应用逆转录聚合酶链反应和序列分析对褐家鼠肺汉坦…

目的：对来自北京西客站附近一集装箱仓库的２份汉坦病毒免疫荧光抗原阳性褐家鼠肺组织进行分型研究。方法：采用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）和序列分析。结果：这两份褐家鼠肺标本均携带汉城型（ＳＥＯ）汉坦病毒（ＨＶ）。ＲＴ－ＰＣＲ扩增其中１份标本所携带病毒的Ｍ基因３３０ｂｐ片段，通过ｐＧＥＭ－Ｔ载体克隆进入大肠杆菌ＪＭ１０９，并进行核苷酸序列测定，经与其它ＨＶ核苷酸序列的同源性比较，其与ＳＥＯ型毒株相     

逆转录聚合酶链反应在轮状病毒肠炎诊断中的应用研究

1 .材料与方法 :15 0份粪便标本于 1999年 11月至 2 0 0 0年 2月取自本院住院的急性腹泻患儿。 15 0例患儿年龄为4 0天龄～ 2岁 ;病程 1～ 14天。收集每例腹泻患儿的新鲜粪便标本 2份 ,1份立即进行乳胶凝集试验 ,1份置于 - 2 0℃冰箱待行逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)检测。RT PCR参照Taniguchi等[1] 的方法抽提RNA并做HRVRT PCR反应 ,引物由上海生工合成。DNA聚合酶由美国Promega公司生产。扩增产物以 1%琼脂糖凝胶电泳 ,溴化乙锭染色 ,紫外灯下观察结果并照相。乳胶凝集试验以英国MicrogenBioproductLtd公司的Rotascreen试剂测…     

逆转录-聚合酶链反应检测风疹病毒基因

针对风疹患者发病早期血清中特异性风疹IgM抗体阳性率低的特点 ,以及对胎儿风疹病毒感染检测的需要 ,采用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)直接从风疹减毒活疫苗BRDⅡ株、风疹GOS株、临床风疹患者的含漱液和咽拭子中检测出 411bp特异性片段 ;而麻疹、流行性腮腺炎、流行性感冒病毒均未检测出相应片段。通过对RT PCR一次产物的再次扩增 ,可以使检测的灵敏度达到 0 1TCID50 。该技术可作为风疹酶联免疫吸附试验 (ELISA)的一种补充 ,同时对控制先天性风疹综合征与优生优育工作具有积极的作用。     

逆转录聚合酶链反应用于检测恶性疟原虫的初步研究

目的 建立逆转录聚合酶链反应系统,用于检测恶性疟原虫感染。方法 以恶性疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸基因为靶片段,设计一对特异引物,分别采用RT－PCR技术和PCR技术进行检测恶性疟原虫血样并比较两才检测的敏感性。结果 从培养的恶性疟原血样中扩增出359bp特定扩增带,而间日疟和健康人血样均未见扩增带。经限制性内切酶分析证实扩增产物为目的片段。检测系统初步显示可检出恶性疟血样中0．34个疟原虫所含的RNA模板。以RNA为检测对象的RT－PCR肉眼可见条带的检测水平较以DNA为检测对象的PCR扩增高。结论 RT－PCR检测恶性疟原虫方法具有敏感性高、特异性强的特点,有一定的应用价值。     

上海地区汉坦病毒基因分型和序列分析

[目的 ]　研究上海地区汉坦病毒基因型分布。　 [方法 ]　采用逆转录聚合酶链反应 (RT -PCR)、核苷酸测序法和系统发生树分析上海宿主动物中获得的 3 6株汉坦病毒M基因片段。　 [结果 ]　上海郊区汉坦病毒流行株有HTN型和SEO型 ,以HTN型为主 ;市区流行株为SEO型。核苷酸序列同源性及系统发生树分析表明上海地区HTN型汉坦病毒存在 3个不同分支 ,不同HTN型病毒间的核苷酸的差异在 6% -19%。　 [结论 ]　上海地区汉坦病毒以HTN型为主。可能存在汉坦病毒的不同基因亚型 ,对本市肾综合征出血热 (HFRS)的防治有重要指导意义     

多重逆转录聚合酶链反应检测流感病毒

目的：建立特异敏感的热速检测流感病毒的分子生物学方法。方法：用多重逆转录聚合酶链反应连接多重聚合酶链反应扩增甲1、甲3和乙型流感病毒的HA基因的HA1片段。根据扩增产物的大小检测流感病毒。结果：以流感病毒的HA基因为模板设计的三对引物能特异性地扩增出942bp、1117bp和751bp的核酸片段，它们分别和甲1、甲3和乙型流感病毒有稳定对应关系。根据扩增产物的大小可以检测流感病毒。用这个方法能检测病毒浓度为0．1TCID50的样品。还可以直接从疑似流感病人的含漱液中检测到乙型流感病毒。结论：多重逆转录聚合酶链反应连接多重聚合酶链反应是检测流感病毒的特异敏感的方法，此法还能直接从疑似流感病人的含漱液中检测到乙型流感病毒。     

应用通用引物建立巢式逆转录聚合酶链反应检测肠道病毒

目的设计通用引物建立巢式逆转录聚合酶链反应(RT-n-PCR),以求敏感、特异及快速诊断肠道病毒(EV)感染。方法在EV基因组5'端非编码区(5'-UTR)设计2对通用引物,建立RT-n-PCR检测方法。结果共有104份临床标本检测到相应大小扩增条带,阳性率31.8%(104/327);在147例病例中粪便和咽拭子EV阳性比较差异无统计学意义(P>0.05)。病例总阳性数64例,阳性率38.8%(64/165)。正常儿童与可疑EV感染病人EV阳性率比较差异有统计学意义(u=3.38,P<0.01)。结论RT-n-PCR可以准确快速地检测出肠道病毒,同时检测多份标本可以提高EV阳性率。     

多重逆转录聚合酶链反应检测主要上呼吸道病毒

目的：建立用多重逆转录聚合酶链反应（mRT-PCR）检测甲1型、甲3型、乙型流感病毒以及呼吸道全胞病毒（RSV）A型、B型等主要上呼吸道病毒的方法，以快速检测上呼吸道感染主要病毒及对甲型、甲亚型、乙型流感病毒在上海地区人群感染、流行情况设计。方法：采用经MDCK细胞接种培养的甲3型、乙型流感病毒和Hep-2细胞接种培养的RSV A型、B型标准毒株病毒液，以及甲1型、甲3型、乙型流感病毒和RSV A型、B型混合毒株病毒液，使用5组引物，分别为HA1-5al和Hal-3al（甲1型流感病毒）、HA3-5al和HA3-3al和HA3-3al（甲3型流感病毒）、NP-5b1和NP-3bl（乙型流感病毒）、RSVAF和RSVAR(RSVA型)、RSVBF和RSVBR(RSVB型)，经mRT-PCR，琼脂糖凝胶电泳，于紫外灯下观察上述病毒特异核苷酸条带。结果：甲1型、甲3型、乙型流感病毒，RSVA型、B型分别在431，210，390，334，183bp处出现清晰的5条DNA条带。结论：应用5组引物，mRT-PCR可用于快速检测临床上呼吸道感染标本中的流感病毒和RSV，并可对其进行分型，对上呼吸道病毒感染性疾病的诊断和流感的监测方面是非常重要的。     

多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应快速检出含漱液中的乙型流感病毒

目的 建立特异敏感的快速检测含漱液中的流感病毒的分子生物学方法。方法 用多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应扩增甲1、甲3和乙型流感病毒HA基因的HA1片段,得到各病毒与特异性大小的扩增产物的对应关系。用同样的方法扩增含漱液中流感病毒的HA基因的HA1片段。根据这对应关系检测含漱液中的流感病毒。结果 以流感病毒的HA基因为模板设计的三对引物,用多重逆转聚合酶链反应能特异性地扩增出942bp、1117bp和751bp的核酸片段,它们分别和甲1、甲3和乙型流感病毒有稳定对应关系。用多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应扩增含漱液中流感病毒HA基因的HA1片段,根据扩增产物的大小检出含漱液中的乙型流感疾病。结论 多重逆转聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应能特异敏感地检出含漱液中的乙型流感病毒。     

逆转录-套式PCR检测汉坦病毒感染的实验研究

目的：探讨逆转录一套式聚合酶链反应（RT—nested—PCR）检测汉坦病毒（Hantavirus，HV）感染的准确性和敏感性。方法：用RT—nested—PCR和直接免疫荧光法（direct immunofluorescence，FA）分别检测深圳市2005年肾综合征出血热宿主动物监测中捕获的鼠类中HV的感染情况。结果：在76份特异性总抗体阳性的鼠肺标本中，用RT—nested—PCR检出61份抗原阳性，而FA仅检出47份阳性。结论：RT—nested—PCR是一种比较准确的检测汉坦病毒感染的方法，其敏感性高于FA。     

用RT—PCR快速检测血清中的登革热病毒及分型

目的：检测血清中的登革热（DF）病毒．并进行分型研究。方法：采用SiO2快速提取DF病毒RNA，用通用引物（D1～D4型）RT－PCR扩增方法，检测广东省1995年55份疑似DF患者急性期（1～7天）血清标本中的DF病毒RNA，并与病毒分离法相比较。结果；病毒分离阳性率为49．09％，RT－PCR的检出率为38．18％，敏感性为77．78％，特异性为100％，符合率为89．09％，两者差异无显著性（X2＝2．08，P＞0．05）。用通用引物扩增D1～D4型标准毒株和标本，出现511bp的扩增带，乙脑病毒不出现扩增带。用HinfⅠ、HaeⅢ、HincⅡ和Sau3aⅠ等4种限制性内切酶，对D1～D4型标准毒株的RT－PCR产物进行酶切分型，用琼脂糖电泳，结果HinfⅠ和HaeⅢ对D1～D4型均能酶切，Sau3aⅠ能酶切D1～D3型，HincⅡ能酶切D1和D4型。根据两种或以上的酶切结果，可以对DF病毒的型别作出鉴定。用这4种酶对5份标本进行酶切分型，结果与D1型标准毒株的电泳带型相同。结论：用本方法检出DF病毒的RNA仅需5～6小时，在2天内可以鉴定出型别，是诊断DF病毒感染的一种快速简单的方法。     

葫芦岛市居民区褐家鼠携带的汉坦病毒分析

目的通过对汉坦病毒的监测分析,掌握葫芦岛市居民区鼠类中的汉坦病毒流行情况,为制定人间汉坦病毒的预防控制措施提供依据。方法用鼠笼捕获小动物,采用间接免疫荧光法（IFA）检测小动物肺中的汉坦病毒抗原,用RT？PCR进行基因分型。结果在2005-2006年选取葫芦岛地区9个不同地点的居民区和2个野外地点捕鼠,共捕获褐家鼠254只,小家鼠17只,黑线姬鼠5只,褐家鼠带病毒率为4.72%,小家鼠为5.88%。提取汉坦病毒抗原阳性鼠肺组织中的病毒RNA,从褐家鼠中共扩增出9株汉坦病毒,基因分型全部为汉城病毒,并且分离到1株病毒。而从小家鼠和黑线姬鼠中未扩增到病毒。结论葫芦岛市居民区的鼠类以褐家鼠为主,其携带的病毒属于汉城型。     

改进的PCR技术快速检测水中肠道病毒的研究

〔目的〕 快速检测水中肠道病毒。〔方法〕 一步单管反转录ＰＣＲ,通用引物多重ＰＣＲ。〔结果〕 反转录与ＰＣＲ在一个反应管中一步操作即可完成,用６条引物一次反应成功地检测了甲型肝炎病毒（ＨＡＶ）、脊髓灰质炎病毒（Ｐｏｌｉｏ）、柯萨奇Ｂ组病毒（ＣｏｘＢ）和埃可病毒（ＥＶ）。其特异性为半套式ＰＣＲ所证实,敏感性达１０＾１ＰＦＵ／ｍｌ。〔结论〕 一步单管反转录ＰＣＲ,简化了操作步骤,减少了污染的机会,提高了反应的敏感性和特异性。通用引物多重ＰＣＲ用较少的引物检测并鉴别较多的病毒,减少了引物之间的干扰,提高了结果的稳定性。     

北京市褐家鼠种群遗传多态性及与汉坦病毒分布关系的研究

目的了解北京地区褐家鼠不同地理种群遗传多态性与该地区汉坦病毒（HV）基因变异及其分布可能存在的关联。方法选取北京市不同地区捕获褐家鼠，采用巢式RT—PCR法检测HVM基因片段，获得的阳性标本产物进行直接测序，构建系统发育树。另一方面对不同HV来源的宿主个体和其对应种群内随机选取的其他个体，以及其他一些地区鼠类作为参照，用随机扩增多态DNA（RAPD）技术获得褐家鼠基因组DNA多态性图谱，利用RAPDDIST和PHYLIP软件分析褐家鼠种群多态性，并与对应的北京地区的HV差异和分布进行比较。结果选用50个随机引物进行扩增，有5个引物获得清晰、多态性高的RAPD谱带。不同区域种群RAPD标记不尽相同，北京市褐家鼠地理种群之间存在一定程度的遗传分化，大部分种群遗传距离较为接近，其中采集于某农产品集散地的XFD种群遗传距离相对较大，有特异性标记条带。11个HV代表序列均为汉城型汉坦病毒，基因差异为0．1％～8．0％，可分为2个主要的支系，多数毒株变异类型在不同地域中交叉分布，但BjFT01株变异较大，成一个独立的支系。通过Bootstrap分析和系统树图比较，种群分化较大的XFD种群与该区获得1株亲缘关系相对较远的HV相对应。结论北京市不同区域HV及其褐家鼠DNA多态性均存在一定差异，不同种群尤其是输入性种群对北京HV流行影响程度不同，初步显示一些特定种群与特定的基因性别有一定的关联。XFD种群外源基因交流渗入的可能性较大，进一步证明北京市HV随着鼠类种群迁移输入的可能性极大，但仍有待于选用一些特异性标记基因多态性进行继续研究。     

辽宁省葫芦岛地区鼠类汉坦病毒的分离与鉴定

目的研究葫芦岛地区鼠类中汉坦病毒的感染流行情况以及病毒的型别.方法采用夹夜法捕捉鼠类,间接免疫荧光法检测鼠肺中的汉坦病毒抗原,阳性较强的标本接种到Vero E6细胞分离病毒,RT-PCR对分离的病毒与阳性样品扩增核苷酸片段并测序,构建系统发生树进行分型与系统发生分析.结果在200份鼠肺标本中共检测到11个样品阳性,阳性率为5.5%.选择阳性较强的标本,接种到Vero E6细胞并连续传代后分离到3株病毒.用S片段（620～999 nt）与M片段G1区（180～580 nt）的核苷酸构建的系统发生树,结果表明葫芦岛分离的3株病毒均为S3亚型.用G2区的2003～2302 nt的核苷酸序列构建的系统发生树将来自不同地区的SEO型病毒可分为7个亚型,其中从葫芦岛地区分离的3株病毒与北京地区分离株CP211、ch302、dc501和山东省分离株SD10、SD227株的亲缘关系最近.结论葫芦岛地区鼠类中汉坦病毒的携带率较高,主要流行S3亚型SEOV.     

用多聚酶链反应技术检测实验感染恙虫病立克次体的恙螨

作者首次采用多聚酶链反应技术检测感染恙虫病立克次体的媒介恙螨，包括成虫的幼虫。证实ＰＣＲ是一可用于恙虫病流行病学调查的新的敏感方法。     

浙江省2008-2011年啮齿动物中汉坦病毒的分离及鉴定

目的 分析浙江省肾综合征出血热(HFRS)疫区鼠形动物携带汉坦病毒状况及其型别.方法 应用直接免疫荧光试验和RT-PCR方法检测汉坦病毒抗原和核酸,阳性者用长爪沙鼠和Vero-E6细胞进行病毒分离,对分离株的M片段基因进行序列测定和分析.结果 2008-2011年在浙江省HFRS疫区捕获的鼠形动物中以黑线姬鼠为优势鼠种;从该鼠鼠肺中共分离到6株汉坦病毒,序列分析表明分离株均为汉滩型汉坦病毒,其中Z521、524、534为H7亚型,TT-27、T-43、R88可能为新亚型;6株分离株之间的基因同源性较高,并与以往浙江省分离株具有较高同源性.结论 2008-2011年浙江省HFRS疫区鼠间存在汉滩型汉坦病毒流行.     

聚合酶链反应检测与鉴定人流行性感冒病毒

目的 建立一个快速、简单、敏感、特异的实验室检测流感病毒的方法.方法 采用RT-PCR、复合RT-PCR方法和HI试验对流行性感冒病毒的参考株(甲1、甲3和乙型各两株)和分离毒株(甲1型1株、甲3型3株)以及可疑流感患者的喉嗽液标本进行检测.结果 采用RT-PCR方法和复合RT-PCR方法均能检测甲1、甲3、乙型的流感病毒参考株和分离毒株,且能根据扩增物的分子量鉴定出其型别与亚型,其结果与HI法完全相符.复合RT-PCR方法从3例可疑流感患者的喉嗽液标本中检测到阳性结果1例,结果同传统鸡胚分离、HI分型方法相同.结论 本文建立的RT-PCR或复合RT-PCR方法可应用于常见流感病毒的快速检测及初步分型,复合RT-PCR方法具更高的工作效率.     

逆转录—聚合酶链反应在丁型肝炎病毒感染的应用及意义

本项技术选取丁型肝炎病毒（ＨＤＶ）ＲＮＡ的非抗原编码区的相对保守区为靶序列,设计两对引物,进行巢式聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增ＨＤＶＲＮＡ。血清及肝组织采用蛋白酶消化法提取ＲＮＡ。结果发现９８例各型病毒性肝炎血清中,ＨＤＶ—Ｍ阳性组ＨＤＶＲＮＡ检出率为５６６％（３０／５３）,ＨＤＶ—Ｍ阴性组为８９％（４／４５）（Ｐ＜００１）;ＨＤＡｇ或／及抗ＨＤＩｇＭ阳性血清测定ＨＤＶＲＮＡ的阳性率为５７１％（２８／４９）,抗ＨＤ阳性血清的阳性率为５００％（２／４）;９例ＨＤＶ—Ｍ阳性肝组织测定ＨＤＶＲＮＡ阳性者６例,２例ＨＤＶ—Ｍ阴性肝组织均阴性。本项技术是在分子水平上检测病毒核酸、操作简便、稳定、可靠、特异性高、重复性好,可以作为ＨＤＶ血清学指标的佐证和补充,肝组织ＨＤＶＲＮＡ的测定可应用于回顾性研究,在临床病原诊断、抗病毒疗效判定、病毒复制、重叠感染等研究方面提供重要实验依据。     

中国1998～2004年G9型轮状病毒分子流行病学研究

目的研究中国流行的轮状病毒(Rotavirus,RV)G9型毒株的分子流行病学特征。方法在中国9个地区收集5岁以下腹泻患儿粪便标本,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测RV,对阳性标本用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分型,选择G9型毒株进行VP7基因全长克隆测序和分子流行病学分析。结果1998~2004年共检测出RV1 268份,其中45份为G9型(3.5%),昆明最多(34/45),其次是兰州(8/45)、长春(2/45)、卢龙(1/45),北京、郑州、杭州、福州、广州未检测到G9型毒株。对35份G9型标本进行P分型鉴定:15份为P[8]型,12份为P[6]型,5份为P[4]型,1份为P[8 4]混合型,2份未能分型。中国1998~2000年以P[8]G9毒株流行为主,而2001年后以P[6]G9毒株为主。22株G9型病毒VP7基因序列比对结果表明,中国流行的G9型毒株彼此同源性高,同属G9第3亚型。结论中国流行的RV G9型株与世界各地的流行株同源性较高,国内传播范围扩大的趋势值得关注。