脑胶质瘤差异表达基因的微矩阵研究

目的 用生物芯片筛选胶质母细胞瘤相关基因。方法 采用一种由包括胶质瘤cDNA文库构建的14 000个基因片段的生物芯片来杂交筛选胶质母细胞瘤的基因并分析其表达谱的变化。结果 经过杂交筛选并与正常脑组织比较,94个基因差异表达超过3倍,298个基因片段超过2倍。一些胶质瘤中上调基因在正常脑组织中几乎没有表达。几个与胶质瘤发生发展相关的新基因被证实。结论 生物芯片结合相关的cDNA文库对大规模快速筛选胶质瘤及其他肿瘤的治疗靶基因具有实际意义。     

应用cDNA微阵列技术研究胶质母细胞瘤凋亡相关基因的表达

目的研究胶质母细胞瘤凋亡相关基因的表达。以探讨凋亡相关基因的异常表达在肿瘤的发生、发展过程中的作用。方法采用cDNA微阵列技术,研究胶质母细胞瘤与正常脑组织之间凋亡相关基因表达的差异。采用看家基因对杂交信号进行校正。差异大于1.5倍的基因视为差异有显著性意义,并从中选择6个基因采用RT-PCR进行验证。结果共有28个基因的表达存在差异,其中有17个基因在胶质母细胞瘤表达升高,11个表达下降。RT-PCR结果与基因芯片结果一致。结论众多凋亡相关基因参与了胶质母细胞瘤的发生和发展,其中部分基因如CRAF1、hHR23B等是新发现的与胶质母细胞瘤有关的基因。     

肾癌差异表达基因克隆的研究

目的 克隆并鉴定肾癌与正常肾之间差异表达的基因。方法 应用抑制性消减杂交技术构建人肾癌组织与正常肾组织差异表达的cDNA消减文库,并从中克隆鉴定出肾癌差异表达的基因。结果 构建成功了高消减效率的人肾癌cDNA消减文库,对其中5个克隆插入的cDNA片段进行测序后经Genbank检索表明,5个片段均为未知新序列,其中GYIZ-RCC18为3个拷贝,提示以上5个cDNA征段可能来自3个新基因。Northern杂交分析显示,GYIZ-RCC18在肾癌组织中有明显表达,而在正常肾组织中无表达,这证明GYIZ-RCC18是肾癌相关的新基因。结论 人肾癌cDNA消减文库的建立为进一步筛选,克隆肾癌特异性表达的新基因奠定了基础。     

乳腺癌相关差异表达基因的筛选及分析

目的构建乳腺癌组织与癌旁正常乳腺组织差异表达的cDNA消减文库,筛选乳腺癌相关基因并进行分析。方法应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术对15对乳腺癌组织及正常癌旁乳腺组织进行差异基因的消减,构建cDNA消减文库,并转化大肠杆菌进行文库扩增,采用数字表法随机挑选克隆经PCR鉴定后,对200个阳性克隆插入片段的序列进行测定及同源性分析。结果建立了乳腺癌差异表达片段cDNA消减文库;通过测序和同源性分析,得到173个差异表达基因,其中26个与肿瘤发生发展相关;26个基因中有15个已被文献明确报道在乳腺癌组织或细胞中有差异表达。结论应用SSH技术成功建立了乳腺癌差异表达基因cDNA消减文库,为乳腺癌的发病机制研究及寻找潜在的治疗靶点提供了有力的支持。     

应用抑制消减杂交技术筛选颞叶癫痫的相关基因

目的 构建颞叶癫痫大鼠海马组织差异表达基因的消减cDNA 文库,筛选颞叶癫痫的差异基因。方法 采用抑制消减杂交方法,以正常大鼠和癫痫大鼠的海马组织作为对比材料,分离组织中差异表达基因的cDNA 片段,将其与T载体进行T/A连接构建文库,将连接产物转化大肠杆菌进行文库扩增后,随机挑取100个白色克隆,用菌落PCR法筛选差异基因克隆,并进行测序分析。结果 获得14个在癫痫大鼠海马组织中有差异表达,并与大鼠的已知基因片段高度同源的基因。 结论 抑制消减杂交技术是一种高效的筛选差异表达基因的方法,颞叶癫痫大鼠海马组织中存在许多差异表达基因,为深入研究癫痫发病的分子机制提供重要线索。     

抑制性消减杂交法构建甲状腺癌差异表达基因文库

目的：筛选并克隆在甲状腺癌组织与正常甲状腺组织之间差异表达的基因。方法：(1)应用抑制性消减杂交(SSH)进行基因差示表达分析,构建人甲状腺癌组织与正常甲状腺组织之间差异表达的cDNA消减文库;(2)克隆、鉴定甲状腺癌组织特异性高／低表达的基因;(3)登录Genbank,运用Blastn程序进行同源性分析。结果：成功构建了高消减效率的人甲状腺癌cDNA消减文库,对其中数个克隆的插入cDNA片段进行测序,经检索Genbank表明,正向SSH产物中有3个片段与来源于结肠上皮腺癌和Lung Epidermoid carcinoma的EST有100％同源性,提示它们来自恶性肿瘤相关基因。反向SSH产物中有5个片段为未知新序列,提示它们可能来自于在甲状腺癌中特异性低表达的新基因。结论：通过抑制性消减杂交技术,构建了人甲状腺癌cDNA消减文库,为下一步筛选鉴定甲状腺癌特异性基因及其全长克隆、功能研究等工作打下了基础。     

传代培养前后内皮细胞差异表达基因消减cDNA文库的构建

目的:构建传代培养前后牛主动脉内皮细胞差异表达基因的消减cDNA文库,筛选动脉粥样硬化相关新基因构建文库. 方法:采用抑制消减杂交技术,以新鲜分离和传代培养的牛主动脉内皮细胞作为对比材料,分离传代培养主动脉内皮细胞中不表达或低表达基因的cDNA片段,将其与T载体进行T/A连接构建文库,将连接产物转化大肠杆菌进行文库扩增后,随机挑取64个白色克隆进行酶切鉴定. 结果:扩增消减cDNA文库获得760个克隆,随机挑取的64个阳性克隆经酶切后均有200～600 bp的插入片段. 结论:构建的传代培养前后内皮细胞差异表达基因消减cDNA文库,为进一步筛选早期发生改变的动脉粥样硬化相关基因奠定了工作基础.     

家族性急性髓系白血病差异表达基因的筛选与鉴定

目的分离家族性急性髓系白血病患者骨髓中差异表达的基因,在基因水平上探讨急性白血病发生发展的分子机制。方法应用Super SMART和抑制性消减杂交（SSH）技术,构建家族性急性髓系白血病cDNA消减文库;应用差异筛选技术进行差异表达片段的筛选与鉴定;测序结果进行BLAST同源性比对分析。结果成功构建了家族性急性髓系白血病cDNA消减文库;克隆、筛选并鉴定了17条基因片段,与已知基因同源,11条为未知基因片段。结论SSH技术是筛选差异表达基因的有效方法;获得多个与细胞增殖和分化相关的已知基因;获得11条新基因EST片段,并被GenBank收录。     

应用表达谱芯片研究胶质母细胞瘤相关基因的表达及功能

目的:应用基因表达谱芯片筛选研究人脑胶质母细胞瘤发生,发展中相关基因的表达及生物信息分析功能.方法:采用含13 939条基因(设置173个对照点)的BioStarH140S型表达谱芯片;用改良的"一步法"抽提2例正常脑及6例胶质母细胞瘤组织总RNA,制备杂交探针;杂交芯片后用ScanArray4000扫描芯片荧光信号,提取正常脑及胶质母细胞瘤组织差异基因;对差异基因进行生物信息分析,初步分类及Northern杂交研究.结果:按照差异显著标准,在胶质母细胞瘤中共有198条(1.42%)基因表达差异显著,其中77条(0.55%)表达上调,121条(0.87%)表达下调,55条新基因尚未在GenBank登录;生物信息分析发现肿瘤相关基因与细胞信号和传递蛋白、代谢、蛋白翻译合成、细胞骨架和运动、免疫、原癌基因和抑癌基因、细胞周期、细胞凋亡等9类基因密切相关;Northern杂交结果与表达谱芯片一致.结论:基因表达谱芯片可低成本、高通量、高效率筛选胶质瘤相关基因,并为基因群功能研究提供了方向;本研究结果有助于揭示胶质母细胞瘤分子机制,为指导肿瘤的临床诊断、治疗和预后判断提供依据.     

SSH方法对食管癌相关差异基因cDNA文库的建立及初步分析

目的建立河北省磁县具有家族史的食管癌组织与食管正常黏膜组织差异表达的cDNA消减文库,并初步筛选过度表达的食管癌差异基因。方法应用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)方法对10对食管癌组织及正常食管黏膜组织进行差异基因的消减、克隆、测序、鉴定。结果建立了食管癌差异表达片段cDNA消减文库;并进一步对初步筛选出的20个食管癌差异表达的基因进行测序和同源性分析,得出与肿瘤密切相关的基因10个,分别为锌指蛋白14、锌指蛋白66、肿瘤相关钙信号转运蛋白1,FMNL2基因、真核细胞转录延长因子1A1、肌小管相关蛋白6、Toll样受体10、次级淋巴趋化因子、细胞色素P450酶4F8、桥粒糖蛋白3。结论应用SSH技术成功建立食管癌差异表达基因cDNA消减文库,并获得10个在食管癌组织中过度表达的基因。     

利用抑制性消减杂交技术筛选大鼠哮喘相关基因

目的：利用哮喘大鼠模型筛选与哮喘发病相关的差异性表达基因。方法：采用抑制性消减杂交技术,以哮喘大鼠肺组织总RNA为检验子,对照大鼠肺组织总RNA为驱赶子,将消减杂交获得的DNA片断与pGEM—TEasyVector连接,构建cDNA文库后,转化大肠杆菌DH5a,筛选阳性克隆。将获得的阳性克隆插入片段进行测序分析,测序结果与GenBank数据库中cDNA和EST序列进行相似性比对,获得差异性表达基因的信息。结果：扩增消减cDNA文库获得300余个白色克隆,随即挑选36个测序,除去重复序列,结果中含有已知的基因4个,ESTs2个及与任何序列无同源性的新基因片段3个。结论：成功构建了哮喘大鼠肺脏差异性表达基因的正向消减cDNA文库,筛选出数个与哮喘相关的差异表达基因。     

猫视神经慢性损伤相关差异表达基因消减cDNA文库的构建

目的:构建猫视神经慢性损伤相关差异表达基因消减cDNA文库.方法:15只成年家猫随机分为正常对照组、视神经压迫4周组和视神经压迫8周组(n=5),压迫4周组和压迫8周组猫利用球囊植入法建立慢性视神经损伤模型.取各组动物视神经,TRIzol法提取总RNA,SMART技术合成cDNA,随后利用抑制消减杂交方法分离受压4周和8周视神经中差异表达基因的cDNA片段,将其与T载体进行T/A连接构建文库,将连接产物用氯化钙转化法转化大肠杆菌进行文库扩增和蓝白斑筛选,随机挑取300个白色克隆进行菌落PCR鉴定.结果:菌落PCR扩增显示每个文库80%的克隆中均有200～800 bp的插入片段.结论:成功构建猫视神经慢性损伤相关差异表达基因消减cDNA文库,为进一步筛选、克隆慢性视神经损伤相关差异表达基因奠定了基础.     

应用显微切割-cDNA PCR-SSH法克隆胃癌前病变相关基因

目的 构建胃异型增生组织cDNA消减文库,初步筛选差异表达基因。方法 手工显微切割取胃异型增生和正常组织,应用cDNAPCR方法对少量组织全转录组扩增后进行双向抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH),消减后片段与载体连接、克隆、筛选、测序及同源性检索,并用斑点杂交方法验证检测结果。结果 正常和异型增生组织互为tester和driver成功构建了2个cDNA消减文库,分别代表在异型增生组织中表达上调和下调基因,测序的26个克隆中15个为已知基因,3个为已知EST,8个为新的EST,GenBank登录号为BQ164614-BQ164616,BQ291516-BQ291520,其中15个片段经证实在胃异型增生阶段有显著表达差异。结论 利用本室创建的显微切割-cDNA PCR-SSH法成功构建胃异型增生组织cDNA消减文库,初步筛选部分基因,为寻找胃癌发生相关基因提供重要线索。     

利用抑制性消减杂交技术筛选大鼠哮喘相关基因

目的:利用哮喘大鼠模型筛选与哮喘发病相关的差异性表达基因.方法:采用抑制性消减杂交技术,以哮喘大鼠肺组织总RNA为检验子,对照大鼠肺组织总RNA为驱赶子,将消减杂交获得的DNA片断与pGEM-T Easy Vector连接,构建cDNA文库后,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆.将获得的阳性克隆插入片段进行测序分析,测序结果与GenBank数据库中cDNA和EST序列进行相似性比对,获得差异性表达基因的信息.结果:扩增消减cDNA文库获得300余个白色克隆,随即挑选36个测序,除去重复序列,结果中含有已知的基因4 个,ESTs 2个及与任何序列无同源性的新基因片段3个.结论:成功构建了哮喘大鼠肺脏差异性表达基因的正向消减cDNA文库,筛选出数个与哮喘相关的差异表达基因.     

白血病原代骨髓基质细胞诱导Jurkat细胞基因差异表达研究

目的研究白血病骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)诱导Jurkat细胞相关基因表达的变化.方法采用Percoll体外分离正常人、初治急性白血病患者BMSCs;采用抑制性消减杂交技术建立白血病BMSCs诱导Jur-kat细胞差异表达基因的cDNA文库;并对差异表达的基因进行初步鉴定与分析.结果成功地建立了白血病BMSCs诱导的Jurkat细胞上调和下调差异表达基因的cDNA文库;初步筛选克隆到30个上调差异表达基因和22个下调差异表达基因cDNA片段;这些基因功能主要与细胞周期调控、细胞凋亡、细胞能量代谢有关.结论白血病BMSCs能诱导Jurkat细胞基因发生差异表达.     

应用抑制消减杂交和斑点印迹杂交对膀胱癌差异表达基因的研究

目的：研究膀胱移行细胞癌和正常膀胱黏膜的差异表达基因。方法：应用抑制消减杂交技术(Suppression subtractive hybridization SSH)构建人膀胱移行细胞癌和正常粘膜差异表达的cDNA消减文库，进一步利用斑点印迹杂交(Dot blot)从中筛选出TCC差异表达的基因，随机选取部分克隆进行测序，结果在GenBank中作同源性对比分析。结果：成功构建了具有高消减效率的人TCC的cDNA消减文库，从文库的376个阳性克隆中随机选取100个克隆扩增、筛选后得到89条200～900bp的差异表达基因片段，测序后发现5条未知新基因片段和41种已知基因。结论：利用SSJ和Dot blot研究膀胱癌差异表达基因，为大批量筛选和克隆其差异表达的基因提供了行之有效的方法，也为研究基因功能和TCC的发生机制奠定了基础。     

应用抑制性消减杂交技术筛选脂肪细胞分化相关基因

目的:利用脂肪分化细胞模型筛选与脂肪细胞分化相关的差异性表达基因。方法:采用抑制性消减杂交技术,以诱导分化后的人前体脂肪细胞系SW872总RNA为Tester,诱导分化前的人前体脂肪细胞系SW872为Driver,将消减杂交获得的DNA片段与pGM-T载体连接,构建cDNA文库后,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆。将获得的阳性克隆插入片段进行测序分析,并与GenBank数据库进行同源性分析,获得差异性表达基因。结果:扩增消减cDNA文库获得135个白色克隆,随机挑选64个进行测序,共获得34个阳性克隆基因。结论:本研究成功构建了脂肪细胞分化差异性表达基因的消减cDNA文库,筛选出了与脂肪细胞分化相关的差异表达基因。     

葡萄胎发病相关新基因的克隆

目的筛选和克隆与葡萄胎发病相关的新基因。方法采用抑制性消减杂交方法，建立葡萄胎组织与正常早孕绒毛组织间的差示cDNA文库，从中筛选出新基因序列，并克隆其全长。结果从差示cDNA文库中共筛选出28个克隆，测序结果提示含10种基因序列，其中3个基因片段被确认为功能未明的新基因，并获得其中一条基因的全长序列（按克隆序列号命名为F10）。结论F10等新基因可能与葡萄胎的病理发生发展密切相关。     

人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库的构建

目的 构建人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库。方法 采用抑制性消减杂交技术，以胃印戒细胞癌组织为检测子，正常胃黏膜组织为驱动子，分离胃印戒细胞癌组织特异性表达的基因片段，并与T载体连接，构建人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库。结果 成功构建高消减效率的人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库，获得200多个阳性克隆，随机挑取50个克隆鉴定均有长度为100～750bp插入片段。结论应用抑制性消减杂交技术构建人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库，为进一步筛选和克隆人胃印戒细胞癌组织特异性表达基因奠定基础。     

人膀胱癌异质性表型相关基因的筛选与鉴定

目的 筛选和鉴定膀胱肿瘤异质性生物学表型相关的基因。方法 以已建立的两株同一来源、不同生物学表型的膀胱移行细胞癌细胞系为材料,采用抑制性削减杂交技术筛选差异表达的基因片段,构建cDNA文库;挑取克隆进行筛选,获得差异表达片段,测序并与Genbank比对,Northernblotting验证差异片段在两株细胞系的不同表达。结果 建立了两个消减文库,分别含有168和206个白色克隆,白色克隆含有约200～700bp的插入片段,对这些克隆进行筛选,获得35个差异表达基因片段,其中15个对应于细胞骨架蛋白、细胞代谢酶基因等已知基因,另外19个为未知功能基因,1个为新EST片段,注册Genbank（注册号为DR008207）。结论 抑制性消减杂交技术是筛选、克隆差异表达基因的有效手段;keratin7、Vimentin等细胞骨架蛋白的不同表达,与细胞形态的表型差异有关;DDH等代谢基因的不同。与细胞的药物敏感性差异相关;筛选到的新基因片段为进一步克隆其全长、研究基因功能提供了实验基础。