丙型肝炎核心蛋白活化肝门部胆管癌细胞中NF—кB介导的信号转导途径

目的 研究丙型肝炎核心蛋白(HCvC蛋白)致癌作用的细胞内信号转导途径(STPs)。方法 将构建成功的HCVC基因重组真核表达载体pcDNAHCV-C，分别与环AMP反应分子(CRE)、血清反应因子(SRF)、血清反应分子(SRE)、活化蛋白—1(AP—1)及核转录因子—κB(NF—κB)重组表达质粒共转染肝门部胆管瘸细胞株(QBC939)，通过检测转染后细胞内荧光素酶活性确定与HCVC蛋白作用的信号转导分子。结果 HCVC蛋白通过NF—κB介导的STPs，使荧光素酶比活性较正常对照增高7倍；而HCVC蛋白并不能激活QBC939细胞中与pAP—1、pCRE、pSRF和pSRE相关信号转导途径。随着pcDNAHCV—C转染量的增多，NF—κB被活化的程度也升高，两者呈剂量依存关系。结论 HCvC蛋白活化肝门部胆管癌细胞中NF—κB介导的细胞内信号传导途径。     

突变型ⅠκBα转染对肝门部胆管癌多药耐药基因的调控作用

目的　探讨阻断核转录因子 κB(NF κB)活性对肝门部胆管癌细胞多药耐药基因(MDR 1)表达的影响。方法　用突变核转录因子 κB抑制蛋白αⅠκBα质粒 (mⅠκBα)转染肝门部胆管癌细胞株 (QBC93 9)及稳定表达丙型肝炎病毒核心蛋白 (HCVC)的QBC93 9(QBC93 9HCVC+) ,凝胶迁移率电泳 (EMSA)检测mⅠκBα质粒转染的QBC93 9和QBC93 9HCVC +细胞中NF κBDNA结合活性 ;逆转录 多聚酶链反应 (RT PCR )检测转染mⅠκBα质粒对肝门部胆管癌细胞中MDR 1基因及其表达产物 (P GP )表达的影响。结果　转染mⅠκBα质粒组的QBC93 9和QBC93 9HCVC +细胞放射性浓聚影明显淡于非转染组 ,密度计成对扫描显示 ,转染组和非转染组相对信号密度有明显差异 ;转染突变型ⅠκBα质粒的QBC93 9和QBC93 9HCVC +细胞中MDR 1mRNA和蛋白的表达水平明显低于非转染组。结论　转染mⅠκBα能明显逆转肝门部胆管癌细胞多药耐药性 ,阻断NF κB活性有望成为肝门部胆管癌基因治疗新策略的“靶位”。     

突变型ⅠkBα转染对肝门部胆管癌多药耐药基因的调控作用

目的 探讨阻断核转录因子-kB(NF-kB)活性对肝门部胆管癌细胞多药耐药基因(MDR-1)表达的影响。方法用突变核转录因子-kB抑制蛋白αⅠkBα质粒(mⅠ-kBa)转染肝门部胆管癌细胞株(QBC939)及稳定表达丙型肝炎病毒核心蛋白(HCVC)的QBC939(QBC939HCVC )，凝胶迁移率电泳(EMSA)检测mⅠkBa质粒转染的QBC939和QBC939HCVC 细胞中NF-kB DNA结合活性；逆转录-多聚酶链反应(RT—PCR)检测转染m-Ⅰ kBa质粒对肝门部胆管癌细胞中MDR-1基因及其表达产物(P—GP)表达的影响。结果 转染mⅠkBa质粒组的QBC939和QBC939HCVC 细胞放射性浓聚影明显淡于非转染组，密度计成对扫描显示，转染组和非转染组相对信号密度有明显差异；转染突变型ⅠkBa质粒的QBC939和QBC939HCVC 细胞中MDR-1mRNA和蛋白的表达水平明显低于非转染组。结论 转染mⅠkBa能明显逆转肝门部胆管癌细胞多药耐药性。阻断NF—kB活性有望成为肝门部胆管癌基因治疗新策略的“靶位”。     

反义CD147分子对人胆管癌细胞株侵袭性影响的实验研究

目的探讨反义CD147分子对人胆管癌细胞株QBC939侵袭性的影响。方法构建含反义CD147分子片段的重组真核表达质粒,将人胆管癌细胞株QBC939分为三组:(1)反义CD147组,运用重组真核表达质粒as CD147-pc DNA3.1(-)转染QBC939细胞;(2)空质粒组,运用pc DNA3.1(-)空质粒转染QBC939细胞;(3)对照组,运用DMEM常规处理细胞。采用MTT法检测各组QBC939细胞的生长情况,RT-PCR和Western blotting法分别对三组QBC939细胞中的CD147、MMP-2、MMP-9、TIMP-2的m RNA表达水平及其对应蛋白的表达水平进行检测。结果成功构建了携带反义CD147分子片段的重组真核表达质粒。MTT法检测显示:三组QBC939细胞的生长曲线及对数生长期情况无统计学差异(P0.05)。RT-PCR法检测显示:反义CD147组QBC939细胞中CD147和MMP-2分子的m RNA表达均低于空质粒组和对照组(P0.05),且空质粒组与对照组相比无统计学差异(P0.05);反义CD147组QBC939细胞中MMP-9和TIMP-2分子的m RNA表达与空质粒组和对照组相比无统计学差异(P0.05)。Western blotting检测发现:与空质粒组和对照组相比,反义CD147组QBC939细胞中CD147和MMP-2分子的蛋白表达明显降低(P0.05),空质粒组与对照组相比无统计学差异(P0.05);与空质粒组和对照组相比,反义CD147组QBC939细胞株中MMP-9和TIMP-2分子的蛋白表达无统计学差异(P0.05)。结论 (1)反义CD147对胆管癌细胞株QBC939的生长无影响;(2)反义CD147对胆管癌细胞株QBC939中MMP-9和TIMP-2的m RNA表达及对应蛋白表达无影响;(3)反义CD147降低胆管癌细胞株QBC939中CD147和MMP-2的m RNA表达及对应蛋白表达,可能会降低胆管癌细胞株的侵袭性。     

rhNIS基因转导胆管癌细胞介导125I摄取的研究

目的：探讨人钠/碘同向转运体(hNIS)基因cDNA转导至胆管癌细胞系QBC939细胞后的表达水平及其对介导125I摄取的影响。方法：将扩增出的hNIS基因cDNA序列克隆至pMD18-T载体;筛选后的亚克隆hNIS编码至真核表达型载体PDC316中,经脂质体途径导入胆管癌细胞（QBC939）,建立新细胞系(QBC939-A) 。同时设立空质粒(QBC939-B)转染和空白(QBC939-C)对照组。在体外培养条件下采用半定量RT-PCR检测各组2,3,6 d细胞内hNIS-mRNA表达水平和1,2,3,6 d的125I摄取情况。结果：建立了能稳定表达hNIS基因的新型细胞系QBC939-A。hNIS-mRNA表达水平检测显示,QBC939-A于3 d表达量达高峰,与QBC939-B和QBC939-C比较,有显著性差异（P<0.05）。且QBC939-A细胞的摄碘能力在转染后3 d达高峰,较QBC939-C高14倍,较QBC939-B高16倍。结论：rhNIS基因转导至胆管癌细胞足以在短期内介导125I的摄取,为介导125I靶向治疗胆管癌的研究奠定了基础。     

rhNIS基因转导胆管癌细胞介导125Ⅰ摄取的研究

目的 探讨人钠/碘同向转运体(hNIS)基因cDNA转导至胆管癌细胞系QBC939细胞后的表达水平及其对介导125Ⅰ摄取的影响.方法 将扩增出的hNIS基因cDNA序列克隆至pMD18-T载体;筛选后的亚克隆hNIS编码至真核表达型载体PDC316中,经脂质体途径导入胆管癌细胞(QBC939),建立新细胞系(QBC939-A).同时设立空质粒(QBC939-B)转染和空白(QBC939-C)对照组.在体外培养条件下采用半定量RT-PCR检测各组2,3,6 d细胞内hNIS.mRNA表达水平和1,2,3,6 d的125Ⅰ摄取情况.结果 建立了能稳定表达hNIS摹因的新型细胞系QBC939-A.hNIS-mRNA表达水平检测显示,Q13C939-A于3 d表达量达高峰,与QBC939-B和QBC939-C比较,有显著性差异(P＜0.05).且QBC939-A细胞的摄碘能力在转染后3 d达高峰,较QBC939-C高14倍,较QBC939-B高16倍.结论 rhNIS基因转导至胆管癌细胞足以在短期内介导125Ⅰ的摄取,为介导125Ⅰ靶向治疗胆管癌的研究奠定了基础.     

丙型肝炎病毒核心蛋白激活肝门部胆管癌细胞血管内皮生长因子的表达

目的 探讨丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白对肝门部胆管癌生长和转移的影响。方法 首先构建表达HCV核心蛋白的真核表达载体pcDNA3-HCVcore,再将含有 pcDNA3-HCVcore的载体和不含 pcDNA3-HCV core的空载体分别导入肝门部胆管癌细胞株 QBC939中,RT-PCR和免疫组织化学检测 VEGF mRNA和蛋白表达。结果 重组质粒 pcDNA3-HCVcore在 QBC939细胞中有稳定表达;表达 HCV核心蛋白的细胞QBC939的 VEGF在蛋白水平和 mRNA水平较转染空载体的细胞QBC939明显升高。结论 HCV核心蛋白能激活VEGF表达,可能对肝门部胆管癌的生长和转移具有促进作用。     

siRNA下调NF-κB p65 基因表达影响人胆管癌QBC939细胞凋亡

目的运用RNA干扰技术下调胆管癌细胞株QBC939中核转录因子κB(NF-κB)p65基因表达对其肿瘤细胞生长的抑制作用。方法以阳离子脂质体Lipofectamine TM 2000作为转染试剂,将体外合成的人NF-κB p65的siRNA转染入胆管癌细胞QBC939。RT-PCR测定细胞内NF-κB p65 mRNA的表达。用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测NF-κB亚单位p65的DNA结合活性的改变。运用免疫组化、流式细胞仪、激光共聚焦法检测p65基因表达下调对QBC939细胞凋亡的影响。结果体外合成的人NF-κB p65 siRNA有效抑制了QBC939细胞中NF-κB p65 mRNA的表达(P0.01),同时ELISA结果显示,靶向NF-κB p65 siRNA组的p65亚单位与DNA结合活性明显低于对照组(P0.05),免疫组化DAPI核染色、流式细胞仪及激光共聚焦检测观察显示下调p65基因表达能够诱导QBC939细胞凋亡。结论 NF-κB p65的siRNA在胆管癌细胞QBC939调控方面起重要作用,通过沉默其表达可诱导胆管癌细胞凋亡抑制其生长增殖。     

Survivin 抑制人胆管癌细胞凋亡相关信号通路的实验研究

目的:探讨survivin基因对人胆管癌细胞凋亡信号通路的调节机制.方法:构建针对survivin基因的siRNA和对照siRNA,将QBC939人胆管癌细胞分为3组,分别为siRNA-survivin转染组,对照siRNA转染组和未转染组.转染后,首先用Western blot检测未转染QBC939细胞和QBC939/siRNA(-)细胞及QBC939/siRNA(+)细胞中survivin的表达,验证干扰效果,继而分别用流式细胞仪,激酶活性测定和Western blot检测以上3种状态的QBC939细胞的凋亡情况,caspase-3的活性和caspase-3,caspase-9及procaspase-9凋亡信号分子的表达.结果:QBC939/siRNA(+)细胞survivin蛋白表达量明显低于未转染的QBC939细胞(P＜0.05),而QBC939/siRNA(-)细胞survivin蛋白表达量无明显改变(P＞0.05).与未转染的QBC939细胞比较,QBC939/siRNA(+)细胞凋亡明显增加,caspase-3活性明显升高,caspase-3和caspase-9表达明显上调,而procaspase-9表达降低(均P＜0.05);上述指标在QBC939/siRNA(-)细胞与未转染的QBC939细胞间的差异无统计学意义(均P＞0.05).结论:survivin基因可能通过促进procaspase-9的活化阻止caspase-3和caspase-9的激活,从而抑制胆管癌细胞的凋亡.     

脆性组氨酸三联体基因对胆管癌细胞凋亡的影响

目的 观察脆性组氨酸三联体(FHIT)基因对胆管癌细胞株QBC939凋亡的影响,探讨FHIT基因对细胞周期蛋白Cyclin D1的调控作用.方法 通过构建重组人FHIT真核表达质粒转染QBC939细胞,应用流式细胞仪检测转染前后细胞凋亡的变化,并通过荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测胆管癌细胞Cyclin D1表达的变化.结果 成功构建出重组人FHIT真核表达质粒并转染入QBC939细胞,转染后QBC939细胞的凋亡率明显增高(25.8%比30.9%比55.4%,P<0.05);并且Cyclin D1 mRNA表达下降至原细胞株的0.03倍,该基因蛋白质的表达也明显下降(0.33±0.02对比0.33±0.01比0.14±0.02,P<0.05).结论 FHIT基因可以促进QBC939细胞凋亡,并能下调Cyclin D1基因的表达.     

乙型肝炎病毒X基因转染人胆管癌细胞系及对端粒酶逆转录酶mRNA表达的影响

目的了解乙型肝炎病毒X(HBx)基因转染对胆管癌细胞端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA的表达影响,阐明HBx基因调节hTERT基因转录表达在胆管癌发生中的意义。方法体外培养胆管癌细胞QBC939,应用脂质体介导的基因转染技术,将含HBx基因的真核表达载体转染到胆管癌细胞中;转染36h后以增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)表达判定转染成功率,流式细胞仪检测转染率;收集细胞提取总RNA,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分析转染后细胞内hTERT mRNA的表达变化,并通过细胞免疫化学和Western Blotting了解转染后胆管癌细胞内有无HBx蛋白的表达。结果转染含HBx基因表达载体和空载体的QBC939转染率为29．6％;转染HBx基因后hTERT mRNA表达量比未经转染或转染空载体的hTERT mRNA表达量明显增加;细胞免疫组化和Western Blotting也证实只在转染了HBx基因的胆管癌细胞有HBx蛋白表达。结论HBx基因转染能上调胆管癌细胞hTERT mRNA的转录表达。     

高浓度的卡巴胆碱体外诱导鼠胰腺腺泡细胞NF-κB活化

核转录因子NF κB 是调节炎症反应相关蛋白基因表达的关键因子之一,NF κB的活化在急性胰腺炎病理过程中起重要作用。胰腺腺泡细胞胰酶分泌的胆碱能受体信号转导通路是否参与调节NF κB活化,目前尚无报道。我们利用大剂量胆碱能受体激动剂卡巴胆碱体外作用于鼠胰腺腺泡细胞,测定细胞内NF κB活性,确定胆碱能受体信号转导通路是否参与调节NF κB活化。材料和方法1 .试剂:卡巴胆碱、胶原酶Ⅳ、大豆胰蛋白酶抑制物、小牛血清、DMEM培养基、HEPES、谷酰胺、四氢化吡咯、二硫代氨基甲酸盐(Pyrrolidinedithiocar bamate ,PDTC)、抑肽…     

反义调控DNA甲基转移酶3b基因对人胆管癌细胞QBC939生长的影响

目的观察转染反义DNMT3b基因真核表达质粒对人胆管癌细胞QBC939生长的影响，初步探讨DNMT3b基因在胆管癌发生中的作用。方法构建反义DNMT3b基因真核表达质粒，用脂质体介导法将其转人人胆管癌细胞株QBC939；Western blot检测转染前后DNMT3b蛋白表达的变化；MTT法和软琼脂克隆形成试验观察细胞的生长增殖能力；流式细胞术观察细胞生长周期及凋亡率的变化。结果转染反义基因能使DNMT3b蛋白表达水平降低；转染反义DNMT3b基因不能抑制QBC939的生长曲线，对其软琼脂克隆形成率亦无影响（P=0．717）；转染反义DNMT3b基因不能改变QBC939的细胞周期和促进细胞凋亡（P=0．089）。结论转染反义DNMT3b基因真核表达质粒可下调DNMT3b在QBC939细胞中的表达水平，但对QBC939的生长和增殖无影响，也不能改变QBC939的细胞周期和促进细胞凋亡的发生。     

RNA干扰诱导型一氧化氮合酶基因表达对人胆管癌细胞生长的影响

目的:探讨RNA干扰诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因的表达对人胆管癌细胞生长的影响。方法:针对iNOS设计并合成3种iNOS-siRNA序列(siRNA1、siRNA2、siRNA3)及阴性对照siRNA序列后,分别转染人胆管癌细胞QBC939细胞,用荧光显微镜下观察转染效率,通过iNOS mRNA与蛋白的变化分析干扰效果,选择干扰效果最为明显的iNOS-siRNA序列,观察其干扰后QBC939细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡的变化。实验以无处理的QBC939细胞为空白对照。结果:合成的3种iNOS-siRNA序列均可有效转染人胆管癌QBC939细胞,且转染后均能明显降低QBC939细胞中iNOS mRNA与蛋白的表达(均P0.05),其中siRNA2对iNOS的抑制作用最为明显,阴性对照siRNA序列对QBC939细胞中iNOS mRNA与蛋白的表达无明显影响(均P0.05)。转染siRNA2后,QBC939细胞增值明显降低、出现明显的G0/G1期阻滞、凋亡率明显增加(均P0.05);转染阴性对照siRNA序列的QBC939细胞无上述改变(均P0.05)。结论:RNA干扰能有效降低iNOS基因在胆管癌细胞中的表达,从而抑制胆管癌细胞的增殖,并促进其凋亡。     

GABA对胆管癌细胞株QBC939增殖及凋亡的影响

目的观察γ-氨基丁酸(GABA)对胆管癌细胞QBC939增殖及凋亡的影响。方法采用MTT比色法观察GABA对人系胆管癌细胞QBC939增殖的作用,流式细胞术检测GABA对胆管癌细胞QBC939凋亡及其细胞周期的影响,放射免疫分析法检测cAMP含量。结果GABA抑制胆管癌细胞的增殖,呈剂量依赖性,流式细胞仪检测结果显示,随药物浓度增加,细胞凋亡率显著增加(4.8%增至28.03%,P<0.05),同时促进胆管癌细胞内cAMP含量的增加。结论GABA抑制胆管癌细胞QBC939增殖,诱导细胞凋亡,可能机制是通过受体后信息介导的。     

反义RhoC基因对胆管癌QBC939细胞株基质金属蛋白酶－2的抑制作用

目的 观察反义RhoC基因对胆管癌QBC939细胞株的基质金属蛋白酶-2(MMP-2)表达的影响.方法 将反义RhoC真核表达载体转染人胆管癌细胞株QBC939,逆转录－聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测MMP-2在QBC939细胞、转染空载体的QBC939细胞(QBC939-V)、转染反义RhoC的QBC939细胞(QBC939-AS)的mRNA和蛋白相对表达量.结果 QBC939细胞MMP－2 mRNA吸光度相对值为0.588±0.074,QBC939-V细胞为0.629±0.061,两者差异无统计学意义(P＞0.05),QBC939-AS细胞MMP-2 mRNA吸光度相对值为0.286±0.097;与QBC939及QBC939－V比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 反义RhoC基因能够抑制QBC939细胞株的MMP-2表达.     

γ-氨基丁酸抑制胆管癌细胞株QBC939增殖及其机制的研究

目的 观察γ-氨基丁酸(GABA)对胆管癌细胞QBC939增殖、凋亡和端粒酶活性的影响.方法 采用MTT比色法观察GABA对人系胆管癌细胞QBC939增殖的作用,流式细胞术检测GABA对胆管癌细胞QBC939凋亡的影响,PCR-ELISA法观察其对QBC939细胞端粒酶活性的影响,放射免疫分析法检测cAMP含量.结果 GABA抑制胆管癌细胞的增殖(抑制率由2.6%增至26.8%,P<0.05),促进细胞凋亡(凋亡率由4.8%增至28.03%,P<0.05),并且抑制癌细胞中端粒酶的活性(0.82±0.048 vs 0.56±0.054,P<0.05),同时促进胆管癌细胞内cAMP含量的增加[(0.59±0.049)nmol/L vs (0.82±0.033)nmol/L,P<0.05].结论 GABA可能通过受体后信息介导途径,诱导细胞凋亡,并抑制癌细胞端粒酶活性,从而抑制胆管癌细胞的增殖.     

IL-6在胆管癌细胞株QBC939中的生物学效应及其信号传导途径

目的探讨白细胞介素6(IL-6)在胆管癌细胞株QBC939中产生生物学效应的信号传导途径。方法通过MTT法检测IL-6刺激QBC939细胞后对其生长增殖的影响;采用电泳迁移变动试验(EMSA)和Western blot观察IL-6刺激前后QBC939细胞中IL-6相关转录因子Stat3和参与IL-6信号传导功能的蛋白激酶Jak1的诱导活化状态,并确定该细胞中的IL-6信号传导通路;通过免疫细胞化学染色确定磷酸化Stat3在QBC939细胞内的定位。结果IL-6可显著促进QBC939细胞的增殖;转录因子Stat3和蛋白激酶Jak1都能在QBC939细胞中被IL-6诱导激活,且Stat3的活性与IL-6的刺激呈一定的剂量和时间依赖性;磷酸化Stat3的染色定位于QBC939细胞核。结论JAK/STAT信号传导途径的活化介导了IL-6对QBC939细胞增殖的促进功能。     

腺病毒载体介导的双自杀基因对人胆管癌细胞QBC939的体外杀伤实验

目的观察腺病毒介导的胞嘧啶脱氨酶/单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(CD/TK)双自杀基因对人胆管癌细胞 QBC939的体外杀伤作用。方法 CD/TK 克隆入穿梭载体成为 pAdtrack-CMV-CD/TK,与骨架载体 pAdeasy-1在细菌内同源重组为 pAd-CD/TK,经 PacⅠ酶切,293细胞包装、扩增、纯化后,体外转染人胆管癌细胞 QBC939,并给予前药5-FC 或 GCV,观察其体外杀伤效果。结果含 CD/TK 基因的重组腺病毒鉴定正确,扩增纯化后,病毒滴度为1×10~(11)颗粒/ml。重组腺病毒对 QBC939细胞在感染倍数(m.o.i)为100时的转染效率为90%,在 m.o.i50感染时,0.1mmool/L的5-FC 及10 μmol/L 的 GCV 对 QBC939细胞的杀伤率为80%,明显高于单用5-FC 与 GCV 的效应。结论双自杀基因以腺病毒为载体对人胆管癌细胞转染效率高,体外杀伤效应明显。腺病毒介导的双自杀基因治疗有望成为治疗胆管癌的有效方法。