大肠杆菌头孢哌酮抗性基因亚克隆及序裂初步分析

为了确定耐药质粒所编码β－内酰胺酶衍化类型,用人介入临床分离出一大肠杆菌耐药质粒ｐＦＣ包哌酮抗性基因,经分段亚克隆,构建重组质粒ｐＦＢ１、ｐＦＢ２、ｐＦＢ３,对上述３个重要闰分别测序获得的抗生基因序列经Ｉｎｔｅｒｎｅｔ互联网同源性检索,表明该抗性基因部分序列,与肺炎克雷伯氏菌编码超广谱β－内酰胺酶ＴＥＭ－５２的抗性基因序列存在高度同源性（９７％）,提示ｐＦＣ头孢哌酮抗性基因所编码的β－内酰胺酶可能     

大肠杆菌耐药质粒的头孢哌酮抗性基因克隆和定位

用鸟枪法从耐药质粒ｐＦＣ上克隆到头孢哌酮抗性基因。快速小规模制备质粒ＤＮＡ进行限制性酶切分析鉴定含重组质粒的克隆株，经多次传代，克隆株抗性表达稳定。多种限制性内切酶谱分析并构建重组质粒的物理图谱与质粒ｐＦＣ物理图谱比较，定位出头孢哌酮抗性基因在ｐＦＣ物理图谱上３２ｋｂ至４８ｋｂ区间内，其分子量约１６ｋｂ。该基因包含有ＥｃｏＲⅠ、ＳｍａⅠ、及ＰｖｕⅡ位点。     

大肠杆菌耐药质粒的头孢哌酮抗性基因克隆和定位

用鸟枪法从耐药质粒ＰＦＣ上克隆到头孢哌酮抗性基因，快速小规模制备质粒ＤＮＡ进行限制性酶切分析鉴定含重组质粒的克隆株，经多次传代，克隆株抗性表达稳定。多种限制性内切酶谱分析并构建重组质粒的物理图谱与质粒ｐＥＣ物理图谱比较，定位出头孢哌酮抗性基因在ｐＥＣ物理图谱上３．２ｋｂ至４．８ｋｂ区间内，其分隔量约１．６ｋｂ。     

耐头孢哌酮的E. coli HX88108株的β-内酰胺酶研究

近年国外报道许多对第三代头孢菌素耐药的细菌是由于产生新的β－内酰胺酶所致。为探讨耐头孢哌酮的Ｅ．ｃｏｌｉＨＸ８８１０８及其４株转化菌ｐＦＣ、ｐＦＴ１、ｐＦＴ２、ｐＦＴ３的β－内酰胺酶性质，进行了β－内酰胺酶底物轮廓测定，酶抑制剂棒酸和舒巴坦敏感性研究以及薄层分析性等电聚焦电泳。结果显示：Ｅ．ｃｏｌｉＨＸ８８１０８及转化菌ｐＦＣ、ｐＦＴ１酶能有效水解第三代头孢菌素的头孢哌酮，对青霉素及第一、二代头孢菌素有较强的水解作用；ｐＦＴ２和ｐＦＴ３酶对青霉素类水解作用较强，对头孢菌素水解作用较弱；酶抑制剂对ＨＸ８８１０８、ｐＦＴ１、ｐＦＴ２和ｐＦＴ３的酶抑制作用强，而对ｐＦＣ酶抑制作用较弱。Ｅ．ｃｏｌｉＨＸ８８１０８含有三个不同等电点的β－内酰胺酶，ＰＩ分别为５．２５、５．３和５．６。为此，我们推测Ｅ．ｃｏｌｉＨＸ８８１０８质粒编码的β－内酰胺酶可能系ＴＥＭ家族新成员。     

莱姆病螺旋体中国分离株外膜蛋白C基因的克隆与序列分析

目的了解引起我国莱姆病的伯氏疏螺旋体外膜蛋白Ｃ（ＯｓｐＣ）基因变异情况。方法应用聚合酶链反应从２株莱姆病螺旋体中国分离株ＢＴ０１和ＢＪ－９０１１全基因组ＤＮＡ中将ＯｓｐＣ基因调出,并插入质粒ｐＧＥＭ－３ＺＦ（＋）中,构建重组质粒ｐＧＥＭ－３ＺＦ（＋）－ＯｓｐＣ,经Ｓａｎｇｅｒ双脱氧末端终止法测序,并将之与国外其它分离株进行同源性比较。结果除信号肽序列外,２株莱姆病螺旋体分离株ＢＴ０１和ＢＪ－９０１１的ＯｓｐＣ基因依次为５７９ｂｐ和５７６ｂｐ,分别编码１９３和１９２氨基酸,两者核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为８６％和８３％,与国外分离株（ＰＢｉ、ＰＫｏ及Ｂ３１）的同源性均较高,其中ＢＪ－９０１１株与国际标准株Ｂ３１株之间核苷酸及氨基酸同源性达９９％。结论伯氏疏螺旋体Ｏｓ－ｐＣ基因在国内２个分离株之间存在一定差异,其与国外分离株之间也存在一定差异     

TNF,IFN,MHCⅠ类分子基因“正反馈”式放大表达的重组腺病毒载体

目的：为使外源性 Ｔ Ｎ Ｆ, Ｉ Ｆ Ｎ 基因和内源性主要组织相容性复合物Ⅰ类（ Ｍ Ｈ ＣⅠ）分子基因表达呈现“正反馈”式放大效 应,构建在 Ｈ Ｌ Ａ Ｂ７ 启动子调控、 Ｉ Ｒ Ｅ Ｓ连接下协同表达 Ｔ Ｎ Ｆα和 Ｉ Ｆ Ｎβ基因的重组腺病毒载体。方法和结果：从ｐ Ｇ Ｌ３ Ｂ７ Ｔ Ｎ Ｆ及ｐ Ｉ Ｒ Ｉ Ｆ中切下 Ｂ７ｐｒｏ Ｔ Ｎ Ｆ和 Ｉ Ｒ Ｅ Ｓ Ｉ Ｆ Ｎβ基因片段,先后插入ｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｓｋ （＋ ）, 构建成ｐ Ｂ Ｌ Ｂ７ Ｔ Ｎ Ｉ Ｒ Ｉ Ｆ。回收 Ｔ Ｎ Ｆα Ｉ Ｒ Ｅ Ｓ Ｉ Ｆ Ｎβ基因片段,连入 Ａｄ Ｃ Ｍ Ｖ Ｌｉｎｋ１ 中,构建成 Ｃ Ｍ Ｖ 启动子驱动表达的 Ａｄ Ｃ Ｍ Ｖ Ｔ Ｎ Ｉ Ｒ Ｉ Ｆ（＋ ）。回收 Ｂ７ｐｒｏ Ｔ Ｎ Ｆ Ｉ Ｒ Ｅ Ｓ Ｉ Ｆ Ｎβ基因片段,连入缺失 Ｅ１ 和 Ｅ３ 区及启动子的 Ａｄ ＢｇｌⅡ中, 构建成 Ｈ Ｌ Ａ Ｂ７ 启动子驱动表达的 Ａｄ Ｂ７ Ｔ Ｎ Ｉ Ｒ Ｉ Ｆ（－ ）。结论：此两种载体为“正反馈”式放大肿瘤免疫原性提供一条新途径。     

柯萨奇B组病毒3型VP1基因疫苗免疫效果的研究

目的 为研制防治病毒性心肌炎的基因疫苗打下基础。 方法 以带有ＣＶＢ３Ｐ１、Ｐ２区核酸序列的ｐＧＥＭ质粒为模板，用ＰＣＲ方法克隆ＣＶＢ３ＶＰ１基因ｃＤＮＡ，插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３中的ＨｉｎｄⅢ和ＸｂａＩ位点之间，构建成重组质粒。经大量扩增纯化后，肌肉注射免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠３次，用ＣＶＢ３毒株攻击小鼠，取血及脾细胞检测其免疫效果。 结果 小鼠经３次免疫后，虽未测出明显免疫应答指标，但诱导了Ｔ     

PCR克隆EB病毒潜伏膜蛋白-1基因

目的：构建ＥＢ病毒潜伏膜蛋白－１重组表达质粒。方法：ＰＣＲ克隆技术,即用ＰＣＲ方法从Ｂ９５－８细胞中钓出ＥＢ病毒ＬＭＰ１基因ＤＮＡ序列,然后定向克隆到真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３．１中,以此构建成ｐｃＤＮＡ３．１－ＬＭＰ重组质粒。结果：经酶切鉴定,确定已获得重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１ＬＭＰ１。结论：在真核表达质粒中已成功地克隆了ＥＢ病毒ＬＭＰ１基因。     

基因免疫诱导小鼠产生抗丙型肝炎病毒E2糖蛋白抗体

目的：通过基因免疫诱导ＢＡＬＢ／ｃ小鼠产生抗Ⅲ型中国株ＨＣＶ来源Ｆ２糖蛋白的体液免疫应答，方法：质粒ｐ３Ｗ１４在ＮＩＨ３Ｔ３细胞中能够表达Ｅ２糖蛋白，纯化该质粒并用于ＢＡＬＢ／ｃ小鼠直接肌注，于加强注射后不同时相采血，以重组的Ｅ２糖蛋白检测特异性抗Ｅ２抗体。结果；接种ｐ３Ｗ１４质粒的小鼠中检出抗Ｅ２抗体（５／６），抗体滴度１：１５～１：１２０。结论；采用含Ｅ２／ＮＳ１基因的质粒ＤＮＡ免疫，成功地诱     

莱姆病螺旋体83kd抗原蛋白基因特异性区段真核及原核表达型载体的构建

从莱姆病螺旋体染色体编码８３ｋｄ抗原蛋白（Ｐ８３）基因序列中选择编码近Ｃ端１５９个氨基酸的基因序列作为扩增的靶序列，自行设计并合成一对寡核苷酸引物，以莱姆病螺旋体Ｂ３１株基因组ＤＮＡ为模板，通过ＰＣＲ扩增得到约４７７ｂｐ的扩增片段，再把该片段与质粒载体ｐＢＫ－ＣＭＶ进行重组，经鉴定得到重组质粒ｐＢＸ１。重组质粒ｐＢＸ１可同时在真核和原核细胞中表达，其表达产物可用来制备莱姆病血清学诊断用的标准抗原；该重组质粒也可用来制备用于对莱姆病螺旋体进行分类鉴定的核酸探针。     

Tropic 1808基因在大肠杆菌中的表达

目的;在大肠杆菌宿主系统中表达Ｔｒｏｐｉｃ１８０８基因编码的蛋白。方法：用ＰＣＲ方法从质粒中扩增出Ｔｒｏｐｉｃ１８０８ｃＤＮＡ开放阅读框架片段,并重组人表达载体ｐＥＴ－２１ａ中,转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,用ＩＰＴＧ诱导Ｔｒｏｐｉｃ１８０８融合蛋白的表达,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,表达蛋白条带转至ＰＶＤＦ膜进行氨基酸序列分析,结果：构建了ｐＥＴ－２１ａ－１８０８重组质粒,外源性Ｔｒｏｐｉｃ１８０８基     

PDGF—B基因的膜型表达产物促进血管平滑肌细胞增殖和胶原合成

考察ＰＤＧＦ－Ｂ基因的膜型表达产物对血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣｓ）增生、胶原合成的影响。制备供转导人ＰＤＧＦ－Ｂ基因的重组逆转录病毒，感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，受染ＮＩＨ３Ｔ３细胞经筛选、扩增后，制备细胞膜上表达产物ＰＤＧＦ－ＢＢ以观察其对ＶＳＭＣｓ生长的影响，并以３Ｈ－ＰｒｏＬｉｎｅ掺入率评估该重组蛋白对ＶＳＭＣｓ胶原合成的影响。结果：重组逆转录病毒介导ＰＤＧＦ－Ｂ基因转移并表达出具有生物学活性的重组ＰＤＧＦ－ＢＢ，免疫荧光细胞化学染色证实其表达；该膜型重组蛋白可促进ＶＳＭＣｓ增殖和胶原合成。     

人巨细胞病毒p52蛋白基因的克隆及表达

目的制备人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）ｐ５２蛋白特异性抗原。②方法用ＰＣＲ技术扩增ＨＣＭＶｐ５２蛋白ＩｇＭ抗原决定簇编码区ＤＮＡ片段，克隆到表达载体ｐＢＶ２２０中，转化Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α株，用氨苄青霉素抗性和质粒酶切图谱分析法筛选阳性克隆，经温控诱导其表达。③结果重组克隆能有效表达天然蛋白ｐ５２，ＥＬＩＳＡ检测重组ｐ５２蛋白具良好的抗原特异性。④结论通过基因工程制备的重组ｐ５２蛋白可作为ＨＣＭＶ血清学诊断的良好抗原。     

重组人促红细胞生成素cDNA在CHO-dhfr-细胞中的高效表达

目的：使重组人促红细胞生成素（ｒｈＥＰＯ）在ＣＨＯ细胞中获得高效表达。方法：利用基因重组构建了两个人促红细胞生成素ｃＤＮＡ重组表达质粒ｐＥＤ－ＥＰＯ和ｐＥＦ－ＥＰＯ，分别用ＤＥＡＥ－ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞，作瞬时高表达，选ｐＥＦ－ＥＰＯ用磷酸钙共沉淀法转染ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－细胞，加入氨甲喋呤（ＭＴＸ）扩增、选择，作稳定性高表达。结果：ｐＥＤ－ＥＰＯ和ｐＥＦ－ＥＰＯ转染ＣＯＳ７细胞后７２ｈ表达量分别为１７．８和２１．０ｎｇ／ｍｌ，ｐＥＦ－ＥＰＯ转染ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－细胞，随着ＭＴＸ浓度的增加，ＣＨＯ－ｄｈｆｒ＋的克隆数减少，而混合克隆的ＥＰＯ表达量逐渐升高。筛选了一株稳定性高表达ｒｈＥＰＯ的细胞株，其３ｄ表达量为１６μｇ／ｍｌ。结论：ｒｈＥＰＯ在ＣＨＯ细胞中获得了高表达     

人乳头瘤病毒HPV16L1-E7C重组腺病毒载体的构建

采用ＰＣＲ方法,从ＨＰＶ１６型野毒株质粒中分离出ＨＰＶ１６Ｌ１（５５５９７１５１ｂｐ）、ＨＰＶ１６Ｅ７Ｃ（６８２８５５ｂｐ）基因片段,采用ＰＣＲ产物的ＴＡ克隆法,将Ｌ１、Ｅ７Ｃ分别插入ｐＧＥＭＴＥａｓｙ载体,构建克隆载体ｐＴＡＬ１、ｐＴＡＥ７Ｃ。ＢａｍＨⅠ、ＨｉｎｄⅢ酶切ｐＴＡＥ７Ｃ,Ｂｇ１Ⅱ、ＣｌａⅠ酶切ｐＴＡＬ１,回收Ｌ１、Ｅ７Ｃ片段,利用ＢａｍＨⅠ、Ｂｇ１Ⅱ酶切产生相同粘末端的特点,产生Ｌ１Ｅ７Ｃ重组基因片段,将其克隆入质粒ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔｓｋ,构建了ｐＢＳＬ１Ｅ７Ｃ重组克隆质粒,ＨｉｎｄⅢ、ＸｈｏⅠ酶切ｐＢＳＬ１Ｅ７Ｃ,释放Ｌ１Ｅ７Ｃ基因片段,定向重组入ｐＣＡ１４腺病毒载体,成功构建真核表达载体ＨＰＶ１６Ｌ１Ｅ７Ｃ重组腺病毒载体：ｐＣＡ１４Ｌ１Ｅ７Ｃ,为研制ＨＰＶ１６Ｌ１Ｅ７Ｃ重组Ａｄ５载体疫苗和ＨＰＶ１６Ｌ１Ｅ７Ｃ嵌合蛋白疫苗打下基础     

抗人TGFα发夹状核酶基因逆转录病毒表达载体的构建及鉴定

构建抗和ＴＧＦα核酶基因逆转录病毒表达载体。方法；用二异丙基亚磷酰胺法合成抗人ＴＧＦα核酶基因的两条互补单链，将其退火后克隆ｐＵＣ１８，用ＥｃｏＲＩ及ＢａｍＨＩ切下该基因，定向克隆人逆转录病毒表达载体ｐＤＯＲ。结果；酶切后经琼脂糖凝主聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明，所构建重组克隆载体ｐＵＣ１８ＴＲＺ及重组表达载体ｐＤＯＲＴＲＺ正确。     

编码耐热邻苯二酚2,3-双加氧酶的pheB基因在大肠杆菌中的亚克隆与高表达

目的：构建ｐｈｅＢ基因高表达菌株，研究酶的耐热机制。方法与结果：通过ＰＣＲ扩增方法，对位于质粒ｐＦＤＡ１３上的ｐｈｅＢ基因进行扩增，克隆于ｐＵＣ１１８Ｎ和ｐＵＣ１１９Ｎ上，经双向测序，证明ＰＣＲ过程中并未发生突变，然后亚克隆于高表达载体ｐＪＬＡ５０３，转化Ｅ．ｃｏｌｉＴＧ１，经４２℃诱导，获得了高表达的基因产物，表达量占细菌总蛋白的３４．６％。并与ｘｙｌＥ基因编码的邻苯二酚２，３双加氧酶作了耐热性比较。结论：ｐｈｅＢ基因在大肠杆菌中获得了高表达，高表达后重组酶的耐热性未发生改变。     

丙肝病毒非结构蛋白基因3的克隆及其体外诱导表达

目的：研究丙型病毒非结构蛋白基因３（ｎｓ３基因）在体外真核细胞中的诱导表达。方法：以ＰＣＲ方法从含ＨＣＶｎｓ３基因的重组载体ｐＢｎｓ３中扩增出ｎｓ３基因,并将其插入到克隆载体ｐＧＥＭ－Ｔ中,再与表达载体ｐＭＳＧ重组,以利到重组表达载体ｐＭＳＧ－ｎｓ３。然后采用磷酸钙沉淀法将其转染哺乳动物ＣＨＯ细胞,经地塞米松（ＤＭ）诱导,采用ＥＬＩＳＡ及Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ技术检测ＮＳ３蛋白的表达水平。结果：     

HCV核心蛋白DNA疫苗诱导的小鼠体液免疫应答

目的：观察丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心蛋白ＤＮＡ疫苗诱导ＢＡＬＢ／ｃ小鼠体液免疫应答的效力，为研制应用于人类的ＨＣＶ ＤＮＡ疫苗提供实验依据。方法：将全长ＨＣＶ核心蛋白基因插入真核表达质粒载体ｐｃＤＮＡ３．１，构建ＨＣＶ核心蛋白重组表达质粒ｐｃＤＮＡ３．１ＨＣＶｃｏｒｅ，肌注ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，以ＥＬＩＳＡ法检测小鼠血清ＨＣＶ抗体。以此重组质粒转染小鼠ＮＩＨ３Ｔ３细胞，以ＨＣＶ抗体阳性小鼠血清为捕获抗     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白—2基因克隆及其在大肠杆菌中 …

目的：克隆恶性疟原虫裂殖子表面蛋白２全基因,并在大肠杆菌中进行表达。方法：采用ＰＣＲ扩增恶性疟原虫ＦＣＣ－１／ＨＮ株ＭＳＰ２基因,克隆插入ｐＵＣ１９,并重组人表达质粒载体中,转化大肠杆菌,诱导重组质粒ｐＢＫ－ＣＭＶ／ｍｓｐ２表达ＭＳＰ２蛋白抗原,对表达产物进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｗｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定。结果：ＰＣＲ扩增出８２４ｂｐＤＮＡ片段,经酶切鉴定和部分序列测定证实为Ｍ