p3GnT8/β3GalT7催化活性的研究

目的 进一步验证β1,3半乳糖基转移酶(β3GalT7)的催化功能.方法 将重组表达载体pGEX-6p-1-β3GnT8/GalT7转化BL21大肠杆菌,经IPTG诱导表达后,得到GST-β3GnT8/GalT7融合蛋白,分别进行β3GAIT7和β3GnT8反应体系的酶促反应,利用高效液相色谱(HPLC)进行检测.结果 HPLC检测结果表明,β3GalIT7同时具有β3GalT7和β3GnT8的活性.结论 β3GalT7具有双重酶活性,拟初步重命名为β3GnT8/β3GalT7.

Abstract：

Objective To determine the catalytic activity of the (31, 3-N-acetylglucosyltransferase β3GnT8)/β1, 3-galactosyltransferases (β3GalT7). Methods The recombinant plasmid was transformed into E. Coli BL21. Then a fusion protein was expressed after the induction by IPTG. After testified by Western blot, we purified the expression products by affinity chromatography. After renaturation, its enzyme activity was assayed by HPLC. Results It suggested that β3GalT7 own the catalytic activities of β3GalT7 and β3GnT8. Conclusion It has both activities of GalTs and GnTs, so we renamed it as β3GnT8/β3GalT7.     

β3GnT8/β3GalT7催化活性的研究

目的进一步验证β1,3半乳糖基转移酶（β3GalT7）的催化功能。方法将重组表达载体pGEX-6p-1-β3GnT8/GalT7转化BL21大肠杆菌,经IPTG诱导表达后,得到GST-β3GnT8/GalT7融合蛋白,分别进行β3GalT7和β3GnT8反应体系的酶促反应,利用高效液相色谱（HPLC）进行检测。结果HPLC检测结果表明,β3GalT7同时具有β3GalT7和β3GnT8的活性。结论β3GalT7具有双重酶活性,拟初步重命名为β3GnT8/β3GalT7。     

人类β3-糖基转移酶β3GnT8/β3GalT7在恶性血液系统肿瘤细胞中的表达差异及其原核表达和鉴定

目的研究一种新的人类β3-糖基转移酶β3GnT8/β3GalT7在恶性血液系统肿瘤细胞中mRNA水平的表达情况,并在原核体系中克隆和表达。方法运用半定量RT-PCR方法研究人β3GnT8/β3GalT7在13种恶性血液系统肿瘤细胞中的表达谱,以其中表达该基因最高的THP-1细胞的cDNA为模板,克隆目的基因,构建重组表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达。经超声裂菌,尿素溶解包涵体,过Ni-NTA琼脂糖层析柱纯化,透析复性浓缩后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western blot验证。结果 K562、U937、THP-1和NB4细胞株均较高效表达β3GnT8/β3GalT7,其中THP-1细胞株表达最高;并成功构建原核表达载体pQE30-β3GnT8/β3GalT7,表达出相应的重组蛋白。结论人β3GnT8/β3GalT7在13株细胞中表达有显著差异,并获得大量较纯的目的蛋白,其分子量与预测相符,为单克隆抗体制备及进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。     

O-GlcNAc糖基转移酶在原核和真核细胞中的表达和提纯

目的 :本文为进一步研究蛋白 O- Glc NAc糖基化修饰提供重要资源。方法 :为了探索制备纯化具有生物学活性的重组 OGT的有效方法 ,本文用大肠杆菌和 Hi5昆虫细胞表达并纯化具有活性的重组 OGT。携带人 OGTc DNA的 PET32 a质粒在大肠杆菌中表达出带有 1个 S- Tag的重组人 OGT融合蛋白 ,然后用与 S-蛋白质偶联的琼脂糖凝胶颗粒从细菌裂解液中亲和纯化 OGT融合蛋白。结果 :其纯化的 OGT在电泳中显现单一条带并具有生物活性 ,但其活性在洗脱后丧失。在 Hi5昆虫细胞中表达的鼠肝 OGT带有一 His6 tag,经镍离子螯合柱纯化后 ,其比活性达到 0 .88nmol· min- 1 · mg- 1 OGT。结论 :在这两个表达系统中制备重组 OGT各有利弊。     

β3GalT7基因转染HL-60细胞及对其生物学行为的影响

目的:初步探讨人类β1,3半乳糖基转移酶7(β3GalT7)基因对HL60细胞的细胞周期、侵袭能力等方面的影响。方法:通过脂质体介导将本实验室构建好的β3GalT7真核正义表达载体pEGFP-C1-T7-Sense和反义表达载体pEGFP-C1-T7-AntiSense转染入HL60细胞;流式细胞仪分析各细胞株的细胞周期改变;Transwell侵袭实验检测β3GalT7对HL60细胞侵袭转移能力的影响。结果:随着β3GalT7表达的增高,G2 S期细胞增多,且细胞侵袭能力增强;而转染反义表达载体pEGFP-C1-T7-AntiSense的结果是相反的。结论:过度表达β3GalT7的HL-60细胞株体外增殖和侵袭能力增强。     

变形链球菌葡糖基转移酶基因在戈登链球菌中的表达

目的:通过探讨变形链球菌葡糖基转移酶基因在戈登链球菌中的表达,了解葡糖基转移酶对戈登链球菌生物学特性的影响。方法:携带的大肠杆菌链球菌穿梭质粒pZB1转化戈登链球菌,利用蛋白质免疫印迹技术确认葡糖基转移酶基因在转化株中表达,通过检测转化株菌落形态以及蔗糖依赖性粘附了解葡糖基转移酶对戈登链球菌生化特性的影响。结果:戈登链球菌的菌落形态由转化前的光滑型变为转化后的半粗糙型,转化菌株的蔗糖依赖性粘附较转化前明显降低。结论:变形链球菌的葡糖基转移酶在戈登链球菌中的表达增加了细菌之间的聚集,葡糖基转移酶与戈登链球菌的粘附因子相互作用,降低了细菌的蔗糖依赖性粘附。     

β3GalT7基因的小干扰RNA筛选及其表达载体构建

目的: 以β3GalT7(人β1,3-半乳糖基转移酶7)基因为研究对象,运用RNA干扰技术平台,筛选出该基因的有效小干扰siRNA并构建该基因的RNA干扰表达载体,建立其下调表达模型.方法: 通过PCR方法筛选针对β3GalT7基因的有效小干扰siRNA,并合成带有荧光标记的RNA oligo进一步验证其有效性,进而构建该基因的RNA干扰表达载体建立其下调表达模型.结果: 成功筛选到β3GalT7基因的有效小干扰siRNA, 并进一步成功构建β3GalT7的RNA干扰真核表达载体.结论: 成功构建β3GalT7的真核干扰表达载体,继而可以获得β3GalT7表达受抑制的人胃癌细胞SGC7901克隆,为研究该基因在肿瘤发生发展中的作用提供实验模型.     

四类糖基转移酶基因在肿瘤细胞株中表达谱的研究

目的探讨糖基转移酶（GT）催化底物的糖基化反应。方法采用TOPO-TA克隆法建立N-乙酰氨基半乳糖转移酶（ppGalNAcT）、硫酸基（磺基）转移酶（GlcNAc6ST）、半乳糖基转移酶（GalT）和N-乙酰氨基葡萄糖转移酶（GnT）等4类糖基转移酶的cDNA文库,并以此制成表达谱基因点阵。利用此点阵采取化学发光法检测不同肿瘤细胞株中4类糖基转移酶的相应表达谱。结果在不同肿瘤细胞中ppGalNAcT、GlcNAc6ST、GalT和GnT基因的表达水平不一;而在同一肿瘤细胞中,4类糖基转移酶基因的表达也有差异。结论这项研究为以后利用糖基转移酶的表达谱来检测肿瘤的发生、发展提供了依据。     

人β4GalTⅡ基因在哺乳动物细胞株中的表达与定位

目的：运用基因克隆技术构建人源β1,4-半乳糖转移酶Ⅱ（β4GalTⅡ）真核表达质粒,并将其转染到 COS7细胞中,观察蛋白在细胞内的定位,同时转染到 HEK 293T 细胞中检测其表达。方法分别设计带 FLAG 标签和 GFP 标签的β4GalTⅡ基因的特异性引物,以含人β4GalTⅡ全长 cDNA序列为模板,定向构建到 pcDNA3．1（＋）及 pCDGFP 真核表达载体中,构建重组表达质粒。通过酶切和测序鉴定阳性重组质粒,利用 Lipofectamine 2000分别转染 COS7、HEK 293T细胞,免疫荧光显微镜观察重组蛋白在细胞内的定位,West-ern blot 法鉴定重组蛋白的表达。结果成功构建 pcD-NA3．1-β4GalTⅡ-FLAG 和 pCDGFP-β4GalTⅡ重组表达载体,定位实验表明：β4GalT Ⅱ-FLAG 和 GFP-β4GalT Ⅱ二者在COS7细胞中均主要定位在细胞核周围,并有明显的块状染色,胞核中未见明显分布;Western blot 法检测显示重组β4GalTⅡ蛋白在 HEK 293T 细胞中稳定表达。结论获得了人β4GalTⅡ的真核表达质粒,并能在 COS7和 HEK 293T 细胞中表达,为进一步研究β4GalTⅡ的功能及其与其他蛋白的相互作用奠定了一定基础。     

重组O-GLcNAc糖基转移酶在昆虫细胞中的表达和纯化

蛋白质的 O- Glc NAc糖基化修饰是一种细胞核蛋白与细胞浆蛋白的蛋白质翻译后修饰。不同于膜蛋白和分泌蛋白的糖基化修饰 ,与蛋白质磷酸化修饰相似。催化蛋白质 O- Glc NAc糖基转移酶 ( OGT)已被克隆。用Hi5昆虫细胞系统表达并纯化了具有活性的重组 OGT。在 Hi5昆虫细胞中表达的鼠肝 OGT带有一 His 6标记片段。经镍离子螯合柱纯化后 ,其比活性达到 0 .88nmol· min- 1·m g- 1 OGT。因此本研究为进一步研究蛋白 O- Glc NAc糖基化修饰提供重要资源     

壳聚糖对白血病细胞糖基转移酶表达的影响及对细胞的抑制作用

目的:观察壳聚糖对白血病细胞(K562,SHI-1)的作用。方法:以不同浓度的壳聚糖处理白血病细胞K562后,运用RT-PCR方法检测实验组K562细胞中多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶-2(ppGalNAc-T2)mRNA表达差异。另用不同浓度的壳聚糖分别作用于白血病K562细胞和SHI-1细胞,MTT法检测壳聚糖对两种细胞的相对抑制率。结果:与阴性对照组比较,实验组K562细胞的ppGalNAc-T2表达降低,且随壳聚糖浓度升高,表达量进一步减少;MTT实验显示不同浓度的壳聚糖对K562细胞和SHI-1细胞均有抑制作用,并呈浓度依赖性。结论:壳聚糖对肿瘤细胞有一定的抑制作用,同时还可以减少ppGalNAc-T2在mRNA水平的表达。     

α1，3-岩藻糖基转移酶Ⅶ真核表达载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定绿色荧光蛋白为报告基因的pIRES2-EGFP—FUT7真核表达载体。方法采用RT—PCR方法获得α1,3-岩藻糖基转移酶Ⅶ（FUT7）全长基因,克隆至pMD18-TSim—pie载体后,将FUT7亚克隆至pIRES2-EGFP表达载体并进行鉴定。结果测序及酶切鉴定证明获得人全长FUT7基因,FUT7基因正确插入plRES2-EGFP中。结论成功构建了绿色荧光蛋白为报告基因的FuT7真核表达载体,为研究FuT7及其合成的糖抗原sLex在乳腺癌转移中的作用奠定了基础。     

哮喘小鼠肺组织和肺T细胞β1,3-N-乙酰糖基转移酶的表达

目的研究支气管哮喘模型小鼠肺组织及肺T细胞中三种β1,3-N-乙酰糖基转移酶（Fringe）RFNG、LFNG、MFNG的基因和蛋白表达的特点,探讨Fringe是否与哮喘发病有关。方法使用卵白蛋白腹腔注射后雾化吸入法制备BALB/c小鼠哮喘模型,并设置生理盐水对照组。经Perco1及尼龙毛法分离获取肺T细胞。采用半定量RT-PCR检测两组小鼠肺组织及肺T细胞中RFNG、LFNG、MFNGmRNA表达;Westernblot检测两组小鼠肺组织中RFNG、LFNG、MFNG蛋白表达。结果两组小鼠肺组织及肺T细胞中均存在三种Fringe表达。哮喘组肺组织及肺T细胞的RFNGmRNA表达较对照组增加（肺组织：0.92±0.35比0.51±0.13,P〈0.01;肺T细胞：0.33±0.06比0.18±0.07,P〈0.01）;LFNGmRNA表达较对照组减少（肺组织：0.77±0.32比1.61±0.31,P〈0.01;肺T细胞：0.49±0.19比0.71±0.03,P〈0.01）。MFNG在肺组织中的表达无明显差异（肺组织：1.44±0.29比1.70±0.44,P〉0.05）,但MFNG在肺T细胞中的表达明显减少（0.11±0.03比0.52±0.18,P〈0.01）。肺组织中三种Fringe蛋白表达与肺组织的mRNA结果相似。哮喘组的RFNG蛋白表达高于对照组（1.17±0.04比0.68±0.07,P〈0.05）,MFNG蛋白表达在两者之间没有明显的差异（8.10±0.60比9.12±0.07,P〉0.05）,而LFNG的蛋白表达则低于对照组（4.11±0.38比6.41±0.11,P〈0.05）。结论三种Fringe的异常表达可能与支气管哮喘的发病有关。     

人谷胱甘肽硫转移酶P1基因真核表达体系的构建及在A549细胞中的表达

目的:构建人谷胱甘肽硫转移酶P1(GSTP1)基因的真核表达载体,转染A549细胞,实现其真核表达.方法:以本室保存的重组质粒(pMAL-C2x-GSTP1)为模板;根据GSTP1全基因组序列设计GSTP1 PCR引物,扩增GSTP1片段;限制性内切酶酶切PCR产物和pcDNA3.0空质粒,T4 DNA连接酶连接酶切产物,重组质粒转化E.coli DH5α;提取质粒经酶切、PCR和序列测定后,用Primer Premier 5.0进行序列分析.测序正确的重组质粒和空质粒用脂质体转染法分别转染A549细胞,经G418筛选,获得阳性克隆,运用RT-PCR、Western Blot等技术进行鉴定,同时观察细胞的生长变化.结果:质粒酶切电泳和特异PCR均可见0.63 kb的目的基因片段,测序结果与GenBank中人GSTP1序列一致,基因登录号:BC010915.成功转染A549细胞,实现表达,获得GSTP1蛋白.结论:成功构建pcDNA3.0-GSTP1真核表达细胞系,为进一步研究其在解毒致癌原、预防肺癌发生及其与职业性肺癌的关系奠定了基础.     

反义caveolin-1对实质肿瘤细胞中β3-半乳糖基转移酶7表达的调节作用

目的:研究反义caveolin-1对实质肿瘤细胞中β3-半乳糖基转移酶7(β3GalT7)表达的调节,以期阐明caveolin-1与β3GalT7的相关性。方法:运用脂质体介导转染人工合成的caveolin-1反义核苷酸(ASODN)至人类4种实质肿瘤细胞中,通过荧光显微镜、RT-PCR及蛋白质印迹检测β3GalT7表达的变化。结果:转染反义caveolin-1后的4种实质肿瘤细胞中β3GalT7均有明显的增强。结论:表明caveolin-1调节肿瘤细胞中β3GalT7的表达,且与β3GalT7的表达呈负相关。     

人类β1，3半乳糖基转移酶7对人4IgB7-H3的修饰作用初探

目的:探讨人4IgB7-H3基因转染人胃癌细胞株SGC7901后人类β1,3半乳糖基转移酶7(β1,3-galacto-syltransferase 7,β3GalT7)的表达变化,以期发现4IgB7-H3与β3GalT7的相互关系。方法:脂质体介导重组逆转录病毒载体pEGZ-Term/4IgB7-H3转染SGC7901细胞,筛选获得稳定表达4IgB7-H3的亚克隆细胞株,通过RT-PCR和蛋白质印迹方法检测β3GalT7的表达。结果:成功获得稳定表达4IgB7-H3的亚克隆细胞株SGC7901/4IgB7-H3;β3GalT7随4IgB7-H3的表达上调而上调。结论:4IgB7-H3蛋白的修饰成熟可能需要β3GalT7的作用。     

正、反义β-1,4-半乳糖基转移酶V表达质粒在星形胶质细胞瘤细胞中的转染与鉴定

目的：构建β-1，4-半乳糖基转移酶-V(β-1，4-GalTV)正、反义表达质粒，并将其转染到人脑星形胶质细胞瘤细胞SHG-44中，为探讨神经胶质瘤细胞表达β-1，4-GalTV的生物学意义提供研究基础。方法：构建β-1，4-GalTV表达质粒，并将其转染到人脑星形胶质细胞瘤细胞SHG-44中；用Western印迹和Northern印迹鉴定转染情况。结果：通过酶切鉴定和测序分析，实验成功构建β-1，4-GalTV表达质粒。将构建的表达质粒转染到胶质细胞瘤细胞SHG-44中，经鉴定表明，转染的正义表达质粒能增加胶质细胞瘤细胞SHG-44中的β-1，4-GalTV表达量，而转染反义质粒则能降低细胞中β-1，4-GalTV表达量。结论：正、反义β-1，4-GalTV表达质粒在人脑星形胶质细胞瘤细胞SHG-44中的稳定转染和表达，对分析胶质瘤细胞表达β-1，4-GalTV的意义如对肿瘤细胞的增殖、迁移和黏附等的影响提供了研究基础。     

结核分枝杆菌鼠李糖基转移酶基因(wbbL)的克隆和表达

[目的 ]从结核分枝杆菌基因组DNA中克隆鼠李糖基转移酶基因 (rhamnosyltransferase ,wbbL) ,并利用 pET16b表达载体在大肠杆菌BL2 1(DE3)菌株中高效表达wbbL基因产物 -鼠李糖基转移酶。 [方法 ]利用PCR方法从结核分枝杆菌H 37Rv菌株的基因组DNA中扩增出wbbL基因 (90 6bp)并克隆到 pMD18-T克隆载体中 ,经DNA序列测定证实为正确的基因后 ,将其亚克隆到表达载体 pET16b中并在大肠杆菌BL2 1(DE3)中表达wbbL基因产物。 [结果 ]1)从结核分枝杆菌H37Rv菌株的基因组DNA中PCR扩增出正确的wbbL基因 ;2 )经IPTG诱导wbbL基因在BL2 1(DE3)中高效表达出wbbL基因产物。 [结论 ]1)用具高保真性的LATaqDNA聚合酶所扩增的结核分枝杆菌的wbbL基因经BLAST分析与结核分枝杆菌基因组数据库 (http :/ /www .sanger .ac .uk)中所公布的序列完全一致 ;2 )从大肠杆菌BL2 1(DE3)所获得的大量鼠李糖基转移酶 ,为进一步纯化该酶并研究其酶促反应动力学特性提供了物质保障。     

β-1,4-半乳糖基转移酶Ⅱ、Ⅴ表达的亚细胞结构定位研究

目的 :研究 β1,4-半乳糖基转移酶II和V(β1,4-galactosyltransferaseⅡandⅤ ,β -1,4-GalT -ⅡandⅤ )蛋白表达的亚细胞结构定位。方法 :构建 β -1,4-GalT -Ⅱ和Ⅴ融合绿色荧光蛋白 (greenfluorescenceprotein ,GFP)表达质粒 ,分别将构建的质粒转染到PC12细胞和肝癌 772 1细胞中 ,荧光显微镜下观察 β -1,4-GalT -Ⅱ和Ⅴ在其中表达的亚细胞结构定位。 结果 :β -1,4-GalT -Ⅱ和Ⅴ主要表达在这两种细胞细胞核旁的高尔基复合体。结论 :β -1,4-GalT -Ⅱ和Ⅴ主要分布在高尔基复合体上 ,提示它们可能是在高尔基复合体参与蛋白质的糖链修饰