超声造影剂Levovist介导质粒GFP转染小鼠骨骼肌细胞的实验研究

目的探讨空气型微泡造影剂Levovist介导基因转染小鼠骨骼肌细胞的作用。方法采用质粒GFP作为目的基因，超声(1MHz脉冲波，20％工作周期，空间时间峰值强度1W／cm^2)结合Levovist作用于小鼠H2K成肌细胞，照射时间分别为10s、20s、30s、40s、50S、60s，流式细胞仪测定GFP阳性细胞率，台盼蓝染色测定细胞生存率。超声结合Levovist作用于小鼠胫前肌，1周后处死小鼠，荧光显微镜测定GFP阳性肌纤维数，HE染色估计肌肉破坏面积。结果超声单独作用于H2K细胞显示出较佳的增强GFP基因表达的作用，加入微泡造影剂Levovist后，细胞死亡率显著增加，GFP基因表达水平降低；动物实验显示，Levovist结合或不结合超声均无增强GFP基因表达水平作用，但会增加肌肉损伤面积。结论本实验条件下，Levovist无增强骨骼肌细胞基因表达作用，却加重细胞损伤。     

超声造影剂SonoVue介导质粒绿色荧光蛋白转染小鼠骨骼肌细胞的实验研究

目的 探讨微泡造影剂SonoVue介导基因转染小鼠骨骼肌细胞的作用。方法 采用质粒绿色荧光蛋白（GFP）作为目的基因，超声结合SonoVue作用于小鼠H2K成肌细胞，照射时间分别为10s、20s、30s、40s、50s、60s，流式细胞仪测定GFP阳性细胞率，台盼蓝染色测定细胞生存率。SonoVue结合或不结合超声作用于小鼠胫前肌，1周后处死小鼠，荧光显微镜测定GFP阳性肌纤维数，HE染色估计肌肉破坏面积。结果 加入SonoVue后，GFP阳性细胞率与细胞生存率总体显著低于阳性对照组；动物实验显示，SonoVue结合或不结合超声均显著增强GFP基因表达水平作用。结论 体外细胞培养SonoVue无增强GFP基因转染的作用，却增加细胞损伤；活体小鼠实验显示SonoVue具有良好的增强骨骼肌细胞基因表达作用。     

超声造影剂Optison介导质粒GFP转染小鼠骨骼肌细胞的实验研究

目的 探讨微泡造影剂Optison介导基因转染小鼠骨骼肌细胞的作用.方法 采用质粒GFP作为目的基因,超声(1 MHz脉冲波,20%工作周期,空间时间峰值强度1 W/cm2)结合Optison作用于小鼠体外H2K成肌细胞,照射时间分别为10、20、30、40、50及60 s,流式细胞仪测定GFP阳性细胞率,台盼蓝染色测定细胞生存率.超声结合Optison作用于小鼠胫前肌,1周后处死小鼠,荧光显微镜检测GFP阳性肌纤维数,HE染色后计算肌肉损伤面积.结果 活体外细胞实验结果显示,与阳性对照组相比,Optison结合超声作用于H2K细胞10、20及30 s时,显著增强GFP基因表达水平(P＜0.01),但于40、50及60 s时基因表达水平显著降低(P＜0.01),细胞死亡率总体显著增加(P＜0.01).动物实验结果显示,Optison单独或结合超声均显著增强GFP基因表达水平,且Optison单独作用显著减少肌肉损伤面积.结论 Optison可显著增强活体小鼠骨骼肌细胞基因表达水平,同时具有肌肉保护作用.     

不同超声强度及微泡对基因和组织作用的实验研究

目的探讨不同强度超声破坏微泡对绿色荧光蛋白质粒(green fluorcscent protein，GFP)和小鼠骨骼肌组织的作用。方法分别用0．5w／cm^2、1．0w／cm^2、2．5w／cm^2的超声作用于基因及基因和微泡的混合物2min，琼脂糖凝胶电泳观察质粒基因的电泳图谱变化。并将昆明小白鼠16只分为4组，尾静脉输入白蛋白微泡，同时分别用(0．5w／cm^2、1．0W／cm^2、2．0W／cm^2、2．5w／cm^2的超声作用于小鼠骨骼肌2min．取局部组织HE染色观察超声破坏微泡后组织显微结构的变化。结果不同能量的超声和微泡作用后GFP质粒的电泳图谱结果无变化。0．5w／cm^2超声破坏微泡后无血管充血及红细胞渗出；1．0W／cm^2超声破坏微泡后可引起约30％血管充血，极少量红细胞渗出；2．0W／cm^2超声破坏微泡后可引起约60％血管充血，红细胞渗出较明显；2．5W／cm^2的超声破坏微泡后可使部分骨骼肌变性。结论用1．0W／cm^2和2．0W／cm^2超声作用2min后引起血管充血，红细胞渗出；2．5W／cm^2超声作用2min破坏微泡后可损伤组织。1．0～2．0W／cm^2超声强度破坏微泡后对GFP质粒无明显的损害。     

超声和微泡造影剂介导细胞基因转染的实验研究

目的 探讨低频超声对细胞基因转染的作用。方法 超声治疗仪频率1MHz，脉冲重复频率100Hz，占空系数20％。质粒DNA为含编码绿荧光蛋白的pEGFP。应用荧光显微镜和流式细胞仪评价细胞基因转染率，台盼蓝染色计算细胞成活率。选用C2C12、3T3-MDEI和CHO3种细胞系为研究对象，加入DNA后辐照不同声强、时间或加入超声造影剂，观察各条件下的细胞基因转染率和成活率。结果 ①超声介导的基因转染与声强和辐射时间有关，最佳剂量为1w／cm^2 20s；②同样超声剂量，较高的声强较早达到最大基因转染率；③较低剂量时，微泡造影剂可使超声介导的基因转染提高2～3倍并可显著提高最高基因转染率。结论 低频超声可介导细胞基因转染，基因转染率不但与超声辐射剂量有关，而且同样剂量时，高声强较早达到最大基因转染率，最佳剂量是1w／cm^2 20s。同时，微泡造影剂可提高超声介导基因转染的最高转染率。     

超声微泡介导体外转染hAng-1基因最佳条件的初步探讨

目的 探讨SonoVue微泡携带人血管生成素-1(hAng-1)基因在体外转染时超声照射强度、微泡浓度、DNA浓度等对转染效率和细胞活性的影响,以确定最佳转染条件.方法 将连接有eGFP-C_3-hAng-1质粒的SonoVue微泡以不同方式与293 T细胞混合,在超声照射下进行基因转染.分别检测不同超声照射强度、照射时间、不同微泡浓度和DNA浓度下的基因转染效率和细胞存活率.结果 随着超声照射强度、照射时间、微泡浓度和DNA浓度的增加,基因转染效率显著增加,细胞存活率在90%以上;当照射强度达到1.5 W/cm~2以上,照射时间超过30 s,微泡浓度和DNA浓度分别达到20%和15 mg/L后hAng-1基因的转染效率不再显著升高,而细胞存活率显著下降(P<0.01).结论 SonoVue微泡体外转染hAng-1基因的最佳条件为以细胞贴壁方式混合载基因微泡.照射强度1.5 W/cm~2,照射时间30 s,微泡浓度和DNA浓度分别为20%和15 mg/L.     

纳米微泡介导GFP转染小鼠骨骼肌细胞的实验研究

目的 探讨两种纳米微泡(白蛋白外膜和磷脂外膜)增强基因转染小鼠骨骼肌的作用.方法 以正常C57B10小鼠胫前肌为研究对象,目的基因GFP与微泡混合注入小鼠胫前肌,一侧胫前肌经超声(1MHz脉冲波,脉冲重复频率为100 Hz,20％工作周期,空间峰值时间峰值声强为2 W/cm2,辐照作用时间30 s),另一侧胫前肌不经超声辐照.观察白蛋白纳米微泡及磷脂纳米微泡增强骨骼肌细胞GFP转染水平的作用.1周后处死小鼠,荧光显微镜观察发出绿色荧光者为GFP阳性肌纤维细胞,计数最大GFP阳性肌纤维细胞数,作为GFP基因转染效率指标.结果 ①白蛋白纳米微泡组和白蛋白纳米微泡+超声组最大GFP阳性肌纤维数显著高于阴性对照组(P＜0.05),显著低于阳性对照组(P＜0.05).②磷脂纳米微泡组与阴性对照组及阳性对照组比较,最大GFP阳性肌纤维数差异均无统计学意义(P＞0.05).磷脂纳米微泡+超声组最大GFP阳性肌纤维数较阴性对照组显著增高(P＜0.05);磷脂纳米微泡+超声组与阳性对照组最大GFP阳性肌纤维数差异无统计学意义(P＞0.05).结论 纳米微泡可增强基因转染骨骼肌细胞效率,白蛋白含氟化气体纳米微泡具有发展潜力.     

超声微泡介导绿色荧光蛋白基因在视网膜神经节细胞表达的实验研究

目的探讨超声微泡介导绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因在视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)中的转染效率、优化转染的条件及毒性。方法体外培养RGCs,以GFP基因为报告基因,微泡造影剂(声诺维)为载体,用超声辐照介导质粒pEGFP-N1转染RGCs。实验组为质粒组、微泡+质粒组、超声+质粒组、超声+微泡+质粒组,超声+微泡+质粒组根据转染条件不同分成亚组;对照组为空白对照。荧光显微镜和流式细胞仪测定GFP的表达,MTT法检测RGCs的活性。结果与超声+质粒组相比,超声+微泡+质粒组RGCs转染率增加约5倍。优化转染条件后,频率300kHz,声强1.25W/cm2,连续波,辐照时间60s,微泡浓度45μg/ml,质粒浓度50μg/ml时,24孔板培养的RGCs转染率为(26.87±3.12)%。毒性实验证明超声微泡在该条件下进行基因转染对RGCs无毒副作用。结论在一定条件下,超声破裂微泡能增强基因的转染与表达,有望成为一种安全、有效的基因载体。     

超声辐照和SonoVue微泡在介导hAng-1基因体外转染时的作用和量效关系探讨

目的 探讨超声辐照和SonoVue微泡分别使用和联用在介导hAng-1基因体外转染过程中的作用以及辐照强度和微泡浓度对转染效率和细胞活性的影响.方法 实验分四组A组:单纯超声辐照+质粒组;B组:微泡+质粒组;C组:超声辐照+微泡+质粒组和空白对照组D组. C组内转染参数分别设置为超声照射强度0.5、1.0 、1.5和2.0 W/cm~2,微泡浓度5%、10%、20%、30%和40%.将连接有eGFP-C_3-hAng-1质粒的SonoVue微泡对293T细胞进行转染,48 h后检测各组基因转染效率和细胞存活率. 结果转染48 h后C组转染效率最高,荧光阳性细胞数最多,强度最大;A组转染效率很低,见少量荧光表达;B、D组无明显基因转染发生.随着超声照射强度和微泡浓度的增加,基因转染效率会逐步升高,具有统计学意义.微泡浓度大于20%、超声照射强度超过1.5 W/cm~2后基因转染效率不再升高甚至降低,细胞死亡率显著增高(P<0.01).结论 SonoVue微泡介导外源基因转染必须联合超声辐照才能获得较好的转染效率.对于hAng-1基因和SonoVue微泡,选择声强1.5 W/cm~2,微泡浓度20%是相对最佳转染条件.     

超声联合脂氟显微泡转染HepG2细胞的参数优化

目的 探索治疗性超声联合脂氟显微泡对人肝癌细胞HepG2基因转染的可行性及其实现高效率转染的优化参数.方法 HepG2细胞交叉间隔接种于24孔板,用治疗性超声辐照含脂氟显微泡和EGFP质粒的各组细胞.分组:超声强度梯度组(A组),A1～A5亚组,分别为0.4 W/cm2、0.8 W/cm2、1.2 W/cm2、1.6 W/cm2和2.0 W/cm2;占空比梯度组(B组),B1～B3亚组,分别为10％、20％和50％;时间组(C组),C1～C3亚组,分别为30 s、90s、180 s.24 h后用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况,流式细胞仪检测基因转染率,台盼蓝染色检测细胞死亡率.结果 不同超声强度、占空比和时间下,质粒转染效率各不相同.在一定范围内,分别增加超声强度、占空比和时间均可以提高转染效率.对于超声强度和占空比,当设置过高(声强＞1.6 W/cm2或占空比＞50％)时,由于细胞死亡率增加导致实际转染效率下降.超声强度为1.2 W/cm2时,转染率和死亡率优于A组其余各亚组;占空比为20％时,转染率和死亡率优于B组其余各亚组.当超过90s后继续增加时间,对于转染率和细胞死亡率的影响无明显统计学意义(P＞0.05).结论 超声辐照微泡是一种介导基因体外转染的有效方法,不同参数下转染率差别较大,优化参数有利于促进基因转染.     

Optimisation of ultrasound-mediated gene transfer (sonoporation) in skeletal muscle cells

Ultrasound (US) is a promising tool for facilitating direct gene transfer to skeletal muscle, but no systematic optimisation study has been performed. We exposed H2K myoblast cells to US with varying intensity of exposure and duration to evaluate its effect on cell viability and transfection efficiency using as endpoints transfection rate, average fluorescence intensity (fluorescence normalised by the number of transfected cells) and overall expression (the product of transfection rate and average fluorescence intensity) as indices. Cell viability decreased with exposure time and intensity, consistent with previous findings. Optimal setting of US was observed at the range of 0.5 to 1 W cm(-2) with duration of 20 s, producing maximum efficiency (transfection = 4.5%) in gene transfection with minimum cell toxicity (cell viability = 83%). Higher intensity alone or in combination with low intensity and long duration did not improve cell viability and transfection. The increase of eGFP (enhanced green fluorescence protein) plasmid concentration up to 200 microg per mL was related to an increase in average fluorescence intensity and overall expression. However, transfection rate saturated when DNA concentration reached 50 microg per mL despite initial increase with DNA concentration. The average fluorescence intensity was linearly proportional to the logarithm of DNA concentration, suggesting a diffusion-based model for DNA uptake under sonoporation. We conclude that low-intensity US irradiation provides a safe and effective alternative for gene delivery.     

超声介导SonoVue微泡破裂对hAng-1基因完整性和表达效率的影响

目的 探讨超声联合SonoVue微泡介导hAng-1基因转染293T细胞的转染效率及基因完整性和表达状况.方法 构建eGFP-C3-hAn-1质粒,根据不同实验组的设计,应用相应的微泡联合超声辐照条件进行293T细胞的eGFP-C3-hAng-1基因转染,转染后48 h,以荧光显微镜观察到绿色荧光为转染成功标志;流式细胞术检测基因转染阳性细胞率,台盼蓝染色检测细胞生存率;RT-PCR和Western blot技术检测hAng-1基因的mRNA和蛋白表达;琼脂糖凝胶电泳检测经超声辐射后质粒的完整性.结果 ①微泡浓度为20%,DNA浓度为15 mg/L时进行基因转染可获较好转染效率和细胞生存率;②转染体系中血清的存在并不影响转染效率和细胞生存率;③最适转染条件下的超声辐照剂量不会影响DNA的完整性,且转染后的基因可正常表达mRNA并翻译目的蛋白.结论 微泡联合超声辐照能够介导体外细胞治疗性基因的转染,血清的存在并不影响基因的转染,转染后的基因能顺利地表达并具有正常功能.     

共聚物P85和微泡造影剂对小鼠骨骼肌超声介导基因转染的影响

目的 探讨共聚物P85、微泡造影剂和超声在质粒DNA对小鼠骨骼肌基因转染中的影响.方法 应用共聚物P85、微泡造影剂Optison与DNA混合后直接小鼠胫前肌(TA)注射,并辐照超声.1周后取出胫前肌并快速冰冻切片,荧光显微镜计数表达GFP转染的肌纤维数,HE染色评价肌肉损伤情况.结果 共聚物P85和微泡造影剂Optison均可促进质粒DNA的基因转染(P<0.01,P<0.05).辐照超声可使P85介导的基因转染效率显著提高(P<0.01),但对微泡造影剂介导的基因转染却无显著提高(P>0.05),并且P85所介导的基因转染效率高于微泡造影剂介导的基因转染效率(P<0.01).微泡造影剂和P85耦合并辐照超声可使质粒的基因转染效率显著提高,与所有各组的差异有统计学意义(P<0.01).同时辐照超声显著增加含微泡造影剂组骨骼肌的损伤面积(P<0.01).结论 共聚物P85和微泡造影剂可介导质粒DNA的基因转染,辐照超声对其有促进作用,三者联合应用具有协同作用.     

治疗性超声介导体外基因转染的参数优化

目的 探讨不同治疗性超声(TUS)参数对基因转染的作用,优化TUS参数以实现高效率的转染,减少对细胞活力和质粒完整性的影响.方法 将质粒和SonoVue微泡加入培养的Hela细胞后行超声辐照,改变超声强度、占空比以及辐照时间等参数,比较不同的TUS辐照策略对细胞活力及红色荧光蛋白(DsRed)表达效率的影响,以确定最佳辐照参数,并对质粒完整性进行分析.结果 低超声强度(0.4 W/cm2、1.0 W/cm2)、低占空比(10%和20%)时,细胞存活率较高(>80%),辐照1 min和3min之间的细胞活力差异不明显(P>0.05).当增加超声强度(1.6 W/cm2、2.2 W/cm2)和占空比(50%)时,细胞活力显著下降(P<0.05).当20%占空比,1.0 W/cm2的TUS辐照3min时,可实现最高的转染率.质粒DNA结构的完整性不受优化的TUS参数影响.结论 TUS是一种有效的基因输送方法 ,优化的参数在无显著细胞死亡和DNA损伤的前提下增加转染,这种非侵袭性的基因转染方法 可能是临床基因疗法的一种有用工具.     

Development of safe and efficient novel nonviral gene transfer using ultrasound: enhancement of transfection efficiency of naked plasmid DNA in skeletal muscle

Although clinical trials of stimulation of angiogenesis by transfection of angiogenic growth factors using naked plasmid DNA or adenoviral vector have been successful, there are still unresolved problems for human gene therapy such as low transfection efficiency and safety. From this viewpoint, it is necessary to develop safe and efficient novel nonviral gene transfer methods. As therapeutic ultrasound induces cell membrane permeabilization, ultrasound irradiation might increase the transfection efficiency of naked plasmid DNA into skeletal muscle. Thus, we examined the transfection efficiency of naked plasmid DNA using ultrasound irradiation with echo contrast microbubble (Optison) in vitro and in vivo experiments. First, we examined the feasibility of ultrasound-mediated transfection of naked plasmid DNA into skeletal muscle cells. Luciferase plasmid mixed with or without Optison was transfected into cultured human skeletal muscle cells using ultrasound (1 MHz; 0.4 W(2)) for 30 s. Interestingly, luciferase activity was markedly increased in cells treated with Optison, while little luciferase activity could be detected without Optison (P < 0.01). Electron microscopy demonstrated the transient formation of holes (less than 5 microM) in the cell surface, which could possibly explain the rapid migration of the transgene into the cells. Next, we studied the in vivo transfection efficiency of naked plasmid DNA using ultrasound with Optison into skeletal muscle. Two days after transfection, luciferase activity in skeletal muscle transfected with Optison using ultrasound was significantly increased about 10-fold as compared with plasmid alone. Successful transfection was also confirmed by beta-galactosidase staining. Finally, we examined the feasibility of therapeutic angiogenesis using naked hepatocyte growth factor (HGF) plasmid in a rabbit ischemia model using the ultrasound-Optison method. Five weeks after transfection, the angiographic score and the number of capillary density in rabbits transfected with Optison using ultrasound was significantly increased as compared with HGF plasmid alone (P < 0.01), accompanied by a significant increase in blood flow and blood pressure ratio (P < 0.01). Overall, the ultrasound transfection method with Optison enhanced the transfection efficiency of naked plasmid DNA in vivo as well as in vitro. Transfection of HGF plasmid by the ultrasound-Optison method could be useful for safe clinical gene therapy to treat peripheral arterial disease without a viral vector system.