LAMP法检测耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌OXA-23基因的研究

目的建立一种简便、快速、特异、灵敏的耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌(CRAB)OXA-23基因分子检测方法,并用于临床标本检测,以便了解产OXA-23酶CRAB的耐药分布状况。方法运用环介导等温扩增技术(LAMP),利用PrimerExplorer 4.0软件设计一套特异引物检测CRAB的OXA-23基因。通过优化LAMP检测方法的实验条件,应用SYBR Green I作为LAMP反应荧光显色物质,然后通过肉眼目测或电泳检测比较结果。同时,应用LAMP检测该院自2013年12月至2014年3月收集分离的41株多重耐药鲍曼不动杆菌。结果 CRAB的OXA-23基因菌株LAMP反应电泳产生了阶梯状条带,而其他不同菌株和阴性对照没有条带;向扩增产物中加入1μL SYBR GreenⅠ,CRAB的OXA-23基因菌株LAMP扩增产物的颜色由橙色变为绿色,而其他不同菌株和阴性对照仍为橙色;并检测出CRAB的OXA-23基因菌株纯培养物的灵敏度达到了5cfu/μL。对41株我院分离的多重耐药鲍曼不动杆菌进行LAMP检测,检出OXA-23基因32株,检出率为78.04%。结论该院分离的CRAB OXA-23基因的携带率较高,对常用抗菌药物有非常高的耐药率;本研究建立的LAMP技术检测CRAB OXA-23基因是一种简便、快速、特异、灵敏的耐药鲍曼不动杆菌检测方法,适于基层单位推广使用,对临床医生合理选择抗生素具有重要意义。     

海洋创伤弧菌LAMP快速诊断方法的建立与评价

目的利用环介导等温扩增(LAMP)技术,建立海洋创伤弧菌快速、简便、特异且敏感的检测方法,并对该方法的特异性和灵敏度进行评价。方法选取海洋创伤弧菌溶细胞素(vvhA)基因作为靶基因,根据GenBank公布的序列设计4条LAMP引物;对47株细菌(包括20株弧菌属细菌)进行LAMP和聚合酶链式反应(PCR)扩增,并做特异性比较;对创伤弧菌M06株增菌液10倍倍比稀释,提取DNA后进行灵敏度的检测,并与常规PCR作比较;构建含vvhA基因片段的重组质粒,作为LAMP反应体系的标准阳性对照。结果常规PCR实验出现假阳性结果,而LAMP实验只有海洋创伤弧菌出现阳性扩增,其他样品均为阴性,无假阳性和假阴性结果,表明引物的特异性较好,加入钙黄绿素和电泳结果相一致;针对vvhA基因建立的LAMP技术其最低检测下限为每个反应4×10CFU,是常规PCR(每个反应4×10~2 CFU)的10倍,呈现较好的灵敏度。重复实验过程两遍,PCR和LAMP技术检测结果稳定。结论建立了一种用于检测海洋创伤弧菌的LAMP检测方法,该方法特异性强,灵敏度高,方便快捷,特别适合用于现场和床旁的快速检测。     

定量PCR诊断Down''''s综合征方法比较

目的 比较两种染料进行定量PCR检测Down’s综合征时的特点。方法 采用PCR方法同时扩增人肝型磷酸果糖激酶基因(PEKL—CH21)和人肌型磷酸果糖激酶基因(PEKM—CHI)，分别用SYBR Green I和银染两种染料处理扩增产物，琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳-银染后在凝胶成像系统进行分析，得出扩增产物的荧光强度对比值。以吸光度理论比值为标准，分别比较两种荧光染料的敏感性、特异性。结果 SYBR Green I和银染两种染料进行定量PCR诊断26例Downs综合征患者和20例正常人其敏感性、特异性均为100％，两种染料检测结果无差别。结论 SYBR Green I是一种敏感、特异、实用、低毒的荧光染料。     

沙门菌、志贺菌和副溶血性弧菌的多重PCR快速检测技术的建立与应用

目的建立快速同时检测沙门菌、志贺菌和副溶血弧菌的多重聚合酶链反应(PCR)技术。方法根据沙门菌hilA基因、志贺菌ipaH基因及副溶血性弧菌tdh基因序列设计引物,进行PCR扩增及电泳检测。同时优化反应体系,测定特异性和灵敏度。结果该多重PCR技术能在8 h内同时检测3种目的菌,通过检测其他9种常见食源性致病菌,结果表明该方法特异性好,多重PCR检测灵敏度分别为:沙门菌104cfu/mL,志贺菌102cfu/mL,副溶血性弧菌104cfu/mL。并进行了人工模拟食品和粪便样品的检测。结论初步建立能在8h内快速、灵敏、特异地同时测定沙门菌、志贺菌和副溶血性弧菌的多重PCR检测技术。     

副溶血弧菌的gyrB基因环介导的恒温扩增技术检测方法的研究

目的建立一种适合基层实验室应用和开展的快速检测副溶血弧菌的DNA环介导的恒温扩增法(LAMP)。方法针对副溶血弧菌的IgyrB/I 基因序列设计了4条引物（2条内引物、2条外引物）,并对扩增反应条件进行了优化。结果整个检测过程仅需1.5 h,可通过肉眼目测或电泳检 测判断结果;对3株种系背景明确的副溶血弧菌不同实验对照株、23株副溶血弧菌地方分离株和32株其他肠道菌进行了检测,具有很高的特异性 ;该方法的最低检测限为24 cfu/ml,具有良好的敏感性;应用于61份贝类海产品的现场检测,阳性率为100%,与实时荧光定量PCR方法的检测 结果相符,阳性率高于传统的培养鉴定方法。结论本方法具有快速、灵敏、特异、简便、经济等特点,适合基层实验室、应急检测或现场监测 等使用,具有较高的推广价值。     

沙门菌、志贺菌和副溶血性弧菌的多重PCR快速检测技术的建立与应用

目的建立快速同时检测沙门菌、志贺菌和副溶血弧菌的多重聚合酶链反应（PCR）技术。方法根据沙门菌hilA基因、志贺菌ipaH基因及副溶血性弧菌tdh基因序列设计引物，进行PCR扩增及电泳检测。同时优化反应体系，测定特异性和灵敏度。结果该多重PCR技术能在8h内同时检测3种目的菌，通过检测其他9种常见食源性致病菌，结果表明该方法特异性好，多重PCR检测灵敏度分别为：沙门菌10^4cfu／mL，志贺菌10^2cfu／mL，副溶血性弧菌10^4cfu／mL。并进行了人工模拟食品和粪便样品的检测。结论初步建立能在8h内快速、灵敏、特异地同时测定沙门菌、志贺菌和副溶血性弧菌的多重PCR检测技术。     

LAMP技术在医学检验中的应用

环介导等温扩增(loop-mediated-isothermal-amplification LAMP)技术是近年来发展的一种灵敏、特异、快速的新型基因检测与核酸扩增技术,与传统的PCR方法相比,LAMP不需要热循环,为等温扩增,其检测结果可以通过加入核酸染料SYBR GREEN进行肉眼观察或浊度计即可判定结果.因此,LAMP是一种不需要热循环仪,肉眼即可判定结果的高度特异性,和敏感的DNA扩增技术,适用于现场,基层条件较差的实验室进行病原微生物的快速检测.本文就近年来LAMP/LAMP-RT技术在医学检测中的应用做一综述.     

两种核酸检测法在副溶血性弧菌耐热直接溶血素和不耐热溶血毒素中的应用评估

目的 比较CPA-核酸试纸条法与荧光定量PCR法检测副溶血性弧菌（VP）的tlh种特异性基因和tdh毒力基因的灵敏度与特异性。方法 采用CPA-核酸试纸条法和荧光定量PCR法同时对655株不同来源的VP菌株进行tlh、tdh基因检测。结果 CPA-核酸试纸条法与荧光定量PCR法检测结果相同,VP菌株的tlh基因检测阳性率均为100%（655/655）。两种方法对tdh基因的检测结果也完全一致,tdh基因临床株与海产品株阳性检测率均分别为95.8%（207/216）与2.27%（10/439）。CPA-核酸试纸条法对tlh、tdh基因检测具有高度特异性,灵敏度可达6.2103 cfu/ml菌液,从核酸制备至完成检测最快仅需1 h。结论 VP临床株与涉水产品分离株普遍携带tlh种特异性基因,而tdh毒力基因主要存在于临床标本而在涉水产品株极少存在,可采用敏感、特异的CPA-核酸试纸条法,做VP腹泻患者的床边诊断以及食物中毒事故现场的快速检测。     

Taqman-探针荧光定量PCR鉴定副溶血弧菌方法的建立

目的 建立一种Taqman荧光定量PCR鉴定副溶血弧菌的方法。方法 以副溶血弧菌标准株(ATCC-VPJS421)和其它常见致病菌标准株为研究对象,通过Gene Bank获取toxR基因的序列,采用生物信息学软件设计特异性PCR引物及Taqman探针,在SLAN 96P荧光定量PCR仪进行扩增检测,评价该检测方法的特异度和灵敏度。结果 ①设计的引物能够扩增出特异性条带; ②扩增体系中0.5 μl探针的扩增效果优于1.0 μl探针; ③Taqman-探针荧光定量PCR检测方法对副溶血弧菌toxR基因的检测灵敏度为10^-1 mg/L; ④在检测粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、霍氏肠杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、梅氏弧菌和弗尼斯弧菌等10种常见致病菌时未出现阳性扩增,特异度为100%。结论 成功建立Taqman探针荧光定量PCR鉴定副溶血弧菌的方法,该方法特异度、灵敏度均较好,适用于副溶血弧菌的快速检测,具有良好的应用价值。     

茎环引物的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测miR-155表达及其临床初步应用

目的建立茎环状逆转录引物（简称茎环引物）的SYBR GreenⅠ实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）,并作初步应用。方法应用SYBR GreenⅠ实时FQ-PCR检测CD4＋T细胞株的miR-155,初步验证方法的可行性。用所建立的方法对60份临床宫颈刮取物标本进行检测,分析miR-155与宫颈癌及感染的高危型人类乳头状瘤病毒（HPV）基因型别的关系,其聚合酶链反应（PCR）反应产物通过电泳验证产物特异性。结果所建方法能特异的检测到miR-155的扩增信号,最低检出限为10^-7nmol/L,在10^-1-10^-6nmol/L之间有良好的线性关系,相关系数（r）为0.99,扩增后惟一的熔解曲线特异峰显示很好的特异性。CD4^＋T细胞株及60例临床宫颈刮取物标本miR-155均显示阳性,PCR反应产物电泳可获得单一条带。宫颈刮取物miR-155与宫颈癌有关（P〈0.05）,但与本研究涉及的HPV基因型别无关（P〉0.05）。结论所建立的茎环引物的SYBR GreenⅠ实时FQ-PCR能快速、敏感、特异地检测细胞株和临床宫颈刮取物miR-155的表达水平,为进一步研究miR-155及其临床应用奠定了基础。     

环介导等温扩增检测肺炎链球菌方法的建立及临床应用

目的 建立环介导等温扩增(LAMP)快速检测肺炎链球菌的方法.方法 根据美国国家生物信息中心(GenBank)上提交的肺炎链球菌R6株的lytA基因序列(登录号AF2)08540)设计特异LAMP引物,以盐酸胍一苯甲醇法提取阳性血培养瓶中细菌DNA,然后以LAMP技术扩增lytA基因,反应条件为63℃45 min,采用肉眼观察浊度和琼脂糖电泳的方法来观察结果.结果 在196份阳性血培养瓶中,采用LAMP法检测到肺炎链球菌16株,与传统方法比较,其检测肺炎链球菌的灵敏度和特异度均达到100%,且检测时间缩短为1 h左右.模拟标本的检测结果显示该方法的最低检测限为102CFU/ml.结论 该方法灵敏度高,特异性强,操作方便快速,适合从临床标本中检测肺炎链球菌.     

Application of a loop-mediated isothermal amplification method for the detection of pathogenic Leptospira

Leptospirosis is an emerging infectious disease, which is considered to be the most widespread zoonotic disease in the world. There are more than 230 known serovars in the genus Leptospira. A loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for the rapid detection of pathogenic Leptospira spp. was developed and evaluated through amplification of the lipL41 gene coding for the outer membrane protein LipL41. The LAMP assay did not rely on the isolation and culture of leptospires, and no cross-reactivity was observed with other bacterial species. A SYBR Green I-based LAMP assay was also carried out for the real-time detection of DNA amplification. The lower detection limit of the LAMP assay was approximately 100 copies, which was the same as the polymerase chain reaction (PCR) and real-time PCR assays. The accuracy of the LAMP reaction was confirmed by restriction endonuclease analysis of the amplified product. The LAMP assay is easy to perform and inexpensive, and so may be applied in the rapid and specific diagnosis of Leptospira.     

建立实时荧光LAMPA法检测肺炎支原体

目的:建立实时荧光环介导等温扩增(LAMP)法检测肺炎支原体。方法:在LAMP体系中添加适量荧光染料SYTO-9,通过实时定量PCR仪监测LAMP反应结果。以肺炎支原体P1基因重组质粒制备一系列浓度标准品,分别使用实时荧光LAMP法和SYBR GreenⅠ染料LAMP法检测,比较2种方法的检出限。肺炎支原体M129标准株菌液以10倍梯度稀释,分别以实时荧光LAMP法和肺炎支原体荧光PCR试剂盒检测,比较2种方法灵敏度。以实时荧光LAMP法检测常见呼吸道感染病原体肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌基因组DNA,评估该方法特异性。采集疑似肺炎支原体感染患儿咽拭子标本,分别以实时荧光LAMP法和荧光PCR法检测,比较2种方法检出率差异。结果:实时荧光LAMP法可以检出P1基因最低限为103 copies/μL,当基因拷贝数大于104 copies/μL时,反应30 min样本组即可出现明显荧光信号。SYBR GreenⅠ染料LAMP法可以检出P1基因最低限为104 copies/μL,反应需1 h才可获得足够产物用于显色。实时荧光LAMP法灵敏度高于实时定量PCR法100倍,且对常见呼吸道病原体DNA无扩增。实时荧光LAMP法和荧光PCR法检测疑似肺炎支原体感染咽拭子标本的阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。结论:实时荧光LAMP法可以有效避免因开盖检测造成的气溶胶污染,反应时间短,灵敏度高,适于在基层医院中推广使用。     

Loop-mediated isothermal amplification assay targeting the ompA gene for rapid detection of Riemerella anatipestifer

A novel loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay was developed and evaluated for the detection of Riemerella anatipestifer (RA) infection. The LAMP assay exhibited a higher sensitivity than conventional polymerase chain reaction (PCR) and microbial isolation. The specificity of the assay was determined by restriction enzyme digestion of the LAMP products and detection of Escherichia coli, Salmonella enterica and Pasteurella multocida. The LAMP assay was able to detect RA effectively in samples of the reference strains, isolated strains and infected duck brains. This assay is a useful tool for the diagnosis of RA infection in the clinical setting.     

Application of loop-mediated isothermal amplification assay for the sensitive and rapid diagnosis of visceral leishmaniasis and post-kala-azar dermal leishmaniasis

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) is at the forefront in the search for innovative diagnostics for rapid and specific amplification of target DNA under isothermal conditions. We have applied LAMP assay using SYBR Green for clear-cut naked eye detection of Leishmania (Leishmania) donovani in 200 clinical samples of visceral leishmaniasis (VL) and post-kala-azar dermal leishmaniasis (PKDL). The assay was positive in 53/55 VL blood samples (sensitivity, 96.4%; 95% confidence interval [CI], 87.7–99%), 15/15 VL bone marrow aspirate samples (sensitivity, 100%; 95% CI, 79.6–100%), 60/62 PKDL tissue biopsy samples (sensitivity, 96.8%; 95% CI, 88.9–99.1%), and 1/68 control samples (specificity, 98.5%; 95% CI, 92.1–99.7%). The assay was specific for L. (L.) donovani, the causative species for VL and negative for L. (L.) infantum, L. (L.) tropica, and L. (L.) major. This is the first comprehensive clinical study demonstrating the applicability of the LAMP assay for a rapid and reliable molecular diagnosis of VL and PKDL.     

快速检测粪便中艰难梭菌的方法研究

目的建立可用于粪便中艰难梭菌快速检测的环介导恒温扩增(LAMP)方法。方法针对艰难梭菌毒素A基因,设计引物。采用LAMP对艰难梭菌和其他腹泻干扰菌及不同浓度艰难梭菌的扩增检测,对其特异性和灵敏度进行评价。同时采用LAMP和荧光定量PCR对100例疑似艰难梭菌感染的临床腹泻患者粪便进行检测,对两种方法进行比较。结果 LAMP对艰难梭菌及6种腹泻干扰菌的检测,只针对艰难梭菌有扩增,显示了较好的特异性。LAMP最低检测限为10CFU/mL,灵敏度较高。对100例临床粪便标本LAMP检测结果与荧光定量PCR比较差异无统计学意义(P>0.05,χ2=0.1429)。结论本研究建立的粪便中艰难梭菌的LAMP快速检测方法特异性好、灵敏度较高、操作简便,适用于艰难梭菌的临床快速检测及现场检测。     

SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR检测survivin甲基化状态

目的建立SYBR Green Ⅰ实时荧光聚合酶链反应（PCR）检测survivin甲基化的方法。方法25例胃癌组织标本及与其配对的正常胃组织经甲基化敏感性限制性内切酶HpaⅡ和MspⅠ处理后，再用SYBR GreenⅠ实时荧光PCR对survivin外显子1进行检测。实时荧光定量PCR检测survivin基因内含子2，用于监测经限制性酶消化的基因组DNA浓度变化，10倍系列稀释的基因组标准物用于检验实时PCR的敏感度，PCR产物通过凝胶电泳分析证实。结果经Hpa Ⅱ酶切后，甲基化的目的基因PCR产物在熔解曲线上有Tm值为（91．5±0．5）℃的峰，电泳证实为338bp的条带。所有经酶消化的样本都能扩增出以Tm值（79．5±0．5）℃为特征的对照基因（survivin基因内含子2），表明基因组DNA未产生严重的非特异性降解。SYBR GreenⅠ实时荧光PCR检测甲基化目的基因的灵敏度为10^0拷贝／μL。用以上新建的体系检测25例胃癌标本，发现其survivin基因外显子1的去甲基化频率为96％。结论SYBR GreenⅠ荧光PCR法具有快速、准确、敏感、实时、简单和敏感的特点，是检测survivin外显子1甲基化状态的一种可靠的新方法。     

高灵敏度等温扩增法可视化检测血液中的病毒核酸

目的探讨便携式、可灵敏、快速检测血液标本中病毒核酸的方法。方法以HBV病毒为例,针对其基因组保守序列设计特异性引物,采用环介导等温扩增法(LAMP)对待测HBV标本做核酸目标序列扩增,以高灵敏双链DNA嵌合荧光染料为指示剂,根据荧光信号指示扩增反应产物的有无;将本法与实时荧光PCR法对临床标本做HBV检测的对照分析。结果建立了血液病毒核酸的可视化检测方法,研制出扩增检测一体化仪器;灵敏度达到可在<1 h完成10 cp/管的HBV核酸扩增反应和产物检测。62例实时荧光PCR检测为HBV阳性的临床标本,本法亦都检测为阳性;而从42例实时荧光PCR检测为HBV阴性的临床标本中,本法检出了6例HBV阳性。结论所建立的方法和装置可实现高灵敏度单管快速检测血液病毒核酸,为特殊现场环境中的血液安全性筛查提供了新的手段。     

检测气单胞菌属的SYBR Green荧光PCR方法的建立和评价

目的建立一种检测气单胞菌的SYBR Green荧光PCR方法。方法使用文献报道的气单胞菌属16S rRNA基因扩增引物,建立SYBR Green荧光PCR检测方法,评价其特异性、灵敏度和实际应用价值。结果SYBR Green荧光PCR方法的检测下限为10–7 ng/ml,检测的21株气单胞菌均为阳性,检测的弧菌、大肠埃希菌、沙门菌、小肠结肠炎耶尔森菌、志贺菌均为阴性。 针对104份健康人群粪便样本,8.65%的样本分离到气单胞菌,28.85%的样本SYBR Green荧光PCR方法检测阳性。 其中8份标本采用2种方法检测均为阳性。 样本核酸检测阳性后再进行病原菌的分离,会漏检1份样本（11.11%）,但可以减少71.15%（74/104）的分离培养及鉴定工作。结论SYBR Green荧光PCR方法具有很好的特异性和敏感度,用于大样本的早期筛查可以减少70%左右的工作量,适合应用于气单胞菌感染和携带的监测。     

黄疸出血群钩端螺旋体LAMP-LFB快速检测方法的建立与应用

  目的   基于环介导恒温扩增（LAMP）结合纳米生物传感条（LFB）技术,建立并评价黄疸出血群钩端螺旋体（钩体）的LAMP-LFB快速检测方法。  方法   以黄疸出血群钩体O抗原基因簇中的糖基转移酶基因（gtf）为检测靶标并设计特异性LAMP引物。 通过对LAMP引物的特定标记（FIP-FAM和LF-Biotin）和优化试验,建立LAMP-LFB快速检测方法,并分析其灵敏度和特异性。 应用建立的LAMP-LFB、普通PCR方法和显微凝集试验（MAT）,分别对53株钩体分离菌株进行鉴定,比较分析鉴定结果并评价LAMP-LFB方法的实用性。   结果   灵敏度和特异性试验显示,LAMP-LFB方法可检出黄疸出血群赖型56601基因组DNA的最低浓度为100 fg/μL,检测特异性为100%,与其余血清群和非钩体菌株核酸无交叉反应。 菌株鉴定结果显示,LAMP-LFB与MAT鉴定结果完全一致,符合率为100%,其敏感性高于PCR方法。 此外,LAMP扩增产物经LFB验证,可直接通过观察检测线（TL）和质控线（CL）进行结果判定。  结论   基于gtf基因建立的LAMP-LFB检测技术方便、快捷且重复性好,可快速、灵敏、特异地鉴定黄疸出血群钩体菌株,能够作为有价值的黄疸出血群钩体菌株快速鉴别或诊断方法。