利用动物模型评价核黄素光化学法灭活红细胞病毒的效果

本研究旨在评估核黄素光化学法(核黄素终浓度为150μmol/L,光照时间为20分钟,光照强度为40 000Lux)灭活红细胞中病毒的有效性。将HCMV作为指示病毒加入红细胞中。30只BALA/c小鼠设为实验组(n=10)、病毒对照组(n=10)、可见光对照组(n=5)和红细胞对照组(n=5);实验组小鼠注射经核黄素光化学法灭活处理的红细胞;病毒对照组小鼠注射未经灭活处理的红细胞;可见光对照组小鼠注射经可见光照射的红细胞;红细胞对照组小鼠注射正常红细胞。取各组小鼠进行体外病毒分离,PCR检测HCMV UL83基因,间接免疫荧光鉴定PP65抗原。结果表明:病毒对照组和可见光对照组病毒分离、PCR及间接免疫荧光检测均为阳性,而实验组和红细胞对照组所有结果均为阴性。结论:核黄素光化学法灭活红细胞病毒是有效的。     

核黄素联合紫外线A照射对血浆中伪狂犬病毒的灭活效果

目的考察核黄素联合紫外线A对血浆中伪狂犬病毒的灭活效果。方法以伪狂犬病毒为模拟病毒,以Vero细胞为培养细胞,用病毒感染细胞,制备病毒增殖液;分别采用5、10、15及20J/cm2联合核黄素处理血浆,观察处理前后血浆病毒灭活的效果,筛选灭活病毒合适的紫外线剂量;将含有伪狂犬病毒血浆的样本分为实验组:采用上述筛选的紫外线强度照射联合核黄素处理;对照组1:单独采用紫外线A照射;对照组2:单独采用核黄素处理;阴性对照组:未采用紫外线照射和核黄素处理;分别在实验前后采用96孔细胞病变法,对照细胞病变效应,根据Reed-Muench公式计算病毒滴度。结果采用不同强度的紫外线联合核黄素处理血浆,紫外线强度为15及20J/cm2的灭活血浆病毒的效果明显,处理后病毒滴度分别下降4.55和4.39logs;实验组和对照组1病毒滴度分别下降4.55和4.28logs,有统计学意义(P<0.05);对照组2病毒滴度降低1.93logs,没有病毒灭活效果。结论核黄素联合紫外线可灭活血浆中伪狂犬病毒,单独紫外线照射也具有灭活血浆伪狂犬病毒的效果;而仅单独采用核黄素处理而未联合紫外线照射,对血浆中伪狂犬病毒灭活效果不明显。     

超高压(等静水压)灭活血浆病毒的研究

目的超高压技术作为一种有效的灭菌消毒的物理手段,对灭活血浆中模型病毒的条件及灭活效果探讨。方法取正常人血浆按10%的比例分别加入PRV、PRV、VSV、PV1、PPV等指示病毒混匀,放在超高压试验机的样品仓中,以不同的压力和不同的时间进行处理。用微量细胞病变法检测超高压处理前后各组样品的病毒滴度。结果 600 Mpa处理10 min、500 Mpa处理20 min、400 Mpa处理60 min、350 Mpa处理90 min可灭活PRV、PRV、VSV等3种脂包膜指示病毒达4 lgs以上。结论该方法能够有效灭活的病毒是HBV和HCV的指示病毒。符合"血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则"中病毒灭活工艺有效的要求。     

巴斯德法灭活血浆病毒的实验研究

目前临床输注血浆制品迫切需要解决的是病毒安全性问题 ,各种血浆蛋白制品可能传播病毒 ,生产各种血浆制品的原料血浆是大量多人份的混合血浆 ,其病毒危险性较高 ,解决该问题的方法之一即对原料血浆进行病毒灭活 ,从根本上杜绝患者因输注血浆蛋白制品而感染病毒。笔者应用巴斯德法对原料血浆进行病毒灭活 ,实验证明该法是行之有效的。材料与方法1　材料1.1　指示病毒及其宿主细胞 :以水泡性口炎病毒(VSVIndianna株 )和辛德比斯病毒 (Sindbis) (均由中国药品卫生制品鉴定所提供 )为模型病毒 ;分别用BHK细胞株和VERO细胞株为Sindbis、VS…     

噻唑橙光化学法对红细胞中病毒及细菌灭活作用的研究

目的探讨噻唑橙(TO)光化学法对红细胞中病毒及细菌灭活效果。方法以伪狂犬病毒(PRV)和辛德毕斯(Sindbis)病毒为指示病毒,分别加入红细胞比积为20%的红细胞悬液中,TO孵育1 h后做476 nm光照射处理;研究病毒灭活动力学特征;做TO浓度(C)、光照强度(I)、光照时间(T)三因素三水平正交试验确定最优灭活条件;最优条件下检测裸照、密闭血袋中、密闭血袋充氧后的病毒灭活效果;最优条件下检测血液污染常见细菌小肠结肠炎耶尔森氏菌、金黄色葡萄球菌及表皮葡萄球菌灭活效果。结果病毒灭活动力学研究显示:在60μmol/LTO、1.06E-01 w·m-2·nm-1光强条件下,照射5 min可将大部分PRV和Sindbis病毒灭活,20 min灭活作用达峰值,分别为5.88和5.12 LogTCID50;正交试验显示:裸照时PRV及Sindbis病毒灭活最优条件均为I=1.33E-01 w·m-2·nm-1,T=20 min,C=80μmol/L;在此条件下,可灭活红细胞中PRV≥6.13LogTCID50(裸照,n=4)、(4.75±0.62)LogTCID50(密闭血袋,n=4)、(6.06±0.16)LogTCID50(密闭血袋充氧,n=4);可灭活红细胞中Sindbis病毒(5.41±0.12)LogTCID50(裸照,n=4)、(3.72±0.77)LogTCID50(密闭血袋,n=4)、(5.76±0.25)LogTCID50(密闭血袋充氧,n=4)。在此条件下细菌灭活效果:小肠结肠炎耶尔森氏菌(5.91±0.13)Log10、金黄色葡萄球菌6.8Log10、表皮葡萄球菌6.0 Log10。结论 TO光化学法可有效灭活红细胞中病毒,有氧情况下(裸照或充氧)病毒灭活效果好于密闭无氧。TO光化学法可有效灭活红细胞中细菌。     

病毒灭活血浆亚甲蓝含量的检测及质量控制

<正>目前亚甲蓝光化学照射技术(methylene blue plus light,MBP)照射血浆以灭活病毒,已在采供血机构广泛应用。资料表明血浆病毒滴度降低程度与所用亚甲蓝浓度有直接关系,但进入人体的亚甲蓝过多,会对机体产生毒性作用,且血     

运用FQ-PCR技术监测亚甲蓝光化学法对血浆乙型肝炎病毒的灭活效果

目的通过荧光定量PCR(fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)技术对血浆病毒灭活前后乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)浓度进行测定,判断亚甲蓝(MB)光化学法灭活乙型肝炎病毒的效果,为临床判断病毒灭活效果提供直接和客观依据。方法用4份已证实为HBV-DNA阳性的血浆,经可见光(>3000LUX)照射不同时间(0、5、10、15、30min)后,用FQ-PCR分别测定这些血浆的HBV-DNA浓度,并与未用MB处理的血浆作比较,判断随照射时间不同,HBV被灭活的效果。结果4份HBV-DNA阳性患者的血浆未经处理时,其病毒核酸浓度分别为5.6×107、3.2×106、1.8×106和3.5×105拷贝/ml,加入MB未经照射时HBV-DNA浓度即明显下降(P<0.05),可见光照射5min后HBV-DNA浓度分别下降为未经任何处理时的浓度的15.89%、11.56%、4.39%和1.23%。随照射时间的延长,病毒核酸浓度逐渐下降,照射30min后,HBV-DNA浓度均下降为零。结论用MB加光照30min处理,可达到将血浆乙肝病毒灭活的效果。     

亚甲蓝光化学法灭活寨卡病毒的研究

目的探讨亚甲蓝光化学反应对血浆中寨卡病毒的灭活效果。方法血浆中加入寨卡病毒后,使用一次性病毒灭活输血过滤器材在病毒灭活照射仪内进行亚甲蓝光化学法病毒灭活(亚甲蓝浓度为1μM、照射强度为35 000 Lx、灭活时间为30 min)。分别在灭活处理前以及灭活处理的第5、15、30 min留样。所取样品用免疫荧光法检测病毒滴度,并用RT-qPCR检测病毒RNA载量。结果灭活前,血浆中寨卡病毒的滴度和核酸载量分别为(5.55±0.18)log TCID_(50)/0.1mL和(9.08±0.75)log copies/mL。灭活后以及经过Vero细胞连续3代培养后,均未检测到病毒感染性,滴度下降(5.05±0.19)log TCID_(50)/0.1mL。病毒RNA载量在灭活后仍有(8.07±0.68)log copies/mL,传代培养从第1代到3代,都没有检测到病毒RNA。结论亚甲蓝光化学法能有效灭活血浆中的寨卡病毒。     

病毒灭活血浆制备流程的建立及其对血浆质量的影响

目的探讨病毒灭活过程对血浆质量的影响;建立病毒灭活血浆的工艺流程。方法分5次共制备200 ml病毒灭活血浆34袋,血浆容量和外观检测34袋,凝血因子效价检测15对样本,并对病毒灭活柜性能进行了控制和监测。结果经病毒灭活处理后血浆回收率为(91.8±1.4)%,与灭活前相比差异有统计学意义(P<0.01,t=4.85);凝血因子回收率为(78.84±6.04)%,有9份样本凝血因子效价低于0.7 IU/ml;病毒灭活柜性能稳定。结论建立了优化的工艺流程,临床应用效果安全可靠。     

FFP经亚甲蓝光化学法灭活病毒并直接冻干于血袋的冻干血浆研制

目的探索制备冻干血浆的新工艺,研制适合在艰苦环境下储运和方便使用的新型冻干血浆。方法采用亚甲蓝光化学技术对新鲜冰冻血浆(FFP)做病毒灭活处理,再将FFP直接冻干于血袋中,观察不同条件下的保存效果。结果亚甲蓝光化学技术(终浓度为1μmol/L)能有效灭活血浆中的Sindbis病毒、PRV和VSV等指示病毒,处理30min后灭活效果>4.75LgTCID50,经细胞3代盲传证明灭活病毒效果可靠。新型冻干血浆外观成淡黄色疏松体,残水量为2.2%—2.5%,室温下<2min完全溶解;储存稳定性试验表明,新型冻干血浆中的FⅡ、FⅤ、FⅧ、FⅨ和FⅪ在25℃和4℃比较稳定,高温(40℃)保存对其活性有一定影响。结论采用亚甲蓝光化学灭活病毒技术和袋装血浆冻干技术制备新型冻干血浆是可行的。     

亚甲蓝光化学灭活对血浆丙型肝炎病毒基因组核酸降解的研究

目的研究丙型肝炎病毒(HCV)基因组核酸在亚甲蓝光化学法(methelene blue photochemistry,MB-P)灭活病毒前后的变化,在全基因组水平分析MB-P对基因组各结构区段的降解作用。方法含HCV的血浆中加入终浓度为1.0μmol/L的MB,经约30000Lux强度的荧光照射后,在不同作用时间点取样;将HCV全基因组序列分为互相重叠的8个区段,分别进行RT-PCR,分析基因组核酸的完整性;同时运用实时定量PCR(real time-PCR,RT-PCR)技术观察核酸降解的动力学变化。结果基因组各区段RT-PCR结果发现,经过不同的光照时间,HCV基因组各区段的稳定性不同,第2、4、5、6区段对MB-P作用较敏感,基因组5’端区段和3’端区段经MB-P作用后的稳定性高于基因组其它区段;RT-PCR结果显示,随着光照时间延长,可被检测到的病毒核酸拷贝数逐渐下降。结论MB-P灭活过程中HCV基因组核酸被降解,而且基因组不同区段对光化学作用的反应性不同,提示RNA降解可能是病毒灭活的重要机制;检测病毒核酸稳定性以监测病毒灭活具有一定临床实用价值。     

Efficacy of leucocyte-poor red blood cell suspensions prepared by sedimentation in hydroxyethyl starch

Hydroxyethyl starch (HES), which is licensed for human use as a plasma volume expander, has red blood cell sedimenting properties similar to high molecular weight dextran (HMWD). The present studies document the effectiveness of commercially available HES in preparing leukocyte-poor red blood cell suspensions (L-PRBCs) from donor whole blood and packed red blood cells stored in CPD up to 120 hours prior to processing. The effect of HES sedimentation on final white blood cell count, on erythrocyte p50 and 2,3-DPG concentration, and on short- and long-term in vivo survival of 72-hour stored donor red cells are described, along with favorable clinical experience with over 300 transfusions of HES- sedimented L-PRBCs. Since the method requires no special equipment, it is immediately available for widespread use.     

不同抗凝剂对红细胞渗透脆性试验结果的影响

目的了解EDTA—K2、枸橼酸钠、肝素锂抗凝血对红细胞渗透脆性试验结果的影响。方法对40份分别用EDTA-K2、枸橼酸钠、肝素锂抗凝的血标本进行红细胞渗透脆性试验;剩余血液用0．9％NaCl洗涤3次后配成50％红细胞悬液再进行试验;同时进行不加抗凝剂的对照试验。结果EDTA—K2抗凝血标本及洗涤后的渗透脆性均明显高于对照组,枸橼酸钠、肝素锂抗凝血标本对渗透脆性有一定影响,经洗涤后与对照组没有明显的差别。结论可以用枸橼酸钠或肝素锂抗凝血标本经洗涤后进行红细胞渗透脆性试验,不能用EDTA—K2抗凝的标本。     

1年保存期内病毒灭活新鲜血浆中凝血因子的质量调查

目的 探讨亚甲蓝光化学法(MB-P)灭活处理新鲜血浆后对1年保存期内部分凝血因子活性的影响.方法 随机抽取30(人)份全血(400 ml/份),按照标准操作规程将每份制备成新鲜血浆和病毒灭活新鲜血浆(100ml/份),分成未灭活组和灭活组,分别检测保存0(制备期＜1个月检测)、6、8、10、12个月后的2组各自的FⅡ∶C、FⅤ:C、FⅦ∶C、FⅧ∶C、FⅨ∶C、FⅩ:C及Fg含量变化.结果 与未灭活组相比,灭活组除FⅦ∶C含量无明显变化外,其他6种凝血因子含量在保存期内均明显下降(尤其FⅧ∶C和Fg下降最为明显);0、6、8、10、12个月保存时间的FⅧ∶C含量(％)分别为灭活前58.7±20.1、59.6±34.0、52.0±35.3、57.5±34.7、54.1±31.2和灭活后45.8±13.9、49.3±23.5、44.6±21.7、49.7±22.9、43.9±20.7(均为P＜0.05),Fg含量(mg/dl)分别为灭活前225.3±72.3、277.9±64.2、272.3±74.9、262.6±70.8、287.55±83.0)和灭活后188.8±54.7、205.8±54.0、205.8±54.0、220.2±66.7、202.2±56.8(均为P＜0.05).保存0和12个月相比,FⅩ:C含量(％)分别为93.0±30.5 vs 83.1±18.0(P ＜0.05).结论 新鲜血浆经MB-P病毒灭活处理后,1年冰冻保存期内起7种凝血因子含量相对稳定;MBP对凝血因子活性造成了一定损伤(尤其是Fg和FⅧ:C),但除FⅧ∶C外,其他凝血因子含量在可接受的范围内.     

基于核酸序列的扩增技术在异基因外周血干细胞移植后受者HCMV感染诊断的应用

本研究探讨基于核酸序列的扩增技术（nucleic acid sequence based amplification, NASBA）检测mRNA对异基因外周血干细胞移植受者术后人类巨细胞病毒（HCMV）感染的诊断价值，并评价该技术对抗病毒治疗的指导意义。以128例移植术后患者为研究对象，采集移植术后外周血352份；利用NASBA检测外周血中HCMV基质外壳蛋白PP67（UL65）mRNA，并与HCMV DNA的结果进行比较。结果表明：352份血标本中，HCMVmRNA阳性105份（29．83％），HCMV DNA阳性183份（51．99％）。128例患者术后有45例发展为HCMV病，HCMV DNA和HCMV mRNA检测诊断HCMV病的敏感性和特异性分别为95.56％（43／45）、93.33％（42／45）和60．24％（50／83）、97．59％（81／83）。两者特异性的比较差异具有显著性（P〈0、05）。结论：HCMV-PP67的NASBA检测方法具有快速、敏感性高和特异性强等优点，可作为快速检测HCMV病的方法用于临床。该法检测结果与移植受者的临床症状相关。故也可用作监视异基因造血干细胞移植受者术后HCMV感染和指导抗病毒治疗的依据。     

Inactivation of viruses in blood with aluminum phthalocyanine derivatives

The inactivation of viruses added to whole blood and a red cell concentrate with aluminum phthalocyanine and its sulfonated derivatives was studied. A cell-free form of vesicular stomatitis virus (VSV), used as a model, was completely inactivated (greater than 10(4) infectious units; TCID50) on treatment of whole blood with 10 microM (10 mumol/L) aluminum phthalocyanine chloride (AIPs) and visible light dosage of 88 to 176 J per cm2. At 44 J per cm2, complete VSV inactivation was achieved on raising the concentration of AIPc to 25 microM (25 mumol/L). Results at least as good were achieved on similar treatment of a red cell concentrate. Also inactivated were a cell-associated form of VSV and both cell-free and cell-associated forms of human immunodeficiency virus; encephalomyocarditis virus, used as a model for non-lipid-enveloped viruses, was not inactivated by this procedure. This inactivation of cell-free VSV suggests that a similar degree of inactivation could be achieved with a lower concentration of the sulfonated forms of aluminum phthalocyanine. Throughout the above studies, red cell integrity was well maintained, as judged by the absence of hemoglobin release (less than or equal to 2%) during the course of treatment or on subsequent storage. Red cell osmotic fragility was decreased on treatment of whole blood with AIPc. This study indicates that AIPc may be a promising method for the inactivation of viruses in cellular blood products.     

病毒灭活新鲜血浆在不同时间段质量分析

目的分析亚甲蓝光化学法(MB-P)灭活处理新鲜血浆(简称病毒灭活新鲜血浆)与未经灭活处理的新鲜血浆(简称新鲜血浆)在保存期内不同时间段有效成分的变化,为临床输注提供参考依据。方法取20人份全血(每份400mL),按照标准操作规程制备成新鲜血浆(每份200mL)后,将其一分为二,制备病毒灭活新鲜血浆和新鲜血浆,两种血浆每份无菌分装为5等份,立即放入速冻冰箱速冻,在0(制备后小于72h)、3、6、9、12个月分别检测Ⅴ因子、Ⅷ因子、纤维蛋白原(Fib)、亚甲蓝残留量、总蛋白、pH值、K~+、Na~+、Cl~-水平。结果两种血浆随着保存期的延长,Ⅴ因子、Ⅷ因子、Fib、总蛋白、K~+、Na~+、Cl~-水平呈下降趋势,pH值呈上升趋势,差异有统计学意义(P0.05)。结论经过病毒灭活过程对血浆Ⅴ因子、Ⅷ因子、Fib、总蛋白、pH值、K~+、Na~+、Cl~-水平均有所影响,但能够达到国家规定的临床用血标准,采用病毒灭活可以在保留血浆基本成分的情况下提高临床用血的安全性。     

儿童抽动-秽语综合征HCMV pp65抗原检测的临床意义

目的探讨儿童巨细胞病毒(Hum an cytom egalov irus,HCMV)活动性感染与抽动-秽语综合征(T ourette’s sym-drom e,TS)的关系。方法离心分离64例抽动-秽语综合征患儿和40例正常儿童外周血单个核细胞(PBM C s)和血浆,分别用免疫荧光法和定量PCR检测HCMV pp65抗原和HCMV DNA,并比较2种方法的一致性。结果64例TS患儿HCMV pp65抗原有14例阳性,阳性率21.9%,40例正常儿童HCMV pp65抗原有1例阳性,阳性率2.5%,2组儿童HCMV感染率有显著性差异(2χ=7.49,P<0.01)。免疫荧光法和实时定量PCR有较好的一致性(89.1%)。结论抽动-秽语综合征儿童HCMV感染率显著高于正常儿童,HCMV活动性感染可能诱发抽动-秽语综合征。     

Differential sensitivities of viruses in red cell suspensions to methylene blue photosensitization

Background : Previous studies explored the feasibility of using the photosensitizer methylene blue (MB) as a virucidal agent in red cell suspensions. Under treatment conditions (5 μM [5 μmol/L] MB, 3.4 × 10(4) J/m²) that resulted in more than 6 log₁₀ inactivation of vesicular stomatitis virus (VSV) or of the enveloped bacteriophage φ6, red cell membrane alterations were observed. Increased red cell ion permeability and the binding of plasma proteins to the red cell surface were the most sensitive indicators, which varied in a dose-dependent fashion. Study Design and Methods : Inactivation of three additional extracellular viruses and intracellular human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) was assessed after MB phototreatment of red cell suspensions. Potassium leakage and IgG binding also were characterized in MB-treated red cell suspensions that were exposed to low-fluence light (6 × 10³ J/m²). Results : Different viruses exhibit a wide range of sensitivities to MB photoinactivation. For example, phototreatment conditions (5 μM [5 μmol/L] MB, 3.4 × 10⁴ J/m²) that inactivated more than 6 log₁₀ of VSV did not inactivate the nonenveloped picornavirus, encephalomyocarditis virus. In contrast, lower fluences (6 × 10³ J/m²) inactivated approximately 5 log₁₀ or more of Sindbis virus and approximately 4log₁₀ of extracellular HIV-1. These less stringent phototreatment conditions (5 μM [5 μmol/L] 6 × 10³ J/m²) caused lower rates of red cell potassium leakage (reduction by 6- fold) and little or no binding of plasma proteins to the red cell surface, compared to values observed previously with higher fluences. However, neither 6 × 10³ nor 4.1 × 10⁴ J per m² fluences resulted in any inactivation of intracellular HIV as represented by changes in the amount of p24 antigen produced during co-culture of actively infected H9 cells. Conclusion : MB-based protocols would require the use of high-efficiency (> 6log₁₀) white cell-reduction filters or additional inactivation steps to deplete or inactivate intracellular virus.