转化生长因子β1刺激系膜细胞的Smad2表达及对结缔组织生长因子产生的影响

目的研究在转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)刺激下系膜细胞表达Smad2及对结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)产生的影响.方法培养第4代大鼠肾系膜细胞分为4组对照组、1ng/ml TGF-β1刺激组、5ng/ml TGF-β1刺激组、Staurosporine抑制组.在15min、30min、1 h、2 h时用RT-PCR测Smad2 mRNA的表达,用免疫组化测Smad2蛋白的表达;同样在24h时用RT-PCR测CTGF mRNA的表达,用免疫组化测CTGF蛋白的表达.结果体外培养的大鼠肾系膜细胞,在TGF-β1刺激下,Smad2 CTGFmRNA和蛋白的表达明显增加(P＜0.05),应用丝、苏氨酸激酶抑制剂Staurosporine抑制Smad2磷酸化,可以明显减少TGF-β1刺激下系膜细胞表达CTGF(P＜0.05).结论在系膜细胞,TGF-β1主要依赖Smad信号通路调节CTGF的表达.     

TGF-β与CTGF在大鼠低压缺氧时右心室心肌纤维化中的作用

目的 探讨转化生长因子β(transforming growth factor β,TGF-β)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)在低压缺氧条件下发生右心室心肌纤维化与肥大中的作用.方法 将50只8周龄雄性SD大鼠[体质量(188.6±19.3)g]随机分为常氧喂养对照组与低压缺氧喂养3、7、14和28 d实验组(n=10),低压缺氧大鼠置于模拟海拔6000m的低压舱内饲养.分离右心室,称量法计算右心室肥厚指数.采用荧光定量PCR与免疫印迹法分别检测右心室心肌组织中Ⅰ型胶原、TGF-β和CTGF的mRNA与蛋白表达水平,并分析低压缺氧相同天数TGF-β和CTGF与Ⅰ型胶原表达水平、右心室肥厚指数的相关性.结果 与常氧组相比,右心室心肌组织中低压缺氧各组右心室肥厚指数均升高,其中低压缺氧7、14、28 d组右心室肥厚指数显著升高(P＜0.05).与常氧组相比,右心室心肌组织中低压缺氧各组Ⅰ型胶原水平均升高,其中低压缺氧7、14、28 d组水平显著升高(P＜0.05).与常氧组相比,低压缺氧3d组右心室心肌组织中TGF-β(3.68±0.17)、CTGF(8.73±0.96)蛋白表达量均显著升高(P＜0.05),低压缺氧28 d组右心室心肌组织中TGF-β(0.93±0.15)、CTGF(12.62±0.14)蛋白水平均显著升高(P＜0.05),而低压缺氧7、14 d组两细胞因子表达量与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).随低压缺氧时间增加,右心室心肌组织中两生长因子mRNA表达水平与右心室肥厚指数呈显著正相关(P＜0.05),与Ⅰ型胶原的mRNA水平也呈显著正相关(P＜0.05,低压缺氧28 d组除外);随低压缺氧时间增加,TGF-β的mRNA水平与CTGF的mRNA水平呈显著正相关(P＜0.05).结论 随低压缺氧时间增加,右心室心肌组织中TGF-β、CTGF先增加后降低再增加的表达变化,参与了低压缺氧时右心室心肌纤维化、心肌肥大的过程.     

骨形成蛋白-7对肾小管上皮细胞转分化及结缔组织生长因子表达的影响

目的 观察骨形成蛋白-7(BMP-7)对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导人近端肾小管上皮细胞(HK-2)向间充质细胞转分化(EMT)及表达结缔组织生长因子(CTGF)的影响,探讨其抑制、逆转肾间质纤维化的可能机制.方法 将体外培养的HK-2细胞分为对照组,3 ng/ml TGF-β1组,TGF-β1同时加不同浓度BMP-7(100～400 ng/ml)组.相差显微镜观察细胞形态改变;间接免疫荧光测定E-cadherin的表达;RT-PCR和Western印迹分别检测α-SMA、E-cadherin、CTGF mRNA和蛋白的表达.结果 3 ng/ml TGF-β1刺激48 h后,HK-2细胞由立方形铺路石样转变为梭形长条样;去除TGF-β1,再加入200 ng/ml BMP-7干预48 h,可见到大部分细胞逆转回原来的形态.免疫荧光显示,E-cadherin蛋白在正常HK-2细胞质膜高表达;3 ng/ml TGF-β1刺激后,E-cadherin表达明显减弱;去除TGF-β1,再加入200 ng/ml BMP-7干预后,E-cadherin表达重新恢复.RT-PCR及Western印迹显示,3 ng/mlTGF-β1刺激48 h后,α-SMA mRNA及蛋白表达明显上调、E-cadherin mRNA及蛋白表达明显减少,同时CTGF mRNA及蛋白表达明显增加(P<0.01);BMP-7与TGF-β1共同刺激48 h后,BMP-7呈剂量依赖性抑制TGF-β1诱导下α-SMA mRNA及蛋白的表达,并逐渐恢复E-cadherin mRNA及蛋白的表达,同时下调CTGF mRNA及蛋白的表达,400 ng/ml BMP-7组与TGF-β1组相比差异有统计学意义(P<0.01).结论 BMP-7能阻断并逆转TGF-β1诱导的EMT,下调CTGF的表达,这可能是其逆转肾间质纤维化的重要作用机制.     

转化生长因子-β1对新生大鼠星形胶质细胞结缔组织生长因子表达的影响

目的:研究转化生长因子;GAAB2;β1;(TGF;GAAB2;β1)对新生大鼠大脑皮层星形胶质细胞表达结缔组织生长因子(CTGF) 的影响.方法:体外培养的新生SD大鼠大脑皮层星形胶质细胞分为对照组:无血清培养基(FSM) 培养; 实验组:分别用含1 μg /L,2 μg /L,4 μg /L TGF-β1的FSM培养,24 h后,分别用RT-PCR和Western Blot检测2组细胞中CTGF mRNA和蛋白的表达.结果:对照组CTGF mRNA和蛋白表达均为阴性;实验组CTGF mRNA和蛋白表达皆呈阳性,且随着TGF-β1质量浓度的增加,2者的表达量有增高的趋势(F=80.889和200.300,P均＜0.01).结论:TGF-β1 能上调星形胶质细胞中CTGF的表达.     

氯沙坦对糖尿病肾病大鼠肾小球硬化的影响

目的:探讨氯沙坦对糖尿病肾病大鼠细胞外基质降解作用的机制.方法:采用链脲霉素(streptozotozin,STZ)诱导的糖尿病肾病大鼠模型,将大鼠随机分为正常组、模型组和氯沙坦组,16周后测血肌酐、尿素氮.对肾组织进行HE和Masson染色,计算肾小球硬化指数.Western免疫印迹测定肾脏Ⅳ型胶原和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)的蛋白表达量,real time-PCR方法检测肾组织Ⅳ型胶原mRNA,转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)mRNA和CTGF mRNA的表达水平.结果:氯沙坦组血尿素氮、肾小球硬化指数及肾组织Ⅳ型胶原、CTGF蛋白表达均低于模型组(均P<0.05);Ⅳ型胶原mRNA,TGF-βJ mRNA及CTGF mRNA的表达水平均低于模型组(均P<0.05).结论:氯沙坦可能通过抑制TGF-βl和CTGF,减少Ⅳ型胶原积聚,减轻肾小球硬化.     

动态观察依那普利对单侧输尿管梗阻大鼠TGF-β1,CTGF,Smad7和α-SMA的影响

目的：动态观察血管紧张素转换酶抑制剂依那普利对单侧输尿管梗阻大鼠肾组织转化生长因子（transforming growth factor-β,TGF-β1)、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）、Smad7和平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin, α-SMA)表达的影响,探讨依那普利对肾小管上皮细胞转分化的影响。方法：雄性SD大鼠64只,采用单侧输尿管梗阻模型,将实验大鼠分为假手术组（16只）、模型组（24只）和治疗组（24只）,治疗组从造模前24 h开始以依那普利10 mg/（kg·d）灌胃。分别于造模后3,7,14,21 d取梗阻侧肾组织进行HE染色,观察肾脏组织病理结构变化,并进行肾间质损伤指数评分;应用real-time PCR法检测肾组织TGF-β1和CTGF mRNA的表达,应用Western 免疫印迹检测肾组织α-SMA,Smad7和CTGF蛋白的表达。结果：随着梗阻时间的延长,单侧输尿管梗阻模型鼠肾间质损伤指数评分逐渐增加。TGF-β1和CTGF mRNA以及α-SMA和CTGF蛋白表达逐渐增加,Smad7蛋白表达逐渐减少。依那普利治疗后,肾间质损伤指数下降,TGF-β1和CTGF mRNA以及α-SMA和CTGF蛋白表达较模型组降低,Smad7蛋白表达较模型组增加,依那普利对各时间点 TGF-β1 mRNA的表达均有明显的下调作用,对 CTGF mRNA,α-SMA,CTGF和Smad7蛋白对以单侧输尿管梗阻术后3,7,14 d作用最明显。结论：依那普利可减轻梗阻肾间质纤维化, 以单侧输尿管梗阻后14 d内效果最好,这一作用可能与抑制肾组织TGF-β1,CTGF和α-SMA的表达,增加肾组织Smad7的表达有关。     

罗格列酮对肺成纤维细胞TGF-β1信号转导途径的干预作用

目的 研究转化生长因子-β1(TGF-β1)对人肺成纤维细胞结缔组织生长因子(CTGF)、CTGF mRNA、核因子-κB(NF-κB)及激活子蛋白-1(AP-1)表达的影响及其罗格列酮对肺成纤维细胞TGF-β1信号转导途径的影响及可能机制.方法 以人肺成纤维细胞系(HLF-02)为研究对象,用Western blot法检测TGF-β1、姜黄素、吡咯烷二硫基甲酸盐(PDTC)、罗格列酮作用后的CTGF、NF-κB及AP-1蛋白的表达,免疫组织化学方法 检测CTGF蛋白、RT-PCR技术测CTGF mRNA的表达.结果 ①与对照组比较,1 ng/mL TGF-β1作用15 min后,CTGF表达水平即增强(P＜0.01),并随着作用时间延长而逐渐增强.CTGF mRNA的表达亦随着时间的延长逐渐增加,作用24 h表达最多.②1 ng/mL TGF-β1作用30 min后,NF-κB及AP-1的表达水平增强(P＜0.01),以后表达趋于稳定,抑制剂(PDTC 100 μmol/L、姜黄素50 μmol/L)抑制这两条通路后CTGF的表达明显下降.③低(5 μmol/L)、中(10 μmol/L)、高(15 μmol/L)浓度罗格列酮预处理细胞30 min+TGF-β1作用24 h组较单纯TGF-β1处理24 h组CTGF、NF-κB及AP-1蛋白表达明显降低(P＜0.01),并且可以明显抑制1 ng/mL TGF-β1作用24 h引起的CTGF mRNA的表达(P＜0.01).结论 在体外,罗格列酮可通过NF-κB及AP-1信号转导途径启动人肺成纤维细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)抑制TGF-β1诱导CTGF转录和表达.     

醛固酮对大鼠肾小球系膜细胞表达结缔组织生长因子的影响

目的:探讨醛固酮(ALD)对大鼠肾小球系膜细胞表达结缔组织生长因子(CTGF)的影响,及转化生长因子β1(TGF-β1)是否参与其信号通路。方法:大鼠肾小球系膜细胞加入不同浓度的ALD共同培养0、12、24、36、48h,RT-PCR方法评价CTGF mRNA的表达;用ELISA方法检测TGF-β1蛋白的表达;并用TGF-β1/Smads信号通路的特异性丝、苏氨酸激酶抑制剂Staurosporine(STA)加以对比。结果:ALD刺激后肾小球系膜细胞CTGF mRNA表达水平增加,且呈剂量依赖性,TGF-β1蛋白表达也明显增加;用STA预处理1h后再用ALD刺激24h,则CTGFmR-NA的表达无明显变化。结论:ALD通过TGF-β1/Smads途径上调肾小球系膜细胞表达CTGF。     

β榄香烯对肾小球系膜细胞纤维化的抑制作用

目的 观察β榄香烯对转化生长因子(TGF-β)刺激后的肾小球系膜细胞(HMC)表达结缔组织生长因子(CTGF)及纤维连接蛋白(FN)的影响.方法 先用有效浓度10 ng/mL的转化生长因子(TGF-β)刺激肾小球系膜细胞(HMC)24 h,然后再用不同浓度,分别为80μg/mL、120μg/mL、160μg/mL的榄香烯干预被刺激的肾小球系膜细胞( HMC )24h.实验分高中低不同浓度组、诱导组及空白对照组.用Western蛋白印迹法测定FN蛋白表达和CTGF的蛋白表达.用RT-PCR法检测FN和CTGF的mRNA水平的变化.结果 经TGF-β刺激24 h后的肾小球系膜细胞(HMC),诱导组较空白组比较,FN蛋白和CTGF蛋白的表达能明显(P＜0.05),高浓度β榄香烯组和中浓度β榄香烯组较诱导组比较,HMC上的FN蛋白和CTGF蛋白的表达和mRNA水平明显降低(P＜0.05),并呈浓度依赖方式降低MHC上表达的FN和CTGF的表达.结论 β榄香烯可以通过减少诱导纤维化后的肾小球系膜细胞中CTGF和FN的表达,发挥抑制肾间质纤维化的作用,β榄香烯可以抑制肾间质纤维化,在延缓肾功能衰竭过程中起着重要作用.     

霉酚酸酯抑制转化生长因子-β在肺成纤维细胞中的表达及应用价值

目的 探讨霉酚酸酯(mycophenolate mofetil,MMF)抑制转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)在肺成纤维细胞WI26中的表达和应用价值.方法 肺成纤维细胞WI26常规细胞培养后分4组:对照组、MMF组、TGF-β组、MMF+TGF-β组.采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) 检测TGF-β介导相关基因COL1A1的表达,Western blot和氯霉素乙酰基转移酶实验(chloramphenicol acetyl transferase,CAT)方法检测COL1蛋白的表达;胶原基质收缩实验和细胞伤痕实验观察胶原纤维的收缩和细胞移行能力的差异.结果 MMF作用细胞24、48 h后,COL1A1 mRNA表达分别为对照组的(77.0±2.9)% 和(38.0±3.7)%,MMF降低了COL1A1 mRNA水平(P<0.05);TGF-β作用细胞24、48 h后,COL1A1 mRNA表达分别为对照组的(134.0±3.1)%和(189.0±2.4)%,TGF-β提高了COL1A1 mRNA水平(P<0.05);MMF+TGF-β作用细胞24,48 h 后,COL1A1 mRNA表达分别为对照组的(95.0±2.7)%和(71.0±3.3)%(P<0.05),48 h后MMF阻止了TGF-β诱导的COL1A1 mRNA表达.48 h后MMF组COL1蛋白表达为对照组的(44.0±1.9)%(P<0.05);TGF-β组COL1蛋白表达为对照组的(145.0±1.5)%(P<0.05);MMF+TGF-β组COL1蛋白表达为对照组的(79.0±2.5)%,MMF阻止TGF-β诱导的COL1蛋白表达.胶原基质收缩实验(第0、1、5天观察)和细胞伤痕实验(第0、8、24小时观察)结果显示:MMF重建成纤维细胞的接触抑制生长.结论 MMF能阻止TGF-β介导的细胞纤维化.     

结缔组织生长因子协同转化生长因子β1的促肾纤维化效应

目的　探讨结缔组织生长因子 (CTGF)和转化生长因子 β1(TGF β1)对肾脏成纤维细胞合成和分泌基质金属蛋白酶 2 (MMP 2 )和细胞表型转化的影响。方法　将大鼠肾成纤维细胞分为对照组、CTGF刺激组、TGF β1刺激组、CTGF加TGF β1联合刺激组 ,以明胶酶谱法和Western印迹方法分别检测细胞上清中MMP 2活性和蛋白的变化 ,实时定量 聚合酶链反应 (PCR)方法检测细胞中MMP 2mRNA的水平。Western印迹方法检测成肌纤维细胞标志蛋白α 平滑肌肌动蛋白 (α SMA)的表达水平和细胞上清中细胞外基质成分纤黏连蛋白 (FN)的水平。结果　MMP 2的活性和蛋白水平在刺激 2 4h时 ,各组之间无明显差异 ;刺激 4 8h ,10 0ng/mlCTGF组和 5ng/mlTGF β1组明显属于对照组 (P <0 0 5 ) ;而不同浓度的CTGF加TGF β1联合刺激组分别低于CTGF刺激组、TGF β1刺激组 ,其中 10 0ng/mlCTGF加 5ng/mlTGF β1、5 0ng/mlCTGF加 5ng/mlTGF β1均分别明显低于CTGF刺激组、TGF β1刺激组 (P <0 0 5 )。上述各组细胞刺激 12h ,MMP 2mRNA水平在 10 0ng/mlCTGF组和 5ng/mlTGF β1组均明显高于对照组 (1 72 ,1 6 8vs 1 2 9,P <0 0 1) ,而 10 0ng/mlCTGF加 5ng/mlTGF β1联合组明显低于CTGF刺激组、TGF β1刺激组 (0 6 7v     

结缔组织生长因子通过活化Erk-1/2信号通路促成肌纤维细胞生成

目的探讨结缔组织生长因子(CTGF)协同转化生长因子β1(TGFβ1)促进成肌纤维细胞生成分子机制。方法用TGFβ1预处理大鼠肾间质成纤维细胞(NRK49F),使部分细胞转化为成肌纤维细胞,然后将预处理后的细胞分为对照组,CTGF刺激组,TGFβ1刺激组和PD98059干预组。通过免疫细胞化学双染技术分别检测成肌纤维细胞标志蛋白α平滑肌肌动蛋白(αSMA)和掺入的细胞增殖标志物5溴2'脱氧尿嘧啶(BrdU);并以Western免疫印迹法检测αSMA水平。结果TGFβ1预处理的各组细胞都有胞浆内αSMA染色阳性,CTGF刺激组αSMA蛋白表达均明显高于对照组(P<0.05);但CTGF组部分αSMA阳性细胞核内BrdU阳性率明显高于对照组和TGFβ1组。进一步实验显示CTGF刺激细胞30min能明显诱导细胞内Erk1/2磷酸化,TGFβ1组无此反应。用PD98059阻断Erk1/2磷酸化可以明显抑制CTGF引起的细胞核内BrdU阳性表达和αSMA蛋白表达(P<0.05)。结论CTGF通过Erk1/2信号通路促进TGFβ1诱导的成肌纤维细胞增殖。     

Inhibition effect of small interfering RNA of connective tissue growth factor on the expression of vascular endothelial growth factor and connective tissue growth factor in cultured human peritoneal mesothelial cells

Background The peritoneum response to peritoneal dialysis can lead to fibrosis. The transforming growth factor β1 （TGF-β1 ） plays a key role in regulating tissue repair and remodelling after injury. Connective tissue growth factor （CTGF）, a downstream mediator of TGF-β1 inducing fibrosis, has been implicated in peritoneal fibrosis. Vascular endothelial growth factor （VEGF） plays a key role in angiogenesis that can hasten peritoneal fibrosis. In this study, we investigated the effect of small interfering RNA （siRNA） of CTGF by pRETRO-SUPER （PRS） retrovirus vector on the expression of CTGF and VEGF in human peritoneal mesothelial cells. Methods Retrovirus producing CTGF siRNA were constructed from the inverted oligonucleotides and transferred into packaging cell line PT67 with lipofectamine, and the virus supernatant was used to infect human peritoneal mesothelial cell （HPMC）. The cells were divided into seven groups： low glucose DMEM, low glucose DMEM ＋ TGF-β1 5 ng/ml, low glucose DMEM ＋ TGF-β1 5 ng/ml ＋ PRS-CTGF-siRNA1-4 and low glucose DMEM ＋ TGF-β1 5 ng/ml ＋ PRS. The expression of CTGF and VEGF were measured by semiquantitative RT-PCR and Western blot. Results Low levels of CTGF and VEGF were detected in confluent HPMCs. Following stimulation with TGF-β1 , the levels of CTGF and VEGF were significantly upregulated （P〈0.01）. Introduction of PRS-CTGF-siRNA1-4 resulted in the significant reduction of CTGF mRNA and protein, and VEGF mRNA （P〈0.01）, especially in groups PRS-CTGF-siRNA, and PRS-CTGF-siRNA4. The introduction of PRS void vector did not have these effects （P〉0.05）. Conclusions The expression of CTGF siRNA mediated by PRS retrovirus vector can effectively reduce the level of CTGF and VEGF induced by TGF-β1 in cultured HPMCs. This study may provide potential therapeutic strategies to prevent the peritoneal fibrosis.     

转化生长因子β1通过Smad2途径调节足细胞结缔组织生长因子表达

目的　研究肾脏足细胞是否表达结缔组织生长因子 (CTGF)以及TGFβ1对CTGF表达调控的信号途径。方法　以肾小球足细胞为对象 ,应用Western印迹分析技术 ,观察了 3种促进肾脏纤维化的蛋白因子 ,转化生长因子 β1(TGFβ1)、血小板源生长因子 (PDGF)和血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )对体外培养的足细胞CTGF蛋白表达的影响 ,以及ERK、Smad两条信号途径在TGFβ1调节CTGF蛋白表达中的影响 ;逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)检测CTGFmRNA的变化。结果　体外培养的足细胞表达基础水平CTGF蛋白 ,2 0ng/mlPDGF和 10 -6mol/LAngII刺激 2 4小时后细胞内CTGF蛋白水平与对照相比差异无显著意义 (P >0 0 5 ) ,而 1ng/mlTGFβ1刺激 2 4h足细胞CTGF蛋白水平显著高于对照 (P <0 0 5 ) ,且增加呈TGFβ1剂量依赖趋势 ;1ng/mlTGFβ1刺激 12h可以使细胞CTGFmRNA表达增加。1ng/mlTGFβ1使足细胞Smad2 和细胞外信号调节激酶 (ERK1/ 2 )磷酸化 ,在刺激 30min达高峰 ;应用丝 /苏氨酸激酶抑制剂Staurosporine抑制Smad2 磷酸化可以消减TGFβ1刺激的CTGF蛋白增加 ,但ERK1/ 2 活化抑制剂PD 980 5 9阻断ERK1/ 2 磷酸化不能减弱TGFβ1刺激CTGF蛋白表达的效应。结论　在足细胞上 ,TGFβ1刺激CTGF表达依赖于Smad2 信号通路的活化 ,而不依赖于ERK1/     

Role of connective growth factor in plasminogen activator inhibitor-1 and fibronectin expression induced by transforming growth factor β1 in renal tubular cells

Background Connective tissue growth factor (CTGF) contributes greatly to renal tubulointerstitial fibrosis, which is the final event leading to end-stage renal failure. This study was designed to investigate the effects of CTGF antisense oligodeoxynucleotides (ODNs) on the expressions of plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) and fibronectin in renal tubular cells induced by transforming growth factor β1 (TGF-β) in addition to the role of CTGF in the accumulation and degradation of renal extracellular matrix (ECM). Methods A human proximal tubular epithelial cell line (HKC) was cultured in vitro. Cationic lipidmediated CTGF antisense ODNs were transfected into HKC cells. After HKC cells were stimulated with TGF-β1 (5 μg/L), the mRNA levels of PAI-1 and fibronectin were measured by RT-PCR. Intracellular PAI-1 protein synthesis was assessed by flow cytometry. The secreted PAI-1 and fibronectin in the medium were determined by Western blot and ELISA, respectively. Results TGF-β was found to induce tubular CTGF, PAI-1, and fibronectin mRNA expression. PAI-1 and fibronectin mRNA expression induced by TGF-β was significantly inhibited by CTGF antisenes. ODNs CTGF antisense ODNs also inhibited intracellular PAI-1 protein synthesis and lowered the levels of PAI-1 and fibronectin protein secreted into the medium. Conclusions CTGF may play a crucial role in the accumulation and degradation of excessive ECM during tubulointerstitial fibrosis, and transfecting CTGF antisense ODNs may be an effective way to prevent renal fibrosis.     

低氧通过p38丝裂素激活蛋白激酶途径刺激人肾间质成纤维细胞表达结缔组织生长因子

目的:研究低氧条件下人肾间质成纤维细胞表达结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)及其可能的信号途径,从而探讨低氧导致肾间质纤维化的分子机制.方法:以人肾间质成纤维细胞TK173作为研究对象,应用Western blot技术,检测低氧标记蛋白分子,低氧诱导因子-lα(hypoxia induced factor-lα,HIF-1α)蛋白作为低氧标记物;比较低氧(1%O2,体积分数)和正常氧(21%O2,体积分数)条件下TK173细胞培养12,24,48 h后CTGF蛋白水平;低氧刺激TK173细胞30 min,1 h,6 h和12 h,运用抗磷酸化抗体检测丝裂素激活蛋白激酶(MAPKs)活化;在低氧刺激半小时前分别加入p38、细胞外信号调节激酶(ERK1/2)、c-Jun-N末端蛋白激酶(JNK)信号通路特异阻断剂SB203580,PD98059,SP600125,低氧培养24 h后检测细胞CTGF蛋白水平.用RT-PCR技术分析CTGF mRNA水平变化.结果:TK173细胞正常氧组仅有HIF-1α蛋白微弱表达,低氧组有高水平HIF-lα蛋白表达.在低氧条件下培养12 h后细胞CTGF蛋白增加,24 h时CTGF蛋白表达最强,是正常氧组的(2.1±0.1)倍,至48 h降至对正常氧组水平;同时低氧培养刺激CTGF mRNA表达,在1 h时开始增加,6 h时达高峰为正常氧组的(6.6±1.0)倍,24 h后恢复基础水平.低氧可以活化MAPKs,JNK在30 min达到高峰,ERK1/2、p8在刺激1 h时达高峰,6 h减弱,12 h减至基础水平;应用ERK1/2抑制剂PD98059和JNK抑制剂SP00125不能减弱低氧刺激CTGF蛋白表达增加的效应,但应用P38活化抑制剂SB203580可以明显减少低氧刺激的CTGF蛋白和mRNA的增加.结论:低氧可刺激人肾间质成纤维细胞表达CTGF,并且该作用依赖p38通路的活化.     

罗格列酮对KKAy小鼠肾脏小管间质结缔组织生长因子表达的影响

目的观察罗格列酮对2型糖尿病KKAy小鼠肾皮质和小管间质结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响。方法选取16周龄KKAy小鼠25只,随机分组给予罗格列酮30mg·kg-1·d-1和安慰剂灌胃,分别于第16、20、24周龄时处死动物。用Westernblot方法分析各组小鼠肾皮质转化生长因子-β1(TGF-β1)、CTGF、纤连蛋白(FN)和过氧化物酶体增殖体激活受体-γ(PPARγ)蛋白表达,对组织切片进行免疫组织化学染色半定量分析CTGF在小管间质阳性面积比。结果20周龄罗格列酮治疗组与同周龄安慰剂组小鼠相比肾皮质区TGF-β1、CTGF和FN蛋白质表达分别下降37%、21%和52%(P<0·01),小管间质区CTGF免疫染色减少25%(P<0·01);24周龄罗格列酮治疗组与同周龄安慰剂组小鼠相比24h尿蛋白明显减少(44·53±1·96)vs(63·66±5·57)μg/24h(P<0·05),肾皮质区TGF-β1、CTGF和FN蛋白质表达分别下降61%、50%和51%(P<0·01),小管间质区CTGF免疫染色阳性面积减少44·9%(P<0·01)。肾皮质PPARγ表达增加18·1%(P<0·05)。结论外源PPARγ激动剂罗格列酮上调肾皮质PPARγ表达,并明显抑制糖尿病小鼠肾皮质和小管间质CTGF表达。     

转化生长因子β1对胰腺星状细胞中结缔组织生长因子基因的调控作用

目的 探讨转化生长因子β1(TGF-β1)对大鼠结缔组织生长因子(CTGF)基因启动子活性的调控作用。方法 将大鼠CTGF基因启动子片段与荧光素酶报告基因组成重组体pcTGF-luc。采用脂质体转染方法将该质粒转至原代分离并培养的2～5代大鼠胰腺星状细胞(PSCs)中,24h后分别在不同时间和不同浓度的体外CTGF-β1刺激下用Dual-luciferase报告系统检测相应荧光素酶的活性。结果 TGF-β1表现为以剂量和时间依赖的方式上调PSCs中CTGF基因启动子活性,TGF-β1在短时间内即可使CTGF基因启动子活性明显增高,并达到高峰,且能有效地保持至36h左右。结论 在PSCs中,TGF-β1主要在转录水平调节CTGF表达,较小浓度和较短时间即可使CTGF启动子活性增强。     

Rg1、Rb1对糖尿病肾病大鼠肾结缔组织生长因子的影响

目的:探讨Rg1、Rb1对糖尿病肾病(DN)大鼠肾结缔组织生长因子(CTGF)蛋白表达的影响。方法:雄性SD大鼠75只,按体质量随机分为正常组10只,模型组65只。模型组大鼠按55 mg/kg体质量腹腔一次性注射链脲佐菌素,72 h后血糖≥16.7 mmol/L,尿糖≥4"+"者为糖尿病造模成功。将造模成功的大鼠按血糖高低随机分为模型组、厄贝沙坦组、Rg1大剂量组、Rg1小剂量组和Rb1组。用药12周,处死大鼠无菌取肾,行肾组织HE、Mallory染色,观察各生化指标和肾组织病理形态学改变,采用免疫组化方法分析肾组织CTGF蛋白的表达情况。结果:模型组肾组织表现为DN病理改变;正常组及用药组肾小管上皮细胞、肾间质细胞胞浆有轻度CTGF表达,模型组CTGF则呈强阳性表达,Rg1、Rb1组CTGF表达较模型组明显减少(P<0.05)。结论:Rg1、Rb1可通过对肾组织CTGF蛋白表达下调而发挥治疗和预防糖尿病肾病的作用。