FasL cDNA转染对直肠癌细胞顺铂耐药性的影响

目的:探讨FasLcDNA转染和表达对直肠癌细胞耐药性的影响。方法:用RT-PCR方法克隆人FasL全长cDNA,构建pcDNA3.1-FasL真核表达载体,用脂质体法转染HR-8348人直肠癌细胞,采用MTT法检测顺铂对转染和未转染直肠癌细胞的生长抑制率。结果:DNA测序证实克隆FasLcDNA898bp与GeneBank序列完全一致。构建真核表达载体转染HR-8348细胞后,FasLmRNA表达明显增强。在不同浓度顺铂(1、5、10、20、40mg/L)的作用下,FasL转染组直肠癌细胞抑制率分别为11.0%、25.4%、31.2%、37.8%、42.4%:对照组癌细胞抑制率分别为26.1%、34.4%、37.6%、42.9%、53.2%,其差异有显著性意义(t=4.43,P<0.05)。结论:FasL转染HR-8348细胞可增强癌细胞的耐药性,减弱顺铂对HR-8348细胞的杀伤作用。     

Fas基因转染联合顺铂对直肠癌细胞杀伤作用的研究

目的探讨Fas基因转染联合顺铂对直肠癌细胞的杀伤作用。方法采用RT PCR技术从健康人的外周血单核细胞中扩增包含全部阅读框架的Fas全长基因 ,与 pGEM TEasy质粒连接 ,经测序验证。构建 pcDNA3 1 Fas真核表达载体 ,将人Fas基因通过脂质体导入直肠癌 8348细胞中 ,并利用RT PCR方法检测直肠癌 8348细胞的Fas基因mRNA表达。用MTT法分析顺铂对转染前后直肠癌细胞抑制增殖和诱导凋亡的作用。结果Fas基因转染可明显增强直肠癌 8348细胞的Fas表达 ,分别用 1、5、10、2 0、4 0mg/L浓度的顺铂作用 ,转染Fas基因的 8348细胞实验组细胞抑制率分别为 4 7 2 %、5 1 8%、5 7 2 %、6 5 4 %、71 0 % ;未转染Fas基因的 8348细胞对照组细胞抑制率分别为 2 9 6 %、33 0 %、37 8%、4 1 4 %、4 7 0 % ,2组相比 ,差异有显著性意义 (t =15 33,P <0 0 1)。结论转染的Fas基因可显著上调直肠癌 8348细胞的Fas表达 ,促进细胞凋亡 ,Fas基因转染联合顺铂对直肠癌细胞有更强的杀伤作用。     

FasL基因表达对结直肠癌细胞肝转移影响的研究

目的　探讨FasL基因表达对结直肠癌细胞生物学行为的影响及在肝转移中的作用。方法　采用RT PCR方法检测大肠癌原发灶、癌旁肠黏膜、肝转移灶中FasL基因表达。用细胞转染方法 ,将FasLcDNA转染人直肠癌细胞HR 8348,采用四唑蓝法观测FasL表达对癌细胞生长抑制率及对5 FU、卡铂杀伤作用的影响。　结果　结直肠癌原发灶 (5 8例 )、癌旁肠黏膜 (5 8例 )、肝转移灶 (2 8例 )中FasL基因表达阳性率分别为 2 4 % (14 /5 8)、14 % (8/5 8)、10 0 % (2 8/2 8)。肝转移灶中FasL表达阳性率高于癌原发灶 (χ2 =4 3 4 9,P <0 0 1)和癌旁肠黏膜组织 (χ2 =5 7 6 6 ,P <0 0 1)。肝转移组原发灶FasL表达阳性率高于无肝转移组 (χ2 =3 96 ,P <0 0 5 )。转染HR 8348细胞FasL表达为阳性。用 5 FU、卡铂杀伤FasL转染细胞和未转染细胞 ,2组癌细胞生长抑制率有显著性差异 (t=9 0 2、t=11 93,P <0 0 1)。在相同化疗药物浓度下 ,FasL阳性HR 8348细胞存活率高于对照组癌细胞。　结论　FasL阳性癌细胞对化疗药物有较强的耐受性。FasL基因表达能使癌细胞逃避免疫监视和杀伤并对化疗药物产生抗性 ,促进结直肠癌发生肝转移。     

顺铂联合胞嘧啶脱氨酶自杀基因对直肠癌细胞杀伤作用的研究

目的探讨顺铂联合胞嘧啶脱氨酶(CD)自杀基因对直肠腺癌细胞8348的杀伤作用。方法以绿色荧光蛋白(GFP)基因作为报告基因,观察在顺铂作用下GFP基因对8348细胞的转染效率;用克隆形成试验观察顺铂对CD基因转染效率的影响;同时用四甲基偶氮唑盐(MTT)试验检测顺铂联合CD/5-氟胞嘧啶(5-FC)对8348细胞的杀伤作用。结果顺铂提高质粒对8348细胞的转染效率26倍。对腺癌细胞的杀伤效率:单纯转染CD基因组为14.9%;IC50的氟尿嘧啶(5-FU)联合CD基因组为54.9%;IC50的顺铂联合CD基因组为88.5%,与其他两组相比,对癌细胞杀伤效率明显增强(P<0.01)。结论顺铂联合CD自杀基因能更有效地杀伤直肠腺癌细胞,可成为治疗直肠癌术后复发及转移的一种有效的方法。     

Fas基因转染对直肠癌细胞生物学行为影响的研究

目的　探讨Fas基因转染对直肠癌细胞生物学行为的影响。方法　以正常人外周血单个核细胞 (PBMC)为模板 ,通过RT -PCR方法扩增出Fas全长cDNA ,转染人直肠癌细胞HR - 8348,检测Fas基因表达 ,观察细胞生长状态。采用MTT法观察癌细胞对化疗药物反应及细胞存活率。采用H33342释放法检测PBMC对癌细胞的杀伤活性。结果　未转染的HR - 8348细胞Fas基因表达为阴性 ,转染Fas后HR - 8348细胞Fas表达阳性。两组细胞形态和生长状态无显著性差异。分别加入化疗药物 5 -Fu、卡铂 ,检测细胞存活率。在相同药物浓度下 ,两组细胞存活率有显著性差异 (t =4 .73,3.84 ,P <0 .0 1)。Fas转染组癌细胞存活率低于未转染组 ,Fas表达阳性癌细胞对 5 -Fu、卡铂的敏感性增强。PBMC对Fas转染组HR - 8348细胞的杀伤活性为 5 6 % ,对未转染组的杀伤活性为 2 1% ,两组有显著性差异 (χ2 =2 0 .73,P <0 .0 1) ,PBMC对Fas阳性癌细胞杀伤活性明显高于对照组癌细胞。结论　转染Fas可提高癌细胞对化疗药物的敏感性 ,增强药物对癌细胞的杀伤作用。并促进机体免疫细胞的杀伤活性     

Fas基因转染对直肠癌细胞生物学行为影响的研究

目的：探讨Fas基因转染对直肠癌细胞生物学行为的影响。方法：以正常人外周血单个核细胞（PBMC）为模板，通过RT－PCR方法扩增出Fas全长cDNA，转染人直肠癌细胞HR－8348，检测Fas基因表达，观察细胞生长状态，采用MTT法观察癌细胞对中1芗反应及细胞存活率。采用H3342释放法检测PBMC对癌细胞的杀伤活性，结果，未转染的HR－8348细胞Fas基因表达为阴性，转染Fas后HR－8348细胞Fas表达阳性，两组细胞形态和生长状态无显差异，分别加入化疗药物5－Fu、卡铂，检测细胞存活率，在相同药物浓度下，两组细胞存活率有显性差异（t=4．73，3．84，P＜0．01）。Fas转染组癌细胞存活率低不转染组，Fas表达阳性癌细胞对5－Fu、卡铂的敏感性增强。PBMC对Fas转染组HR－8348细胞的杀伤活性为56％，对未转染组的杀伤活性为21％，两组有显性差异（X^2＝20．73，P＜0．01），PBMC对Fas阳性癌细胞杀活性明显高于对照组癌细胞。结论：转染Fas可提高癌细胞化疗药的敏感性，增强药物对癌细胞的杀伤作用，并促进机体免疫细胞的杀伤活性。     

重组可溶性Fas偶联蛋白激酶C抑制剂对结直肠癌细胞靶向杀伤作用的研究

目的针对复发转移结直肠癌细胞膜分子靶点,探讨可溶性Fas偶联蛋白激酶C(PKC)抑制剂对结直肠癌细胞的靶向杀伤作用。方法采用RT-PCR扩增、克隆Fas胞外区,构建真核表达载体pGEX-4T-1-sFas,采用GST融和蛋白纯化法纯化sFas。采用化学偶联法连接sFas与PKC抑制剂Calphoetin C。通过细胞抑制率测定法(MTT法)检测偶联物对FasL阳性结直肠癌细胞的杀伤作用。结果扩增、克隆Fas胞外区571 bp经限制性酶切和DNA序列测定证实无误。转化宿主菌BL21表达纯化,经Western blotting确认sFas蛋白产物。将sFas与PKC抑制剂Calphostin C经化学偶联得到偶联物sFas-Calphostin C。利用PKC酶检测系统检测偶联物具有抑制PKC酶活性作用。偶联物(40 mg/L)对FasL表达阳性结直肠癌细胞HR-8348癌细胞生长抑制率(39．04%)较FasL表达阴性HR-8348癌细胞(33．69%)明显提高(t=4．093,P＜0．05),对外周血单个核细胞杀伤作用不明显(23．08%),偶联物联合氟尿嘧啶对FasL阳性HR-8348细胞的细胞抑制率(68．38±5．07)%明显高于氟尿嘧啶对FasL阳性HR-8348细胞的细胞抑制率(36．02±1．50)%(t=14．05,P＜0．001)。结论重组可溶性Fas偶联PKC抑制剂对侵袭行为较强的结直肠癌细胞具有较强的靶向杀伤作用。     

腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶基因对直肠癌细胞的杀伤作用

目的 探讨腺病毒载体介导的胞嘧啶脱氨酶（CD）基因转染和CD/5-FC对直肠癌细胞的杀伤作用。方法 用重组腺病毒介导外源CD基因转移到人直肠癌细胞株HR-8348,通过检测腺病毒的转导效率,CD基因表达,以及集落形成实验,细胞存活率测定,裸鼠移植癌治疗实验,观察分析CD/5-FC对癌细胞的杀伤作用,结果 重组腺病毒介导CD基因转染,在癌细胞中得到高效表达。CD/5-FC系统对转染含CD重组腺病毒HR-8348细胞的集落形成,细胞生长均有明显的抑制作用,而对无CD基因转染癌细胞无影响,在转染和未转染CD基因的HR-8348混合体系中,CD/5-FC除了杀伤转染CD基因的癌细胞外,对周围的无CD转染癌细胞也有明显的杀伤作用。表现出很强的“旁观者效应”。裸鼠皮下移植癌治疗实验结果表明,CD/5-FC对HR-8348实体癌生长抑制率为71.5%。结论 CD/5-FC对腺病毒介导CD基因转染的直肠癌细胞有很强的杀伤作用和显著的“旁观者效应”。     

草酸铂、5-氟尿嘧啶联合多药耐药基因反义RNA对耐药直肠癌细胞杀伤作用的研究

目的应用基因克隆技术,将多药耐药基因（multidrug resistance gene,MDR1）反义RNA转染入对氟尿嘧啶（5-FU）耐药直肠癌细胞（8348R）中,封闭正义MDR1的转录和表达,联合应用草酸铂及5-FU共同作用于8348R,观察其联合杀伤作用.方法构建含MDR1反义RNA的真核表达质粒PC-MDR1;以绿色荧光蛋白（greenfluorescence protein,GFP）基因作为报告基因,观察在草酸铂作用下GFP基因对8348R细胞的转染效率,用克隆形成试验观察草酸铂对PC-MDR1质粒转染8348R细胞的影响;用MTT试验检测草酸铂联合5-FU及MDR1反义RNA对8348R细胞的杀伤效率.结果转染PC-MDR1质粒后,8348R细胞在5-FU作用下较转染前活性明显下降,转染后细胞出现明显的S期和G2/M期阻滞,细胞凋亡比例显著升高;草酸铂将PC-MDR1质粒对直肠癌细胞的转染效率提高18倍,IC50剂量草酸铂、5-FU联合MDR1反义RNA可大大提高对8348R细胞的杀伤效率,总体杀伤效率可达到75%.结论应用草酸铂、5-FU联合MDR1反义RNA对直肠癌耐药细胞的协同杀伤作用,可望成为治疗对5-FU耐药的直肠癌的有效方法.     

转Fas基因对膀胱癌细胞的作用

目的　探讨Fas基因转染对膀胱癌细胞的作用。　方法　将人FascDNA通过脂质体导入膀胱癌细胞EJ中 ,并利用Northernblot、原位杂交、流式细胞术检测细胞的FasmRNA和分子表达。用流式细胞仪、DNA梯形带和MTT法分析顺铂对转染前后的EJ细胞抑制增殖和诱导凋亡的能力。　结果　Fas基因转染可明显增强膀胱癌细胞EJ的Fas表达 ,顺铂对转染后的EJ细胞抑制细胞增殖和诱导凋亡的能力明显增强。　结论　转染的Fas基因可显著上调膀胱癌细胞EJ的Fas表达 ,促进细胞凋亡 ,联合应用Fas基因转染和顺铂可获得协同的细胞毒作用     

FasL基因表达对缺氧状态下直肠癌细胞增殖凋亡的影响

目的探讨直肠癌侵袭转移过程中FasL基因表达对细胞增殖凋亡的影响。方法采用北京军区总医院普通外科实验室构建的4组不同侵袭力的人直肠癌HR-8348细胞亚型HR-8348B、HR-8348L、HR-8348F和HR-8348As,并用化学缺氧法构建上述4组细胞的缺氧12h模型,以Western印迹法验证各组细胞内FasL蛋白的表达水平和缺氧状态下细胞内FasL蛋白的表达,流式细胞仪测定细胞周期分布并计算细胞增殖指数,四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定细胞增殖能力改变并计算细胞抑制率,末端标记法（TUNEL）测定细胞凋亡状况。结果Western印迹显示FasL蛋白于40000处显色。常氧条件下HR-8348F细胞内FasL的表达水平显著高于HR-8348B、HR-8348L和HR-8348As（F=361.149。P〈0.01）;缺氧12h时各组细胞均生长良好,形态较常氧状态皱缩;HR-834F,细胞内FasL的表达水平仍显著高于其他3组（F=278.766,P〈0.01）,但其自身常氧与缺氧状态下FasL的水平差异无统计学意义（t=1.762,P〉0.05）。缺氧12h后各组细胞增殖均受到抑制,HR-8348F细胞的增殖指数（60.43±3.72）显著高于HR-8348B（40.01±3.30）、HR-8348L（41.30±4.06）和HR-8348As（35.87±4.39）（F=39.477,P〈0.01）,增殖抑制率（17.30±1.98）和凋亡指数（13.10±1.04）显著低于HR-8348B（33.70±4.33和21.60±1.31）、HR-8348L（34.20±3.92和20.10±1.15）、HR-8348As（38.00±4.55和23.90±1.23）细胞（F分别为28.811和76.462,P〈0.01）。结论缺氧环境中,直肠癌细胞FasL表达增强可导致细胞增殖加速、凋亡减少和侵袭能力增强。促进细胞对微环境缺氧的耐受。     

双启动子引导自杀基因靶向杀伤5-FU耐药肿瘤细胞的研究

目的：探讨胸苷酸合成酶（TS）基因启动子和p16基因启动子引导胸苷激酶（TK）自杀基因靶向杀伤5－FU耐药肿瘤细胞的作用。方法：构建TS、p16双启动子重组表达载体,将TK基因插入TS、p16启动子之间,转染耐药人直肠癌细胞系HR－8348、外周血单个核细胞。通过克隆形成实验、细胞存活率测定和裸鼠移植瘤治疗实验,观察双启动了引导TK基因特异杀伤肿瘤细胞的作用。结果：将TS、p16双启动子重组质粒载体转入耐药HR－8348细胞,检测TS、TK基因表达阳性,TK基因与TS表达一致。转染组和对照组肿瘤细胞集落形成分别为：9／300、92／300。转染组瘤细胞集落形成率明显降低（t=33.885,P＜0．01）,癌细胞生长抑制率显著提高。对裸鼠移植瘤的生长抑制率为74．5％。在转染的外周血单个核细胞,p16表达阳性,TS、TK表达阴性。转染双启动子重组质粒对正常外周血单个核细胞无损伤作用。结论：TS和p16双启动子可引导TK基因靶向性杀伤5－FU耐药肿瘤细胞,保护肌体正常细胞,提高自杀基因治疗的安全性。     

FasL逆转录病毒转移体系的建立及其在肝癌细胞中的表达

目的　研究Fas/FasL系统的生物学功能,探讨转FasL基因治疗肿瘤的可行性。方法将大鼠FasL全长cDNA亚克隆到逆转录病毒载体pLXSN中,获得FasL正向单拷贝插入子pLXSN/FasL     

直肠癌局部浸润及肝转移中MT和FasL表达异常的意义

目的 探讨直肠癌局部浸润及肝转移中金属硫蛋白(metallothionein,MT)和人凋亡相关因子配体(Fas Ligand,FasL)蛋白表达异常的意义.方法 采用免疫组化和定量RT-PCR方法检测85例直肠癌原发灶、正常直肠黏膜、转移淋巴结和肝转移灶MT、FasL表达,比较各组间数据差异并作统计学分析.结果 直肠癌原发灶、正常直肠黏膜、转移淋巴结和肝转移灶中MT表达阳性率分别为:57.3%、29.6%、79.5%、61.8%.FasL表达阳性率分别为:45.8%、17.8%、63.5%、90.3%.癌原发灶、肝转移灶和转移淋巴结中MT、FasL表达阳性率高于正常直肠黏膜组织(X~2=33.1322、56.7142,P<0.01).C、D期MT、FasL表达阳性率高于A、B期(X~2=18.8372、21.5823,P<0.01).低分化腺癌和黏液腺癌MT、FasL表达阳性率高于高分化和中分化腺癌(X~2=11.2146、9.3136,P<0.05).转移淋巴结中MT mRNA表达高于FasL mRNA表达.肝转移灶中FasL mRNA表达水平高于MT mRNA表达.结论MT、FasL表达对分别预测直肠癌组织局部淋巴结转移和早期肝转移具备临床诊断价值,两者对判断直肠癌患者预后亦有重要意义.     

Cisplatin augments cytotoxic T-lymphocyte-mediated antitumor immunity in poorly immunogenic murine lung cancer

OBJECTIVE: Many tumors are poorly immunogenic and resistant to cytotoxic T-lymphocyte-mediated cell lysis. Because cisplatin has been demonstrated to increase tumor cell Fas receptor expression, we hypothesized that cisplatin will enhance cytotoxic T-lymphocyte tumor cell killing and augment the antitumor effect of an active immunotherapy strategy in a poorly immunogenic murine lung cancer model. METHODS: Lewis lung carcinoma cells were exposed to cisplatin in vitro, and Fas receptor expression and apoptosis in response to an agonistic anti-Fas antibody were quantified using flow cytometry. Wild-type and Fas ligand-deficient mice bearing Lewis lung carcinoma flank tumors were then treated with intraperitoneal cisplatin as well as an intratumoral injection of an adenovirus gene transfer vector encoding CD40 ligand. End points included tumor size, animal survival, and Fas expression (determined using immunofluorescence). Cytotoxicity assays were performed using splenocytes from adenovirus gene transfer vector encoding CD40 ligand-treated animals as effectors and cisplatin-treated Lewis lung carcinoma cells as targets. RESULTS: Cisplatin induced heightened expression of Fas receptor on Lewis lung carcinoma cells in vitro and in vivo and enhanced apoptosis in cells exposed to an agonistic anti-Fas antibody. In vivo, the combination of 1 dose of intraperitoneal cisplatin and intratumoral adenovirus gene transfer vector encoding CD40 ligand inhibited tumor growth and prolonged survival compared with adenovirus gene transfer vector encoding CD40 ligand alone, resulting in a higher cure rate. This effect was lost in Fas ligand-deficient mice. Splenocytes from adenovirus gene transfer vector encoding CD40 ligand-treated wild-type mice lysed cisplatin-treated Lewis lung carcinoma cells more efficiently than untreated Lewis lung carcinoma cells, an effect lost in splenocytes from Fas ligand-deficient mice. CONCLUSION: Cisplatin augments the antitumor effect of a cytotoxic T-lymphocyte-mediated immunotherapy strategy, resulting in a higher cure rate than seen with immunotherapy alone. This effect is associated with the enhanced ability of cytotoxic T lymphocytes to lyse tumor cells that have been exposed to cisplatin through Fas/Fas ligand interactions.     

脂质体转染CD基因联合放射线对人直肠癌荷瘤裸鼠体内抗癌作用的研究

目的　探讨脂质体反复转染CD基因联合放射线对人直肠癌细胞荷瘤鼠体内的抗癌效果 ,为临床治疗直肠癌提供理论依据。方法　构建PXJ4 1/CD载体并进行测序证实 ,制备人直肠癌细胞荷瘤鼠 ,待瘤体长至长径达 0 5cm后 ,设实验组应用脂质体于治疗的当日及第 4、8、12天反复转染 ,于当日起 2Gy/day连续照射患肢 15d ,第 3天起 5 FC 80 0mg/kg/day腹腔注射共 12d ,另设单纯放射组、单纯CD/ 5 FC治疗组、空白对照组 ,观察荷瘤裸鼠的肿瘤生长曲线 ,瘤体积抑制率和瘤重抑制率。结果　荷瘤裸鼠肿瘤生长曲线显示 :实验组肿瘤生长曲线平缓 ,治疗效果显著 ,瘤体积抑制率平均为 81 5 % ,瘤重抑制率平均为 78 7% ,与其它 3组比较差异有显著性意义 (χ2 =2 87 86 ,P <0 0 1)。病理学检查示肿瘤细胞较对照组明显减少。结论　脂质体反复转染CD基因联合放射线治疗直肠癌荷瘤鼠 ,二者可产生协同作用 ,比单纯放疗或单纯CD/ 5 FC有更显著的抗癌疗效