目的蛋白;获得1株稳定分泌抗人CypA mAb的杂交瘤细胞株;研究表明,结直肠癌组织CypA阳性染色率显著增高并与肿瘤分化程度及淋巴结转移相关。结论成功制备了小鼠抗人CypA mAb,并发现CypA在结直肠癌组织中高表达,与低分化和淋巴结转移呈正相关。     

抗人C4结合蛋白单克隆抗体的制备及某些方法的改进

用易于获得的C4BP/C4混合抗原免疫小鼠,EAC1q4C4BP血球间接血凝法作为筛选手段,获得了分泌抗C4BP抗体的杂交瘤细胞株。用单克隆抗体制成的亲和柱分离的C4BP,有C4BP的电泳特性和抑制EAC14与C2形成C3转化酶的活性。本文同时报告单克隆抗体制备方案的某些改进:1.小鼠免疫过程中用尾尖近似定量微量采血法对血中抗体水平定期监测,选择合适的小鼠供脾;2.用戊二醛固定的检测血球筛选杂交瘤,方法简便迅速,改变了杂交瘤筛选工作繁重的局面;3.用单细胞分离法达到单克隆化,缩短工作周期。     

人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备特异性人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体单克隆抗体,为建立TRAIL酶联吸附检测方法奠定基础。方法以原核表达系统重组制备的可溶性人sTRAIL作为抗原,利用杂交瘤技术筛选获得抗人TRAIL?mAb杂交瘤细胞株。体内诱生法生产腹水,经间接ELISA方法检测腹水效价,Western?blot鉴定抗体特异性。结果制备获得一株可稳定分泌抗人TRAIL?mAb的杂交瘤细胞株,属IgG2b亚类;腹水效价达1:5×106以上,Western?blot鉴定结果显示可特异性识别人TRAIL,而与TNF-α和Fas-l无明显的交叉反应。结论制备了具有高特异抗原结合特性的TRAIL?mAb。     

人博卡病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备

目的表达纯化人博卡病毒（human Bocavirus,HBoV）VP2蛋白,采用杂交瘤方法制备抗HBoVVP2蛋白的单克隆抗体。方法应用原核表达载体pET-30a和大肠埃希菌表达VP2蛋白,并用固定化金属亲和层析,纯化后的蛋白作为抗原免疫BALB／c小鼠,利用杂交瘤技术和间接ELASA方法筛选阳性的杂交瘤细胞,并对单克隆抗体进行分型检测和滴度测定。结果表达并纯化获得了重组HBoVVP2蛋白,利用杂交瘤技术得到单克隆IgG抗体,抗体效价达到1：4×10^5。结论利用HBoVVP2蛋白免疫制备了单克隆抗体,并具有较高的效价。本研究为快速诊断和研究HBoV打下基础。     

人博卡病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备

目的 表达纯化人博卡病毒( human Bocavirus,HBoV) VP2蛋白,采用杂交瘤方法制备抗HBoV VP2蛋白的单克隆抗体.方法 应用原核表达载体pET-30a和大肠埃希菌表达VP2蛋白,并用固定化金属亲和层析,纯化后的蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术和间接ELASA方法筛选阳性的杂交瘤细胞,并对单克隆抗体进行分型检测和滴度测定.结果 表达并纯化获得了重组HBoV VP2蛋白,利用杂交瘤技术得到单克隆IgG抗体,抗体效价达到1∶4×105.结论 利用HBoV VP2蛋白免疫制备了单克隆抗体,并具有较高的效价.本研究为快速诊断和研究HBoV打下基础.     

小鼠抗人呼吸道合胞病毒磷蛋白(P蛋白)单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备抗人类呼吸道合胞病毒(HRSV)磷蛋白(P蛋白)单克隆抗体,并对其进行鉴定。方法以原核表达系统表达的HRSV P蛋白重叠肽段作为免疫原,采用杂交瘤技术筛选P蛋白单克隆抗体,Western blot法验证筛选获得的单克隆抗体与P蛋白的结合活性,免疫荧光细胞化学染色确定获得的单克隆抗体能否用于RSV感染后HEp-2细胞中P蛋白的检测。结果筛选出反应性好、特异性识别HRSV P蛋白的单克隆抗体P181-15A3、 P211-16D8。获得的单克隆抗体通过Western blot法验证可与P蛋白结合,并可用于RSV感染后HEp-2细胞中P蛋白的免疫细胞化学检测。结论成功制备了小鼠抗HRSV P蛋白的单克隆抗体。     

抗人凋亡诱导因子单克隆抗体的制备与鉴定

背景：凋亡诱导因子不仅具有氧化还原和电子传递功能,还具有促细胞凋亡功能,从而在维持细胞正常生理活动中具有重要作用。 目的：制备抗人凋亡诱导因子单克隆抗体并进行生物学特性鉴定。 方法：利用Ensembl数据库及DNAstar软件包对凋亡诱导因子氨基酸序列进行分析,获得优势表位多肽,采用碳化二亚胺法将多肽与载体蛋白偶联制备完全抗原免疫动物,采用杂交瘤技术制备凋亡诱导因子单克隆抗体并纯化。 结果与结论：间接ELISA法检测显示,免疫鼠腹水中抗人凋亡诱导因子单克隆抗体效价达到1∶252 400。Western blot结果显示,存在与抗原带一致的相对分子质量67 000的特异条带。免疫组化检测结果显示,在结肠癌组织细胞中有棕色阳性颗粒表达,说明此抗体也可用于免疫组识化学染色。提示实验获得了高活性、高纯度、高特异性抗人凋亡诱导因子单克隆抗体。     

人HSPC011蛋白表达纯化和单克隆抗体制备

目的表达纯化人造血干细胞(hematopoietic stem/progenitor cell,HSPC)相关基因HSPC011,并制备其单克隆抗体.方法构建HSPC011原核表达载体,转化至E. coli诱导表达;Ni2+-NTA离子交换树脂层析纯化;纯化HSPC011蛋白免疫BALB/c小鼠,常规杂交瘤技术制备单克隆抗体;Western blot法鉴定其特异性;以所得特异性抗体为一抗,使用免疫组化法检测人毛囊毛乳头细胞中HSPC011的表达.结果成功构建了高效原核表达载体pET28a/HSPC011;经IPTG诱导在E.coli中表达了相对分子量约为13 000的目的蛋白;表达产物经纯化后纯度大于90%;获得1株抗HSPC011杂交瘤细胞;Western blot检测多种人体组织样本均在相对分子量约13 000处有一特异性条带;免疫组化检测在毛乳头细胞胞浆中可见阳性着色.结论成功表达纯化了人HSPC011蛋白并制备了其单克隆抗体,为进一步研究HSPC011基因在毛囊周期性生长调控中的具体作用,寻找有临床应用价值的毛囊活性蛋白奠定了基础.     

人骨形成蛋白2单克隆抗体的制备及鉴定

人骨形成蛋白２单克隆抗体的制备及鉴定卢兹凡胡传闽＊陈苏民路凡高磊刘新平（第四军医大学生化及分子生物学教研室＊病理学教研室，西安７１００３２）人骨形成蛋白２（ｈＢＭＰ２）是具有诱骨活性的蛋白质，在骨肉瘤中有高表达。为了进一步研究它在人体内生理及病理作用...     

人抗P53蛋白单克隆抗体的制备及评价

目的制备获得人P53蛋白单克隆抗体,并应用于免疫组化检测。方法利用基因重组方法,将p53基因构建到原核质粒载体上并诱导表达,将收集获得的P53蛋白免疫小鼠,经细胞融合及亚克隆手段获得鼠源单克隆抗体,与商品化的抗体DO-1共同染色蜡块包埋的病理组织样本,比较二者的染色结果。结果在筛选获得的与DO-1检测结果相近的5株抗体内,取检测结果最接近的1株抗体5E10,经Protein A/G株纯化抗体,与收集获得的数例癌症组织蜡块进行免疫组化验证,发现结果均与DO-1的结果无明显差异。结论成功制备并筛选出1株人抗P53单克隆抗体,可用于免疫组化染色。     

人精子蛋白17单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的:制备抗精子蛋白17(Sp17)的单克隆抗体(mAb)并鉴定其特性。方法:克隆人Sp17cDNA,表达带有6His标记的重组Sp17,用纯化的重组Sp17免疫BALB/c小鼠制备mAb。用ELISA筛选抗体阳性的细胞克隆。用免疫组化染色法及阻断试验鉴定mAb的特异性。结果:获得2株杂交瘤细胞系3C12和3D6,其分泌的mAb的Ig亚类(型)分别为IgG1和IgM(κ),杂交瘤细胞培养上清的ELISA效价分别为1∶64和1∶32;腹水mAb的效价分别为1∶1×105和1∶5×104。用人和大鼠睾丸组织以及人精液精子免疫组化染色及阻断试验证明,抗Sp17mAb具有良好的特异性。抗Sp17mAb也可识别卵巢癌组织中异常表达的Sp17。结论:成功地制备特异性的抗Sp17mAb,为研究该蛋白的功能、天然分布及异常表达奠定了基础。     

人胎盘层粘连蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的获得能特异性识别人层粘连蛋白（hLN）的单克隆抗体（McAb）。方法用纯化的人层粘连蛋白（hLN）作抗原免疫Balb/C小鼠,以细胞融合、酶联免疫吸附实验（ELISA）筛选和克隆化技术获得抗hLN的杂交瘤细胞株;用生物学方法鉴定杂交瘤细胞,用免疫学方法鉴定McAb的特异性。结果获得4株稳定分泌抗人LN的杂交瘤细胞株（2A1、3B5、2C4、4D1）,培养上清的ELISA效价分别为：1∶512、1∶1024、1∶512、1∶256;腹水效价分别为：1×10^6、1×10^7、1×10^6、1×10^5;采用ELISA相加法表明2A1、4D1与3B5、2C4识别的hLN上的抗原决定簇和识别的不同,4株单抗均属实IgG。结论成功建立了4株稳定分泌抗人LNMcAb的杂交瘤细胞株,它们分别识别hLN上2个不同的抗原位点,有望作为hLN定量检测的特异性抗体。     

抗人生长转化因子15单克隆抗体制备及鉴定

目的:制备抗人生长转化因子15(GDF15)单克隆抗体(mAb)并鉴定其特性。方法:构建GDF15原核表达载体pGEX-4T-2-gdf15,诱导表达并纯化GST-GDF15融合蛋白。以该融合蛋白免疫BALB/c小鼠,取小鼠的脾细胞与同系小鼠Sp2/0骨髓瘤细胞常规融合,依次进行阳性杂交瘤细胞株的筛选及亚克隆,最终获得稳定分泌抗GDF15 mAb杂交瘤细胞株。以间接ELISA法检测抗体效价;Western blot鉴定抗体特异性;免疫共沉淀法初步检测在肝癌患者血清中GDF15表达水平。结果:获得1株稳定分泌抗人GDF15 mAb杂交瘤细胞株,命名为9G3;抗体免疫球蛋白亚类为IgG1,轻链为κ型;免疫共沉淀及质谱分析证实抗GDF15 mAb9G3能与肝癌患者血清中GDF15蛋白特异性结合并且GDF15水平在肝癌患者血清中较正常人显著升高。结论:成功制备了抗人GDF15mAb,为后期肝癌早期诊断试剂盒的开发奠定了良好的基础。     

人颗粒蛋白前体F片段结构域单克隆抗体的制备与鉴定北大核心CSCD

目的制备抗人颗粒蛋白前体F片段(GrnF)的单克隆抗体(mAb),并初步鉴定其生物学特性。方法通过分子生物学技术构建含人GrnF编码序列的酵母表达载体,表达并纯化酵母来源的融合人血清白蛋白(HSA)的GrnF片段HSA-GrnF。用纯化的HSA-GrnF免疫BALB/c小鼠,然后将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0进行融合,用ELISA筛选阳性克隆,并采用有限稀释法进行亚克隆;采用免疫荧光染色及Westernblot法对所获得的mAb的特异性进行鉴定,并用抗体亚类测定试剂盒检测所获得单克隆抗体亚类。结果成功获得2株可分泌特异性抗GrnF的杂交瘤细胞株(1G6及4E8),经鉴定这2株抗体重链亚类均为IgG1亚类。结论成功制备了抗人GrnF片段结构域的单克隆抗体。     

利用单克隆抗体进行人凝血因子Ⅶ(FⅦ)的免疫亲和分离

作者阐述一种直接抗人凝血因子Ⅶ的单克隆抗体。人体凝血因子Ⅷ是维生素K依赖性血浆蛋白,该蛋白在组织因子和钙的存在下激活凝血因子Ⅹ。将抗部分纯化Ⅻ因子免疫BALB/c小鼠脾脏细胞和骨髓瘤细胞Sp2/0融合,用改良的Kohler和(Eur.J Immunol.,6:511,1976),杂交瘤细胞。用两种方法检测在培养基中产生的抗体:(1)用ELISA技术,(2)根据Towbin方法(Proc.natl.Acad.Sci.USA.76:4350.1979)在含有经电泳转移蛋白