大鼠骨髓间充质干细胞在特定培养液条件下向软骨细胞表型定向分化的实验

背景：组织工程化软骨的构建为软骨缺损的修复开辟了全新的途径，克服了传统治疗方法的不足、目的：探讨分离骨髓间充质干细胞，在特定培养液条件下诱导其向软骨细胞表型转化的体外培养方法。设计：完全随机实验单位：广西医科大学第一附属医院创伤骨科、手外科及广西医科大学组织学与胚胎学教研率方法：实验于2002-08／2003-04在广西医科大学完成。实验动物选择新生断奶SD大鼠20只抽取大鼠四肢骨髓，Perrcoll梯度分离液离心分离结合贴擘筛选法得到间充质下细胞，在含体积分数0．15的胎牛血清的低糖DMEM培养液中，置于37℃，体积分数为0．05的CO2培养箱内培养10～14d。传代后以体积分数0.15的胎牛血清的高糖DMEM培养液（含转化生长因子β1 10μg/L．地塞米松10^-7mol/L维生素C50mg／L）对其进行诱导培养。主要观察指标：观测在体外特定培养条件下间充质干细胞的形态、生长特点和诱导培养后软骨特异性基质的表达情况结果：所有20只SD大鼠全部进行分析观察，无一例脱失：①分离获取了较高纯度的骨髓间充质干细胞，保持了细胞的活性。②骨髓间充质干细胞原代培养晕均匀分布的集落样生长，呈长梭形；传代培养中形态特性无明显变化，细胞增殖周期缩短，细胞均质性明显提高。③诱导后的细胞由梭形向多角形转变，Ⅱ型胶原免疫组化阳性。④诱导培养后软骨特异性基质Ⅱ型胶原免疫组化阳性结论：①采用Percoll梯度分离液离心分离结合贴壁筛选法可获得较高纯度和活性的骨髓间充质十细胞②间充质于细胞在体外特定培养条件下能大量增殖，实现数量扩增、③间充质干细胞在特定培养液的诱导下能向软骨细胞表型转化，并能分泌软骨特异性基质，可成为软骨组织工程理想的种子细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞在特定培养液条件下向软骨细胞表型定向分化的实验

背景组织工程化软骨的构建为软骨缺损的修复开辟了全新的途径,克服了传统治疗方法的不足.目的探讨分离骨髓间充质干细胞,在特定培养液条件下诱导其向软骨细胞表型转化的体外培养方法.设计完全随机实验.单位广西医科大学第一附属医院创伤骨科、手外科及广西医科大学组织学与胚胎学教研室.方法实验于2002-08/2003-04在广西医科大学完成.实验动物选择新生断奶SD大鼠20只.抽取大鼠四肢骨髓,Percoll梯度分离液离心分离结合贴壁筛选法得到间充质干细胞,在含体积分数0.15的胎牛血清的低糖DMEM培养液中,置于37℃,体积分数为0.05的CO2培养箱内培养10～14 d.传代后以体积分数0.15的胎牛血清的高糖DMEM培养液(含转化生长因子β110μg/L,地塞米松10-7mol/L,维生素C 50 mg/L)对其进行诱导培养.主要观察指标观测在体外特定培养条件下间充质干细胞的形态、生长特点和诱导培养后软骨特异性基质的表达情况.结果所有20只SD大鼠全部进行分析观察,无一例脱失.①分离获取了较高纯度的骨髓间充质干细胞,保持了细胞的活性.②骨髓间充质干细胞原代培养呈均匀分布的集落样生长,呈长梭形;传代培养中形态特性无明显变化,细胞增殖周期缩短,细胞均质性明显提高.③诱导后的细胞由梭形向多角形转变,Ⅱ型胶原免疫组化阳性.④诱导培养后软骨特异性基质Ⅱ型胶原免疫组化阳性.结论①采用Percoll梯度分离液离心分离结合贴壁筛选法可获得较高纯度和活性的骨髓间充质干细胞.②间充质干细胞在体外特定培养条件下能大量增殖,实现数量扩增.③间充质干细胞在特定培养液的诱导下能向软骨细胞表型转化,并能分泌软骨特异性基质,可成为软骨组织工程理想的种子细胞.     

体外定向诱导鹿茸间充质干细胞向软骨细胞的分化

目的：间充质干细胞的诱导分化的研究多见于骨髓、脐血等组织，而在鹿茸组织中分离的间充质干细胞是否能诱导为软骨细胞目前尚不清楚。实验拟建立梅花鹿鹿茸生长中心间充质干细胞体外培养方法，观察转化生长因子β1体外诱导鹿茸间充质细胞分化为软骨细胞的可行性。 方法：实验于2006—03／2007—06在吉林大学畜牧兽医学院基础兽医研究室完成。①实验材料：4岁龄健康雄性梅花鹿由中国农科院左家特产研究所提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：于生长早期锯取梅花鹿鹿茸，在解剖显微镜下定位和切取间质层（突起部），即为鹿茸间充质干细胞所在的组织层。Ⅰ型胶原酶消化法原代分离培养鹿茸生长中心间充质干细胞，锥虫蓝染色显示细胞活性达90％以上，将活性确定后的细胞液氮冻存。取第3代细胞，用含10％胎牛血清以及10μg／L转化生长因子β1的条件培养基诱导培养。③实验评估：培养12d后于倒置显微镜下观察细胞形态，采用细胞化学及免疫细胞化学鉴定细胞。 结果：①鹿茸生长中心间充质干细胞的分离与培养：Ⅰ型胶原酶消化法培养可以获得均一的间充质干细胞，贴壁的间充质干细胞形态均匀，呈长梭形，克隆样生长，增殖迅速。②转化生长因子β1体外定向诱导鹿茸间充质细胞分化为软骨细胞：转化生长因子β1诱导分化的鹿茸间充质细胞生长迅速，诱导后细胞形态明显改变，呈典型的软骨细胞形态，甲苯胺蓝染色阳性，Ⅱ型胶原表达阳性。 结论：采用酶消化法可以从鹿茸生长中心间充质层中分离出间充质干细胞，在体外转化生长因子β1具有促进鹿茸生长中心间充质干细胞分化为软骨细胞的能力。     

体外诱导的人脂肪间充质干细胞源性软骨细胞体内成骨活性

目的：目前对间充质干细胞向软骨细胞诱导分化主要包括体内诱导和体外诱导两种方式，前者依靠体内微环境。随机性大且难以进行监控和调整。本实验探讨体外诱导人脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化，以及诱导后细胞在裸鼠体内的成软骨能力。 方法：实验于2006-08／2007—05在中南大学湘雅医院中心实验室完成。①对象与材料：皮下脂肪组织来源于股骨颈骨折手术患者6例，年龄25～64岁，对实验及治疗均签署知情同意书。实验经医院医学伦理委员会批准。清洁级裸鼠5只，体内成软骨实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。离心管容量20mL。由GeneRay公司生产。②实验方法：将皮下脂肪组织剪碎，Ⅰ型胶原酶消化法分离培养脂肪间充质干细胞。待细胞铺满瓶底80％时胰酶消化传代。传至第6代时收集5×10^6个细胞，用含1％新生牛血清、高糖DMEM、10μg／L转化生长因子β1、37．5mg／L维生素C、6．25mg／L胰岛素、6．25mg／L转铁蛋白、10^-7mol／L地塞米松的软骨细胞诱导剂重悬于无支架离心管内。③实验评估：诱导过程中观察细胞聚集状态。诱导2周后采用苏木精-伊红染色、RT-PCR、Western blot对细胞形态及功能变化进行检测。将诱导后细胞与纤维蛋白原凝胶混合，植入裸鼠皮下，3周后切取植入组织块。苏木精．伊红染色及11型胶原免疫组化染色观察体内成软骨情况。 结果：①诱导后细胞聚集状态：诱导2d后脂肪间充质干细胞自行聚集为一条状细胞团，1周后细胞团聚集呈球状。②苏木精-伊红染色结果：未见有软骨陷窝形成。③RT-PCR检测结果：细胞团内Ⅱ型胶原蛋白和Sox9 mRNA均呈阳性表达。④Western blot检测结果：细胞团内有较强的Ⅱ型胶原蛋白和Aggrecan表达。⑤体内成软骨情况：植入裸鼠皮下的组织块内有大量软骨陷窝及Ⅱ型胶原蛋白形成?     

胰岛素样生长因子1对人脂肪来源的间充质干细胞向软骨细胞定向诱导分化的作用

背景:近年研究者发现胰岛素样生长因子1还可以诱导骨髓来源间充质干细胞向软骨细胞方向分化,但目前尚未见胰岛素样生长因子1诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞方向分化及在此过程中与转化生长因子β1相瓦作用的报道.目的:观察胰岛素样生长因子1诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞定向分化的可能性及在诱导分化中和转化生长因子β1的相互作用.方法:获取脂肪来源间充质干细胞,以2×10~5 cells/cm~2的密度接种于培养瓶,使用含胰岛素样生长因子1或(和)转化生长因子β1的无胰岛素软骨诱导剂诱导脂肪来源间充质干细胞.2周后获取细胞,制备细胞爬片,进行甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,观察细胞内高硫酸化的蛋白聚糖和Ⅱ型胶原着色情况.RT-PCR检测Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan及Sox9mRNA的表达.结果与结论:加入诱导剂后,甲苯胺蓝染色显示3个诱导组细胞呈多角形,胞浆及胞膜呈蓝色异染.Ⅱ型胶原免疫组织化学染色显示3个诱导组细胞胞浆及胞膜呈棕黄色着色.RT-PCR检测显示胰岛索样生长因子+转化生长因子组Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan、Sox9 mRNA的表达均显著强于胰岛素样生长因子组和转化生长因子组,胰岛素样生长因子组和转化生长因子组显著强于对照组,而胰岛素样生长因子组与转化生长因子组差异无显著性意义.提示胰岛素样生长因子1可以单独诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞分化,表达软骨细胞特异性细胞表型,胰岛素样生长因子1与转化生长因子β1诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞分化有协同作用.     

脂肪干细胞与骨髓间充质干细胞心肌样分化特性的比较

目的：骨髓间充质干细胞与脂肪干细胞均具有分化为心肌细胞的潜能。观察脂肪干细胞体外诱导分化为心肌细胞的特性及相关基因表达，比较骨髓间充质干细胞与脂肪干细胞心肌分化能力的差异。方法：实验于2006—08／2007—04在吉林省耳鼻咽喉研究所和教育部吉林大学人兽共患病重点实验室完成。①实验材料：脂肪组织标本来源于本院手术患者，所有患者知情同意，术中收集多余的皮下脂肪。（爹实验方法：分离培养人脂肪干细胞，用5-氮胞苷诱导传4～6代的脂肪干细胞分化，平行培养第5代骨髓间充质干细胞，诱导条件相同，对照组培养液不添加任何诱导因子。③实验评估：采用免疫荧光技术观察脂肪干细胞和骨髓间充质干细胞表达结蛋白Desmin和肌钙蛋白TroponinT的阳性细胞率。通过即时RT．PCR的方法检测诱导过程中细胞内GATA-4和NKX2．5的mRNA水平。结果：脂肪干细胞经5-氮胞苷诱导后3周，肌性基因标志结蛋白desmin和肌钙蛋白Troponin—T阳性细胞明显增加。与骨髓间充质干细胞组比较，脂肪干细胞表达心肌特异蛋白的阳性细胞率在诱导后第14天明显升高，而在第21天时，两组细胞的阳性表达率均达到60％左右，无明显的统计学差别，未加任何诱导条件的脂肪干细胞对照组培养14d时有2．5％和1．6％的细胞表达Desmin，Troponin．T，在骨髓问充质干细胞对照组未见心肌标记蛋白的阳性表达。即时PCR检测结果发现，诱导组与未经诱导组的脂肪干细胞均表达GATA-4和NKX2．5，骨髓间充质干细胞组在诱导后第7天出现GATA-4和NKX25的转录活性。结论：体外培养的脂肪干细胞能够被5-氮胞苷诱导分化为心肌样细胞，并且具有自发分化的能力，与骨髓间充质干细胞相比，脂肪干细胞的早期分化特性更有利于心肌干细胞移植治疗。     

骨髓间充质干细胞的体外培养及定向诱导分化

目的:探讨人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的体外培养生长特性及其在体外定向分化为神经样细胞的条件。方法:采用Ficoll-paque(1.077g/ml)分离液密度梯度分离hMSCs,显微镜下观察其生长特性,测定生长曲线;取传至3～6代的hMSCs,用阿魏酸钠对其进行诱导培养,并以β-巯基乙醇作对照观察诱导培养后细胞的形态变化,分别在6h、1d、3d和7d通过免疫荧光细胞化学染色方法测定诱导后细胞的神经元烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)和胶质纤维酸性蛋白(glia fiber acidprotein,GFAP),进行定量分析。结果:体外培养条件下hMSCs呈长梭形,细胞生长曲线呈S形,细胞倍增时间约为72h。阿魏酸钠诱导培养后6h可见细胞形态明显变化,NSE和GFAP表达阳性。24h后诱导细胞表现为典型的神经细胞样形态。第3天,NSE和GFAP表达最高,分别为67±3.5%和39±1.8%。结论:人骨髓间充质干细胞在体外具有自我更新能力及多分化潜能;阿魏酸钠具有诱导体外培养的人骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的作用。     

犬脂肪间充质干细胞体外分离培养及其多向分化潜能

目的:为进一步分析脂肪间充质干细胞的生物学特性,建立犬脂肪间充质干细胞的体外分离培养方法,并对其表面标志和多向分化潜能进行鉴定。方法:实验于2006-09/2007-04在解放军第四军医大学组织工程中心完成。①实验方法:1岁龄家犬麻醉后,无菌条件下取犬腹股沟皮下脂肪组织,用Ⅰ型胶原酶消化,离心弃上层脂肪及上清,沉淀用含体积分数为0.1胎牛血清的D/F12培养基制成单细胞悬液,按2×108L-1接种于培养瓶中,细胞长满80%时用胰酶消化传代。②实验评估:分别取第3,5,10代脂肪间充质干细胞,倒置显微镜下连续观察细胞形态变化;MTT法检测细胞增殖活性;采用免疫细胞化学和体外诱导分化方法对脂肪间充质干细胞表面分子标志和多向分化潜能进行鉴定。结果:①细胞形态观察:原代培养1d多数贴壁细胞呈圆形;3d时贴壁细胞数量明显增加,大部分呈梭形、三角形;6d后细胞呈团簇状生长,形成集落;9～10d后细胞融合超过80%。传代后2～4h开始贴壁,经过较短的潜伏期后开始增殖,3d即可长满培养瓶底壁。②细胞增殖活性:培养的细胞分裂增殖能力强,无明显的生长滞缓期,第3天进入对数生长期,第7天达到生长峰值,第8天后进入平台期。第3,5,10代细胞传代接种后的潜伏期、对数生长期、平台期无明显差异,传10代后细胞无明显的衰老征象。③细胞表面分子标志的鉴定:第3代脂肪间充质干细胞CD29,CD44均呈阳性表达。④脂肪间充质干细胞的多向分化潜能:向脂肪细胞诱导第6天胞质中出现透亮的小脂滴,油红染色呈阳性;向神经细胞预诱导24h后,细胞由梭形变为栅栏样,正式诱导0.5h后细胞呈双极或多极,3h后细胞形态不再发生变化,神经元特异性烯醇化酶、胶质原纤维酸性蛋白均呈阳性;向成骨细胞诱导第21天可见钙化结节。结论:体外分离培养的犬脂肪间充质干细胞生长稳定、增殖较快,存在脂肪组织来源干细胞的相关标志分子CD29及CD44,诱导后能向脂肪细胞、神经细胞和成骨细胞分化。     

人脂肪间充质干细胞生物学特征及体外向类角质细胞的分化

目的：在体外不同培养条件下，脂肪来源问充质干细胞可以向成骨细胞、成软骨细胞、神经细胞、内皮细胞、肌肉细胞、脂肪细胞和肝脏细胞等不同胚层来源的细胞分化。观察脂肪间充质干细胞在体外培养并向类角质细胞分化的能力。方法：实验于2005—06／2006—03在解放军军事医学科学院完成。实验方法：取20-45岁健康女性（已取得患者同意）脂肪组织行脂肪抽吸术后的脂肪颗粒。参照Zuk等方法分离脂肪问充质干细胞。取培养的第3代细胞，采用流式细胞仪鉴定细胞表面分子及细胞周期。取状态良好、融合至瓶底80％的第20代细胞，在5mg／L的秋水仙素处理后采集分裂细胞，以Giemsa染色进行核型分析。取第3代细胞以5μm维甲酸和5μg／L表皮细胞生长因子培养基向角质细胞诱导分化。对照组用含体积分数为0．05胎牛血清的L-DNMEM培养基。实验评估：采用倒置显微镜观察细胞形态，免疫组织化学方法检测角质细胞的标志物CK19。结果：①脂肪来源问充质干细胞表面分子CD29、CD90、CD44呈阳性，而CD34呈阴性。②细胞增殖曲线呈S型，接种的前3d细胞处于滞留期，3d后进入对数生长期，6d后进入平台期，细胞的群体倍增时间约为29h。处于对数生长期的细胞80％以上处于G0和G1期。③细胞染色体核型分析显示，染色体数目2n=46，核型46，xx，为女性正常核型。④对照组细胞贴壁后，呈成纤维细胞样，细胞呈长梭形，排列成漩涡状，贴壁较好。诱导组从诱导的第3天开始，细胞逐渐变成不规则，诱导第10天出现铺路石改变，形似角质细胞。⑤免疫组织化学方法检测显示，部分细胞专一地对CK19抗体呈阳性反应，有棕色染色。结论：可从人脂肪抽吸物中分离出间充质干细胞，脂肪间充质干细胞在体外一定条件下可向类角质细胞分化。     

兔骨髓间充质干细胞体外培养定向诱导分化为软骨细胞

背景:骨髓间充质干细胞具有分化为骨、软骨、肌腱、脂肪等组织的多分化潜能.目的:体外培养兔骨髓间充质干细胞并定向诱导分化为软骨细胞,探讨体外诱导分化为软骨的方法和条件.方法:取兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子体外培养后,取第3 代细胞在培养基中添加不同质量浓度转化生长因子β1 的软骨分化诱导剂,2 周后倒置显微镜观察细胞形态,甲苯胺蓝染色,RT-PCR技术检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达.结果与结论:可以从兔骨髓中培养出骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子能明显的促进骨髓间充质干细胞增殖.经软骨诱导分化后骨髓间充质干细胞呈软骨细胞形态,甲苯胺蓝染色阳性,Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达阳性.10 μg/L 的转化生长因子β1 诱导成软骨分化能力最强.     

海马区星形胶质细胞培养上清液体外诱导人脂肪基质细胞向神经元样细胞的分化

目的:观察海马区星形胶质细胞培养上清液能否在体外诱导人脂肪基质细胞向神经元样细胞分化。方法:实验于2004-10/2005-06在华北煤炭医学院中心实验室完成。在无菌条件下从Wistar乳鼠分离出海马组织,从分离的海马组织中获得星形胶质细胞,并收集其培养上清液。取外科手术获得的人腹部皮下脂肪组织进行人脂肪基质细胞的原代培养。30例患者均知情同意。取第3代人脂肪基质细胞接种到培养孔中,预先放置无菌盖玻片的24孔培养板,制备细胞爬片或者接种到培养瓶中,细胞生长达50%～60%融合时,去除培养液,换为海马区星形胶质细胞培养上清诱导液进行诱导,对照组培养液为无血清培养基。倒置相差显微镜下连续观察细胞生长情况和形态变化,应用免疫细胞化学、鉴定神经前体细胞的特异性标志神经巢蛋白、神经细胞的特异性标志神经元特异性烯醇化酶、微管联合蛋白2和神经胶质细胞的特异性标志胶质纤维酸性蛋白的表达。结果:①诱导培养第3天,部分人脂肪基质细胞开始变形,从原先的细长梭状细胞变成神经元样细胞,可见细胞伸出突起,多为双极或多极细胞。②刚分离接种的人脂肪基质细胞镜下呈圆形,悬浮状态,接种后24h内贴壁,并开始伸展,多呈梭形。1周后细胞融合成单层,排列出现方向性,但有少量圆形及卵圆形细胞混杂生长。③第4,5代人脂肪基质细胞在诱导48h后形态即开始发生变化,扁平的胞体较预诱导后逐渐回缩,向外伸出突起,72h后扁平的胞浆向胞核收缩,突起继续延长,以后随时间进展,具有典型神经细胞形态特点的细胞数量逐渐增多,形成双极或多极细胞。④免疫细胞化学检测人脂肪基质细胞诱导5d后发现有(10.5±3.7)%神经巢蛋白、(38.4±5.2)%胶质纤维酸性蛋白、(15.7±2.3)%神经元特异性烯醇化酶表达,未见微管联合蛋白2的表达。结论:海马区星形胶质细胞培养上清液可以在体外诱导人脂肪基质细胞向神经元样细胞方向分化。     

脂肪基质干细胞和骨髓基质干细胞的体外分化能力

背景：脂肪基质干细胞和骨髓基质干细胞具有很多相似的生物学特性。目的：比较脂肪基质干细胞和骨髓基质干细胞与受损PC12细胞分别共培养后定向分化能力的差异。方法：分别分离培养脂肪组织来源和骨髓组织来源的基质干细胞,取第5代细胞进行实验,2种细胞分别与正常或受损PC12细胞培养上清液共培养,或仅单独培养。结果与结论：脂肪基质干细胞和骨髓基质干细胞均表达较高水平的CD44和CD29,而后者表达的CD45、CD56在前者几乎未检测到。单独培养的2种细胞均表达较高水平的Nanog、Oct4、Sox2,不表达神经元特异性烯醇酶。其中经受损PC12细胞干预的2种细胞Nanog、Oct4、Sox2表达水平显著降低,而脂肪基质干细胞中神经元特异性烯醇酶阳性细胞数更多,提示受损PC12细胞对于脂肪基质干细胞可能具有更强的诱导分化作用。     

脂肪基质干细胞和骨髓基质干细胞的体外分化能力

背景:脂肪基质干细胞和骨髓基质干细胞具有很多相似的生物学特性。目的:比较脂肪基质干细胞和骨髓基质干细胞与受损PC12细胞分别共培养后定向分化能力的差异。方法:分别分离培养脂肪组织来源和骨髓组织来源的基质干细胞,取第5代细胞进行实验,2种细胞分别与正常或受损PC12细胞培养上清液共培养,或仅单独培养。结果与结论:脂肪基质干细胞和骨髓基质干细胞均表达较高水平的CD44和CD29,而后者表达的CD45、CD56在前者几乎未检测到。单独培养的2种细胞均表达较高水平的Nanog、Oct4、Sox2,不表达神经元特异性烯醇酶。其中经受损PC12细胞干预的2种细胞Nanog、Oct4、Sox2表达水平显著降低,而脂肪基质干细胞中神经元特异性烯醇酶阳性细胞数更多,提示受损PC12细胞对于脂肪基质干细胞可能具有更强的诱导分化作用。     

脂肪基质细胞体外分离培养及成软骨定向诱导

背景:组织工程技术是解决软骨等组织缺损的理想途径,但其种子细胞的来源问题仍未很好地解决.目的:观察脂肪基质细胞体外分离培养及其在体外向成软骨细胞诱导分化的能力.方法:取新两兰白兔皮下脂肪组织,以胶原酶等消化分离获得脂肪基质细胞,以成软骨诱导培养液对其进行成软骨诱导分化,倒置显微镜下观察脂肪基质细胞体外培养传代情况;免疫组织化学、阿尔辛蓝染色、天狼猩红染色等方法观察脂肪基质细胞成软骨诱导可行性;MTT法观察脂肪基质细胞与诱导培养的脂肪基质细胞体外增殖情况.结果与结论:脂肪基质细胞可于体外分离培养,在成软骨诱导后,可定向分化为软骨样细胞,其可分泌软骨细胞特有的Ⅱ型胶原及酸性黏多糖.原代培养的脂肪基质细胞呈长梭形,胞核椭圆,第3天进入指数增长期,群体倍增时间为55 h左右,细胞在第4天进入平台期,体外传代培养9代后,细胞开始出现衰老征象;成软骨诱导细胞增殖速度显著增快,随诱导培养时间的延长,细胞体积明显增大,形态由长梭形变为宽大、多伪足的多角形,胞核亦变大,核仁明显,培养第2天进入指数增长期,群体倍增时间为30 h左右,在第8天进入平台期,经体外传代培养15代后,细胞增殖速度减慢,开始出现衰老征象.提示脂肪基质细胞在一定条件下可定向分化为软骨细胞,可作为软骨组织工程种子细胞来源.     

脂肪干细胞在体外特定培养液中向软骨细胞表型的分化

目的:应用转化生长因子β1,体外诱导脂肪干细胞向成软骨细胞表型分化,探讨其作为组织工程化软骨种子细胞的可行性。方法:实验于2005-04/2006-06在华中科技大学同济医学院公卫实验室完成。①取大鼠腹股沟处脂肪,酶消化法分离、培养脂肪干细胞,体外传代培养。②取第3代细胞通过转化生长因子β1、地塞米松和维生素C诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化。③诱导后14d观察细胞形态变化,进行阿辛蓝染色检测软骨基质的分泌、免疫组织化学检测细胞Ⅱ型胶原的表达,采用Western-blot和反转录-聚合酶链反应检测诱导前后成软骨相关的Sox9,蛋白聚糖与Ⅱ型胶原的表达。结果:①细胞接种的最初几日,细胞呈圆形,1周后贴壁细胞呈长梭形,体积增大;14d后贴壁生长细胞基本长满单层,中心细胞排列紧密,形态与骨髓间充质干细胞相似。诱导培养后,细胞形态逐渐由梭型向多角形、多边形转变。诱导14d后多数细胞呈平坦的多边角形状细胞;其夹杂多角突起状或多角纺锤状细胞。②诱导后阿辛蓝染色示糖胺聚糖均匀分布于基质中。③免疫组织化学染色示基质中Ⅱ型胶原表达阳性。④反转录-聚合酶链反应检测成软骨相关的Sox9、蛋白聚糖、Ⅱ型胶原mRNA表达阳性。⑤Western-blot印迹检测细胞诱导后Ⅱ型胶原蛋白表达阳性。结论:脂肪干细胞在特定培养液的诱导下可向成软骨细胞表型分化,并能分泌软骨细胞特异性基质,有望成为软骨组织工程新的细胞来源。     

脂肪基质干细胞小肠黏膜下层双面复合的体外成软骨诱导

背景:使用体外构建的组织工程软骨治疗软骨损伤是目前的研究热点,料与支架材料的选择仍有较多问题尚待解决.目的:观察脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物在体外经成软骨诱导培养基诱导分化的效果.方法:将第3代脂肪基质干细胞接种于复水后的小肠黏膜下层双面,入成软骨诱导培养基,体外诱导培养7 d和14 d后,用实时荧光定量RT-PCR检测Ⅱ型胶原mRNA,疫组织化学染色检测Ⅱ型胶原蛋白,苯胺蓝染色观察细胞外基质,描电镜观察体外成软骨诱导14 d后细胞在支架材料上的生长状况.结果与结论:Ⅱ型胶原mRNA实时荧光定量RT-PCR检测提示,外成软骨诱导后7,4 d的脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物Ⅱ型胶原mRNA的标化值与未诱导的脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物差异有显著性意义(P < 0.05),导 14 d与诱导7 d相比,异亦有显著性意义(P < 0.05).脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物成软骨诱导后14 d,型胶原免疫组织化学染色为阳性,苯胺蓝染色可见基质异染,诱导的复合物Ⅱ型胶原免疫组织化学染色为阴性.扫描电镜检测显示诱导14 d时,胞长满支架材料的双面.提示脂肪基质干细胞复合至小肠黏膜下层后,体外经成软骨诱导培养基成软骨诱导后,够向成软骨细胞分化.     

脂肪基质干细胞小肠黏膜下层双面复合的体外成软骨诱导

背景：使用体外构建的组织工程软骨治疗软骨损伤是目前的研究热点,材料与支架材料的选择仍有较多问题尚待解决。目的：观察脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物在体外经成软骨诱导培养基诱导分化的效果。方法：将第3代脂肪基质干细胞接种于复水后的小肠黏膜下层双面,加入成软骨诱导培养基,于体外诱导培养7d和14d后,使用实时荧光定量RT-PCR检测Ⅱ型胶原mRNA,免疫组织化学染色检测Ⅱ型胶原蛋白,甲苯胺蓝染色观察细胞外基质,扫描电镜观察体外成软骨诱导14d后细胞在支架材料上的生长状况。结果与结论：Ⅱ型胶原mRNA实时荧光定量RT-PCR检测提示,体外成软骨诱导后7,14d的脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物Ⅱ型胶原mRNA的标化值与未诱导的脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物差异有显著性意义（P〈0.05）,诱导14d与诱导7d相比,差异亦有显著性意义（P〈0.05）。脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物成软骨诱导后14d,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色为阳性,甲苯胺蓝染色可见基质异染,未诱导的复合物Ⅱ型胶原免疫组织化学染色为阴性。扫描电镜检测显示诱导14d时,细胞长满支架材料的双面。提示脂肪基质干细胞复合至小肠黏膜下层后,在体外经成软骨诱导培养基成软骨诱导后,能够向成软骨细胞分化。     

低密度传代培养人脂肪基质细胞的体外增殖和表面抗原表达

目的：观察低密度传代培养对人脂肪基质细胞的形态、增殖能力和表面抗原表达的影响。 方法：实验于2004-05／2006—01在上海交通大学医学院附属第九人民医院整形外科和组织工程研究中心完成。①吸脂术获得脂肪组织，经胶原酶消化分离。（函培养脂肪基质细胞，原代细胞80％融合后分别以5000／cm^2和1000／cm^2的接种密度传代至第3代。③四唑盐比色法和流式细胞法检测比较不同密度传代培养对细胞形态、增殖能力及表面抗原表达的影响。 结果：①低密度传代培养的细胞形态相对均一、体积较小。②四唑盐比色法结果显示低密度传代细胞增殖活力与高密度传代培养组差异无显著性。③流式细胞学检测结果表明，低密度培养组表达CD105，CD166，Stro-1，Flk-1等干细胞相关表面抗原的细胞比例显著高于高密度培养组。 结论：低密度传代培养有利于脂肪基质细胞的体外增殖，并能显著提高细胞群体中干细胞的比例，有可能发展成为一种简便的脂肪干细胞纯化方法。     

低密度传代培养人脂肪基质细胞的体外增殖和表面抗原表达

目的:观察低密度传代培养对人脂肪基质细胞的形态、增殖能力和表面抗原表达的影响。方法:实验于2004-05/2006-01在上海交通大学医学院附属第九人民医院整形外科和组织工程研究中心完成。①吸脂术获得脂肪组织,经胶原酶消化分离。②培养脂肪基质细胞,原代细胞80%融合后分别以5000/cm2和1000/cm2的接种密度传代至第3代。③四唑盐比色法和流式细胞法检测比较不同密度传代培养对细胞形态、增殖能力及表面抗原表达的影响。结果:①低密度传代培养的细胞形态相对均一、体积较小。②四唑盐比色法结果显示低密度传代细胞增殖活力与高密度传代培养组差异无显著性。③流式细胞学检测结果表明,低密度培养组表达CD105,CD166,Stro-1,Flk-1等干细胞相关表面抗原的细胞比例显著高于高密度培养组。结论:低密度传代培养有利于脂肪基质细胞的体外增殖,并能显著提高细胞群体中干细胞的比例,有可能发展成为一种简便的脂肪干细胞纯化方法。     

体外分离培养人源性脂肪间充质干细胞及其鉴定

目的 体外分离培养人皮下脂肪来源的细胞群,依据国际标准规定通过形态观察、免疫表型检测及多种分化潜能的鉴定证实体外获得的细胞群为脂肪来源的间充质干细胞.方法 采用0.1％胶原酶Ⅰ及0.25％胰酶双消化法进行细胞的体外分离,LG-DMEM培养基加入体积分数为10％胎牛血清,于37℃、5％ CO2的饱和湿度条件下培养,待细胞生长至70％ ～ 80％融合时消化传代扩增.通过倒置显微镜观察细胞形态;流式细胞仪检测细胞免疫表型表达;取第3代细胞,于培养基中分别加入成骨及成脂诱导剂进行定向诱导分化,并对诱导后的细胞染色鉴定.结果 分离培养的细胞群呈长梭状,漩涡样贴壁生长;流式细胞仪检测P2代细胞,其中CD73,CD105,C90,CD44,CD29及CD49d呈阳性表达,而CD14,CD34,CD45,HLA-DR及CD106呈阴性表达;成骨诱导3周后,茜素红染色、VON-KOSSA染色及细胞碱性磷酸酶染色都呈阳性;成脂诱导2周后,细胞内有小脂滴出现,油红O染色呈阳性.结论 胶原酶胰酶双消化法从脂肪组织中分离获得的细胞可贴壁生长;流式细胞仪检测证实细胞表达与间充质干细胞相符的免疫表型;定向诱导后具有成骨及成脂分化能力;符合间充质干细胞的特性.