人肝再生增强因子上调细胞周期素B2基因的表达

目的研究人肝再生增强因子(ALR)转基因表达对细胞周期素B2启动子(cyclin B2p)转录的调节作用,从而进一步探讨ALR的生物学作用及机制。方法根据文献确定细胞周期素B2p区域,聚合酶链反应(PCR)扩增细胞周期素B2p,克隆至报告基因表达载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-cyclin B2p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞系,同时与ALR的真核表达载体pcDNA3．1(-)-ALR共转染HepG2细胞系,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测报告基因氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。结果成功构建pCAT3- cyclin B2p报告基因表达载体;pCAT3-cyclin B2p与pcDNA3．1(-)-ALR共转染HepG2细胞系的CAT表达活性是pCAT3-Basic空载体的25．13倍,是pCAT3-cyclin B2p单转染的2．60倍。结论人ALR对细胞周期素B2p基因的转录表达具有反式激活作用。     

双环醇下调细胞周期素B2基因启动子转录活性研究

目的探讨双环醇对细胞周期素(cyclin)B2启动子转录活性的调节作用.方法根据文献报道的结果确定细胞周期素B2的启动子DNA序列区域,以聚合酶链反应(PCR)扩增细胞周期素启动子(B2p),克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-cyclinB2p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性:并与双环醇共刺激的HepG2细胞,用ELISA法检测CAT的表达活性.结果成功获得细胞周期素B2启动子的止确克隆.pCAT3-cyclinB2p和双环醇(106Mol/L)瞬时转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3-Basic空载体的2.4倍,pCAT3-cyclinB2p的0.35倍.结论细胞周期素B2启动子有顺式激活下游基因的活性,双环醇具有对细胞周期素B2基因有下调作用.     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A上调硫氧还蛋白还原酶1基因表达的研究

目的探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A对硫氧还蛋白还原酶1(TXNRD1)启动子转录的激活作用.方法以我室构建的丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式调节基因的cDNA文库抑制性消减杂交(SSH)筛选结果及基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学技术确定TXNRD1的启动子区域(TXNRD1p),聚合酶链反应(PCR)扩增TXNRD1p,克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-TXNRD1p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与pcDNA3.1(-)-NS5A共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性.结果pCAT3-TXNRD1p和pcDNA3.1(-)-NS5A瞬时转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3-Basic空载体的9.6倍,pCAT3-TXNRD1p的2.1倍.本实验进一步验证了我室利用SSH技术及基因表达谱技术发现的HCV NS5A蛋白反式激活TXNRD1基因转录作用的结果.结论我室克隆的TXNRD1启动子有顺式激活下游基因的活性;HCV的NS5A蛋白具有对TXNRD1基因启动子的反式激活作用.     

肝再生增强因子对细胞周期素依赖性激酶1基因表达的影响

目的研究人肝再生增强因子(ALR)对细胞周期素依赖性激酶1启动子(CDK1p)转录调节的作用,探讨ALR的生物学作用机制。方法根据GenBank中CDK1p序列的分析设计引物,应用聚合酶链反应(PCR)扩增人CDK1基因启动子基因序列,并克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建CDK1启动子报告基因表达载体pCAT3-CDK1p,以该质粒转染HepG2细胞系,并同时与pcDNA3.1(-)-ALR共转染HepG2细胞系,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测报告基因氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。结果 pCAT3-CDK1p组CAT表达活性明显高于pCAT3-basic组,差异有统计学意义,pCAT3-CDK1p与pcDNA3.1(-)-ALR共转染组的CAT表达活性明显低于pCAT3-CDK1p组,差异有统计学意义。结论 CDK1启动子有顺式激活下游基因的活性,ALR对CDK1基因有下调作用。     

乙型肝炎病毒X蛋白上调硫氧还蛋白还原酶1基因表达的研究

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)对硫氧还蛋白还原酶1(TXNRD1)启动子转录的激活作用.方法利用生物信息学技术确定TXNRD1的启动子区域(TXNRD1p),聚合酶链反应(PCR)技术扩增TXNRD1p,克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-TXNRD1p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测报告基因氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与HBxAg真核表达载体pcDNA3.1(-)-X共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性.结果结果表明,pCAT3-TXNRD1p和pcDNA3.1(-)-X瞬时转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3-Basic空载体的19.3倍,pCAT3-TXNRD1p的3.9倍.结论克隆的TXNRD1启动子有顺式激活下游基因的活性;HBxAg具有对TXNRDl的反式激活作用.     

乙型肝炎病毒表面抗原主蛋白上调硫氧还蛋白还原酶1基因的表达

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原主蛋白(SHBs)对硫氧还蛋白还原酶1(TXNRD1)启动子转录的激活作用.方法 以我室构建的SHBs基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学技术确定TXNRD1的启动子区域(TXNRD1p),聚合酶链反应(PCR)扩增TXNRD1p,克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-TXNRD1p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞系,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与pcDNA3.1(-)-SHBs共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性.结果 pCAT3-TXNRD1p与pcDNA3.1(-)-SHBs瞬时共转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3-TXNRD1p的7.4倍,是pCAT3-TXNRD1p与pcDNA3.1(-)-empty共转染的2.5倍.结论 我室克隆的TXNRD1启动子有顺式激活下游基因的活性;HBV的SHBs蛋白可以上调TXNRD1的启动子活性.     

人肝再生增强因子上调硫氧还蛋白还原酶1基因表达的研究

目的：探讨人肝再生增强因子(hALR)对硫氧还蛋白还原酶1(TXNRD1)启动子转录的激活作用。方法：以我室构建的hALR的cDNA基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学技术确定TXNRD1的启动子区域(TXNRD1p)．聚合酶链反应(PCR)扩增TXNRD1p,亚克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-TXNRD1P报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞系,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测报告基因氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与表达载体pcDNA3．1(-)-ALR共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性。结果：pCAT3-TXNRD1p和pcDNA3．1(-)-ALR瞬时转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3-Basic空载体的10.4倍,pcAT3-TXNRD1p的2．1倍。本实验进一步验证了我室利用基因表达谱技术研究ALR蛋白反式激活作用的结果。结论：我室克隆的TXNRD1启动子有顺式激活下游基因的活性;hALR蛋白具有对TXNRD1的反式激活作用。     

乙型肝炎病毒前-S2蛋白下调诱导型一氧化氮合酶基因启动子的转录活性

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)前-S2(pre-S2)蛋白对诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因启动子转录的调节作用。方法利用生物信息学技术确定iNOS基因的启动子区域(iNOSp)和3个缺失突变体的基因序列,聚合酶链反应(PCR)分别扩增iNOSp和3个缺失突变体的基因序列,分别克隆至报告基因表达载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-iNOSp载体;以构建的这4种报告基因表达载体,分别转染人肝母细胞瘤细胞系HepG2,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与真核表达载体pcDNA3.1(-)-HBV pre-S2共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性。结果成功获得iNOS基因启动子和3个缺失突变体的正确克隆,p1-iNOSp、p3-iNOSp启动子和pcDNA3.1 (-)-HBV pre-S2瞬时共转染HepG2细胞时,iNOS启动子的转录活性明显下降,HBV pre-S2蛋白对p1- iNOSp、p3-iNOSp表达活性的抑制率分别是54.7%和79.5%,p2-iNOSp、p4-iNOSp与pcDNA3.1(-)-HBV pre-S2共转染HepG2细胞后,HBV pre-S2蛋白对p2-iNOSp、p4-iNOSp表达活性没有明显的调节作用。重复试验得到了相似的结果。结论HBV pre-S2蛋白在细胞内的表达对iNOS启动子的转录活性具有明显的下调作用。     

新基因TAHCCP1编码蛋白对NS3TP6基因启动子转录活性的调节

目的探讨丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白反式激活基因TAHCCP1编码蛋白对NS3TP6启动子转录活性的调节。方法以我室前期克隆的TAHCCP1基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学方法确定NS3TP6基因的启动子区域（NS3TP6-p）,聚合酶链反应（PCR）扩增并克隆至真核报告载体pCAT3-basic中,构建重组报告质粒pCAT3-NS3TP6-p;以该质粒单独或与pcDNA3．1（-）-TAHCCP1共转染肝癌细胞系HepG2细胞,用酶联免疫吸附法（ELISA）检测氯霉素乙酰转移酶（CAT）的表达活性;观察细胞中表达的TAHCCP1蛋白对NS3TP6启动子转录活性的调节。结果构建的重组表达载体pCAT3-NS3TP6-P在HepG2细胞中能够启动报告基因CAT表达,表明克隆的NS3TP6启动子有指导下游基因转录表达的活性;共转染实验中pCAT3-NS3TP6-p与pcDNA3．1（-）-TAHCCP1组CAT的表达活性是对照组的3．1倍,说明TAHCCP1蛋白能够在转录水平反式激活NS3TP6基因启动子活性。结论本实验验证了基因芯片的实验结果准确性,进一步完善了新基因TAHCCP1的生物学功能,为深入理解HCV核心蛋白的反式激活调节机制提供了新的依据。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A调节新生多肽复合物启动子转录活性的研究

目的探讨丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白5A（NS5A）对新生多肽相关复合物（NACA）启动子转录活性的影响。方法以我室构建的能够表达NS5A蛋白的pcDNA3．1（-）-NS5A质粒和含有NACA基因启动子的PCAT3-NACA报告基因质粒共转染HepG2细胞系设为实验组，同时PCAT3-NACA单独转染HepG2细胞系作为对照组。用酶联免疫吸附法检测氯霉素乙酰转移酶（CAT）的表达活性。结果pCAT3-NACA单独转染HepG2细胞的CAT酶表达活性与pCAT3-NACA和pcDNA3．1（-）-NS5A共转染组HepG2细胞的CAT酶表达活性比较，共转染组A值下降了79．3％。结论HCV NS5A能够抑制NACA启动子的活性，对NACA的表达具有下调作用。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5A-TP9启动子序列的确定及转录活性的鉴定

目的：阐明丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A(NS5A)反式激活基因NS5A-TP9表达的调控机制。方法：选取NS5A-TP9基因翻译起始密码子ATG上游661bp的基因组DNA序列作为启动子序列，应用聚合酶链反应(PCR)技术，以肝母细胞瘤细胞系HepG2基因组DNA为模板，扩增该启动子DNA片段，将其克隆至pCAT3中，构建pCAT3-NS5A-TP9-promoter报告基因表达载体，以该质粒转染HepG2细胞，用酶联免疫吸附法(ELISA)检测报告基因编码产物氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。结果：发现质粒pCAT3-NS5A-TP9-promoter具有指导报告基因CAT转录表达的启动子活性，CAT的吸光度(A值)是缺乏启动子序列对照质粒pCAT3的13．9倍。结论：本研究克隆的启动子DNA序列具有指导下游基因转录的启动子活性，这一结果为研究新基因NS5A-TP9转录表达的调节机制，进一步阐明丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A的作用机制奠定了基础。     

基因表达谱芯片筛选NS5ATP2剪切体NS5ATP2-512转染细胞差异表达基因

目的应用基因芯片技术检测丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活基因NS5ATP2剪切体512的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明NS5ATP2剪切体512蛋白可能的分子生物学功能。方法设计并合成NS5ATP2基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增NS5ATP2蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的NS5ATP2编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,在此过程中发现其剪切体NS5ATP2512并构建真核表达载体pcDNA3.1(-)NS5ATP2512。以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析。结果构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误。提取高质量的mRNA,逆转录为cDNA,进行DNA芯片技术分析。在1152个基因表达谱的筛选中,发现有14个基因表达水平显著上调,15个基因表达水平显著下调。结论应用基因表达谱芯片技术成功筛选了NS5ATP2剪切体NS5ATP2512转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明NS5ATP2512蛋白可能的生物学功能提供依据。