Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering

Repair of soft tissue defects resulting from lumpectomy or mastectomy has become an important rehabilitation process for breast cancer patients. This study aimed to provide an adipose tissue engineering platform for soft tissue defect repair by combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix (hDAM) and human adipose-derived stem cells (hASCs). To derive hDAM incised human adipose tissues underwent a decellularization process. Effective cell removal and lipid removal were proved by immunohistochemical analysis and DNA quantification. Scanning electron microscopic examination showed a three-dimensional nanofibrous architecture in hDAM. The hDAM included collagen, sulfated glycosaminoglycan, and vascular endothelial growth factor, but lacked major histocompatibility complex antigen I. hASC viability and proliferation on hDAM were proven in vitro. hDAM implanted subcutaneously in Fischer rats did not cause an immunogenic response, and it underwent remodeling, as indicated by host cell infiltration, neovascularization, and adipose tissue formation. Fresh fat grafts (Coleman technique) and engineered fat grafts (hDAM combined with hASCs) were implanted subcutaneously in nude rats. The implanted engineered fat grafts maintained their volume for 8 weeks, and the hASCs contributed to adipose tissue formation. In summary, the combination of hDAM and hASCs provides not only a clinically translatable platform for adipose tissue engineering, but also a vehicle for elucidating fat grafting mechanisms.     

Composite hydrogel scaffolds incorporating decellularized adipose tissue for soft tissue engineering with adipose-derived stem cells

An injectable tissue-engineered adipose substitute that could be used to deliver adipose-derived stem cells (ASCs), filling irregular defects and stimulating natural soft tissue regeneration, would have significant value in plastic and reconstructive surgery. With this focus, the primary aim of the current study was to characterize the response of human ASCs encapsulated within three-dimensional bioscaffolds incorporating decellularized adipose tissue (DAT) as a bioactive matrix within photo-cross-linkable methacrylated glycol chitosan (MGC) or methacrylated chondroitin sulphate (MCS) delivery vehicles. Stable MGC- and MCS-based composite scaffolds were fabricated containing up to 5 wt% cryomilled DAT through initiation with long-wavelength ultraviolet light. The encapsulation strategy allows for tuning of the 3-D microenvironment and provides an effective method of cell delivery with high seeding efficiency and uniformity, which could be adapted as a minimally-invasive in situ approach. Through in vitro cell culture studies, human ASCs were assessed over 14 days in terms of viability, glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GPDH) enzyme activity, adipogenic gene expression and intracellular lipid accumulation. In all of the composites, the DAT functioned as a cell-supportive matrix that enhanced ASC viability, retention and adipogenesis within the gels. The choice of hydrogel also influenced the cell response, with significantly higher viability and adipogenic differentiation observed in the MCS composites containing 5 wt% DAT. In vivo analysis in a subcutaneous Wistar rat model at 1, 4 and 12 weeks showed superior implant integration and adipogenesis in the MCS-based composites, with allogenic ASCs promoting cell infiltration, angiogenesis and ultimately, fat formation.     

兔脂肪干细胞向髓核样细胞分化的实验研究

目的 探讨脂肪干细胞（ADSCs）向髓核细胞（NPCs）分化的潜能,证实脂肪干细胞可以作为种子细胞用于组织工程髓核研究.方法 提取兔ADSCs,进行培养传代至第3代,提取培养异体兔NPCs,将第3代ADSCs与NPCs共同培养作为共同培养组,将NPCs单纯培养作为单纯培养组.倒置显微镜进行细胞观察,通过RT-PCR技术测定Ⅱ型胶原mRNA和聚集蛋白多糖mRNA,测定其在共同培养3 d、7 d、14 d、21 d的表达量,两组进行对比分析.结果 共同培养组聚集蛋白多糖mRNA及Ⅱ型胶原蛋白mRNA表达量均明显高于单纯培养组.两组聚集蛋白多糖mRNA表达量比较,t=3.436,P〈0.05;两组Ⅱ型胶原蛋白表达量比较,t=2.733,P〈0.05,差异有统计学意义.结论 ADSCs具有向NPCs 分化潜能,在适当的培养条件下与NPCs共同培养可转化为髓核样细胞,同时能够促进NPCs生长.     

脂肪干细胞在软骨组织工程中的应用

软骨是最早应用组织工程技术成功构建的组织之一,但由于缺乏合适的软骨构建种子细胞,因此其发展相对落后。随着干细胞研究的兴起,脂肪干细胞（ASC）因其具有分布广泛、可利用细胞量大、取材容易等优点,为ASC作为种子细胞应用于组织工程研究提供了可能;但是ASC构建软骨组织的效果却不如骨髓间充质干细胞（BMSC）理想。因此ASC在软骨组织工程中的应用仍面临着诸多问题与挑战,其中最核心的问题是如何提高ASC成软骨的效率。为此从如何纯化脂肪来源细胞、尽可能保持其中干细胞的生物学特性并优化软骨诱导方案3个方面予以综述,为提高ASC成软骨的效率提供参考。     

脂肪组织血管基质部分中克隆形成细胞治疗膝骨关节炎的能力

背景：脂肪组织消化后得到的血管基质部分是多种细胞的混合体,其中以克隆样生长的细胞组分可能是真正具有“干性”维持能力的脂肪间充质干细胞。目的：分离、传代、培养脂肪组织血管基质部分中的克隆形成细胞,并检测其在动物模型中修复膝关节软骨的能力。方法：培养新鲜分离得到的脂肪组织血管基质部分,挑选其中以克隆样生长的贴壁细胞,消化、传代、培养至第3代。通过手术建立骨关节炎兔模型,将第3代克隆形成细胞移植入模型兔关节腔,与未进行细胞移植治疗的模型兔进行比较,观察兔膝关节软骨的再生情况。结果与结论：脂肪组织中血管基质部分细胞接种后第3天,贴壁细胞中出现克隆样生长的细胞集落,生长至第5天时,克隆样生长的细胞集落数和周围的单个细胞数均增加,传代至第3代时,仍然呈克隆样的集落生长,梭形形态。大体观察和MRI检查此类克隆形成细胞能在关节腔内帮助软骨修复,增加滑液分泌,同时有助于控制炎症,溃疡面积呈缩小趋势。实验结果有助于优化脂肪间充质干细胞的体外分离、培养体系,并为临床上治疗骨关节炎提供了新的思路。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

人脂肪干细胞的提取和鉴定

背景：脂肪干细胞是存在于脂肪中的全能干细胞,具备自我更新能力与多向分化潜能,遗传背景相当稳定,体内植入后免疫排斥少,是一种比较理想的种子细胞。目的：提取人大网膜脂肪干细胞,并进行成脂和成骨分化能力鉴定。方法：收集手术患者大网膜的脂肪组织,经Ⅰ型胶原酶消化、过滤、离心后进行原代培养,观察细胞生长状态;用细胞计数法绘制人脂肪干细胞增殖曲线,计算处于对数生长期的倍增时间;用相应的定向诱导液诱导人脂肪干细胞向脂肪细胞及骨细胞方向分化,并用油红O染色、茜素红染色进行鉴定。结果与结论：从手术患者大网膜脂肪组织中成功分离人脂肪干细胞,贴壁生长的人脂肪干细胞为长梭形,形态类似成纤维细胞。第3代人脂肪干细胞生长曲线呈S形,对数生长期人脂肪干细胞的倍增时间为45.90 h。人脂肪干细胞经成脂、成骨定向诱导分化2,3周后,油红O染色显示细胞内有大小不等的橘红色脂肪滴,茜素红染色可见着橘红色的典型钙化结节,提示所培养的脂肪干细胞具有向脂肪细胞、骨细胞系分化的能力。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

脂肪干细胞诱导分化的现状及前景

背景：脂肪干细胞是由中胚层发育而来的多能干细胞,在特殊的生长因子和环境等诱导培养条件下,可以向不同的谱系分化。 目的：详细阐述脂肪干细胞诱导分化的条件及鉴定方法。 方法：应用计算机检索万方数据库及PubMed数据库2005至2014年10年间的文献,中文检索词为“脂肪干细胞,诱导,分化”;英文检索词为“adipose derived stem cells,differentiation”。依据纳入排除标准选择37篇文献进行归纳总结。 结果与结论：脂肪干细胞在抗坏血酸、胰岛素、地塞米松、转化生长因子β作用下可向软骨细胞分化;成脂诱导液的配方包括3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、胰岛素、地塞米松、吲哚美辛;成骨分化常用的诱导剂包含地塞米松或维生素D3、抗坏血酸,β-甘油磷酸钠;碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子及维生素B27可联合应用诱导脂肪干细胞成神经分化;向心肌细胞分化普遍应用的诱导因子是5-氮杂胞苷;血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子共同作用可以诱导脂肪干细胞向血管内皮细胞分化。随着分子生物学和细胞生物学的迅速发展,脂肪干细胞的分化研究也会更加深入,在目前对脂肪干细胞诱导分化现象观察的基础上,应加强对其内在的分子机制及调控脂肪干细胞可塑性的基因和蛋白的研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

成人脂肪源间充质干细胞在小鼠体内具有血液血管干细胞特性

目的:观察成人脂肪源Flk1+ CD31- CD34-细胞在小鼠体内是否具有血液血管干细胞的特性。方法:将男性成人脂肪源Flk1+ CD31- CD34-细胞经尾静脉输入6-8周龄、接受亚致死剂量射线照射的非肥胖型糖尿病及严重联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠体内(每只输入剂量为105,悬于0.4m LRPMI-1640培养基中),对照组接受同等剂量的RPMI-1640培养基中。2个月后处死小鼠。用聚合酶链式反应、流式细胞术、三色荧光法及荧光原位杂交法检测脂肪源Flk1+ CD31- CD34-细胞在实验小鼠骨髓及消化系统内的分化情况。结果:脂肪源Flk1+ CD31- CD34-细胞在单细胞水平上在NOD/SCID小鼠体内可分化为内皮细胞和造血细胞。结论:脂肪源Flk1+ CD31- CD34-细胞在体内具有血液血管干细胞的特性,这类细胞有可能作为种子细胞用以治疗血液和血管性疾病。     

miR-302对脂肪间充质干细胞向成脂和成骨分化的调控

背景：间充质干细胞具有自我更新能力,在一定条件下能够分化为一定谱系的细胞,但很多机制至今未明。 目的：探究miR-302b对脂肪间充质干细胞向成脂和成骨分化的调控作用。 方法：miR-302模拟物转染作用于脂肪间充质干细胞进行成骨成脂诱导,对照组转染miR-302阴性对照模拟物miR-NC。采用碱性磷酸酶染色及活性分析、茜素红染色、油红O染色和萃取实验观察miR-302上调对脂肪间充质干细胞成骨和成脂分化的影响,以及Western blot检测miR-302上调后成骨分化转录因子Runx2和成骨早期标志物碱性磷酸酶在脂肪间充质干细胞中的表达。 结果与结论：①碱性磷酸酶沉淀物在miR-302过表达细胞中产生的量均明显少于对照组,进一步发现miR-302过表达实验组碱性磷酸酶活性明显低于对照组(P < 0.05)。②miR-302过表达明显抑制了矿物质沉积钙结节的形成,miR-302上调实验组橘红色的钙结节明显少于对照组。③miR-302过表达实验组油红O染色阳性的细胞数明显高于对照组,进一步表明实验组细胞萃取得到的油红O吸光度值明显上升(P < 0.05)。④成骨诱导第6天时成骨分化转录因子Runx2和成骨早期标志物碱性磷酸酶在miR-302过表达的细胞中都有不同程度的下降。⑤以上结果表明miR-302的上调能够抑制脂肪间充质干细胞的成骨分化,同时促进其向成脂分化。miR-302在间充质干细胞向成脂和成骨分化平衡发挥了双向调控作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

血管内皮生长因子165转染可促进脂肪间充质干细胞增殖

背景：血管内皮生长因子是目前最重要的促血管新生因子之一,在脂肪移植中可促进移植物的血运重建,提高成活率。 目的：探讨血管内皮生长因子165基因转染促进脂肪间充质干细胞增殖的作用。 方法：利用目的片段重组血管内皮生长因子165基因入腺病毒pAdEasy-1系统,包装病毒并测定滴度,同理包装空病毒。将包装成功的两种病毒液分别以100的最佳感染复数转染入脂肪间充质干细胞内,以未转染细胞为空白组。采用RT-PCR和Western blot法检测各组转染细胞中血管内皮生长因子165 mRNA和蛋白的表达,MTT法检测各组细胞的增殖情况。 结果与结论：实验组血管内皮生长因子165 mRNA和蛋白表达量高于对照组和空白组(P < 0.05);实验组转染脂肪间充质干细胞后分裂增殖程度显著增加,与对照组和空白组比较差异有显著性意义(P < 0.05),结果表明腺病毒介导的血管内皮生长因子165基因转染脂肪间充质干细胞后可以持续表达目的蛋白,同时也能促进脂肪间充质干细胞的显著增殖。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

脂肪干细胞在骨组织工程中的研究进展

各种原因导致的骨损伤甚至骨缺损会给患者带来较大的经济及社会负担,而骨组织工程研究能为治疗骨损伤提供新的方向。脂肪干细胞因其来源广泛、易于获取等特性在骨组织工程中发挥着重要作用,且脂肪干细胞在生长因子、机械刺激、各种信号通路的适宜刺激下能进行自我增殖并成骨分化,形成骨组织以治疗骨损伤及骨缺损,改善骨损伤带来的一系列症状。     

荧光磁性纳米粒子标记三维培养系统中的脂肪间充质干细胞

背景：荧光磁性纳米粒子具有量子点和磁粒子的双重特质,生物相容性好,能够被胞吞入细胞质高效地标记细胞。 目的：验证荧光磁性纳米粒子标记人脂肪间充质干细胞的可行性。 方法：抽脂术抽取健康人脂肪组织,采用Ⅰ型胶原酶消化法分离,贴壁培养纯化人脂肪间充质干细胞。取第6代脂肪间充质干细胞与荧光磁性纳米粒子孵育过夜,采用普鲁士蓝染色、激光共聚焦显微镜检测体外标记细胞情况,荧光成像系统观察荧光磁性纳米粒子标记的干细胞体内示踪效果。 结果与结论：普鲁士蓝染色显示荧光磁性纳米粒子以蓝色颗粒的形式分散于脂肪间充质细胞胞质中。激光共聚焦显微镜观察显示人脂肪间充质干细胞的细胞核被Hoechest33258染成蓝色,细胞质被标记成绿色;荧光成像结果表明标记的人脂肪间充质干细胞具有很好的成像效果。结果提示荧光磁性纳米粒子可以作为示踪剂在体外标记人脂肪间充质干细胞,为脂肪间充质干细胞的移植转化研究提供新方法。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

Dermis isolated adult stem cells for cartilage tissue engineering

Adult stem cells from the dermal layer of skin are an attractive alternative to primary cells for meniscus engineering, as they may be easily obtained and used autologously. Recently, chondroinducible dermis cells from caprine skin have shown promising characteristics for cartilage tissue engineering. In this study, their multilineage differentiation capacity is determined, and methods of expanding and tissue engineering these cells are investigated. It was found that these cells could differentiate along adipogenic, osteogenic, and chondrogenic lineages, allowing them to be termed dermis isolated adult stem cells (DIAS cells). Focusing on cartilage tissue engineering, it was found that passaging these cells in chondrogenic medium and forming them into self-assembled tissue engineered constructs caused upregulation of collagen type II and COMP gene expression. Further investigation showed that applying transforming growth factor β1 (TGF-β1) or bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) to DIAS constructs caused increased sulfated glycosaminoglycan content. Additionally, TGF-β1 treatment caused significant increases in compressive properties and construct contraction. In contrast, BMP-2 treatment resulted in the largest constructs, but did not increase compressive properties. These results show that DIAS cells can be easily manipulated for cartilage tissue engineering strategies, and may also be a useful cell source for other mesenchymal tissues.     

Epigenetic programming of mesenchymal stem cells from human adipose tissue

Stromal stem cells identified in various adult mesenchymal tissues (commonly called mesenchymal stem cells [MSCs]) have in past years received more attention as a result of their potential interest as replacement cells in regenerative medicine. An abundant and easily accessible source of adult human MSCs are stem cells harvested from liposuction material. Similarly to bone marrow-derived MSCs, human adipose tissue-derived stem cells (ASCs) can give rise to a variety of cell types in vitro and in vivo; however, they have a propensity to differentiate into primarily mesodermal lineages. Even so, their capacity to differentiate into nonadipogenic mesodermal pathways seems to be restricted. Emerging DNA methylation profiles at adipogenic and nonadipogenic gene promoters in freshly isolated, cultured, or differentiated ASCs aim to provide an epigenetic explanation for this restrictive differentiation potential. A review of these studies indicates that human ASCs are epigenetically marked by mosaic hypomethylation of adipogenic promoters, whereas nonadipogenic lineage-specific promoters are hypermethylated. Surprisingly, in vitro differentiation toward various pathways maintains the overall methylation profiles of undifferentiated cells, raising the hypothesis that ASCs are at least epigenetically preprogrammed for adipogenesis. Novel attempts at reprogramming the epigenome of MSCs have been initiated to enhance the differentiation capacity of these cells.     

体外扩增自体脂肪来源干细胞移植恢复鼻黏膜功能

背景：体外扩增的自体脂肪来源干细胞具有多向分化的潜能,在组织工程和再生医学领域具有广阔的应用前景。 目的：观察自体脂肪来源干细胞移植受损人鼻黏膜组织的结构和功能变化。 方法：选取因物理或化学因素造成鼻黏膜损害的患者10例,其中6例黏膜瘢痕,4例黏膜破溃,抽取自体脂肪组织进行脂肪来源干细胞体外分离、培养、扩增,移植前进行质量安全性检测。6例患者在黏膜瘢痕基底部、4例患者在黏膜破溃处注射移植脂肪来源干细胞(1×10⁷/cm²),共注射3次,每2次间隔15 d。末次注射移植后30,90,150 d分别行鼻腔容积、最小横断面积、黏膜纤毛清除功能测定,其中3例患者在移植前和移植后30 d,取0.1 cm×0.1 cm黏膜组织,进行苏木精-伊红染色、Masson三色染色、AB-PAS染色。 结果与结论：脂肪来源干细胞注射移植后,所有患者临床症状得到缓解。与移植前比较,脂肪来源干细胞注射移植后30,90,150 d鼻腔容积及鼻腔最小横断面积有所减少(P < 0.05),鼻黏膜纤毛清除功能有所改善,但差异无显著性意义(P > 0.05)。与移植前相比,脂肪来源干细胞移植30 d时3例患者鼻黏膜炎症明显减轻,胶原纤维排列整齐、沉积减少,杯状细胞分泌的黏蛋白增多。结果证明了体外扩增的脂肪来源干细胞可以重建鼻黏膜结构和恢复其功能。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

脂肪干细胞三维生长骨组织工程复合体的构建

背景：组织工程支架是模仿细胞赖以生长代谢的细胞外基质而构建的支架和环境,其选择、制备以及种子细胞的选择是骨组织工程领域中的一项十分重要的课题。 目的：利用几丁质凝胶/异种骨构建脂肪干细胞三维生长环境,并对其相容性进行研究。 方法：从出生8 d新西兰大白兔腹股沟获取脂肪组织,提取脂肪干细胞。脂肪干细胞经过体外成骨诱导分化后,种植于几丁质凝胶/异种骨,构建新型骨组织工程复合体,并将其设为细胞/几丁质凝胶/异种骨组;将脂肪干细胞直接种植于异种骨,构成脂肪干细胞/异种骨复合体作为细胞/异种骨组,单独异种骨为空白组。体外诱导2周后进行电镜扫描,观察细胞与支架的复合情况。 结果与结论：镜扫描观察显示几丁质凝胶充分渗透于支架的空隙内,形成一个细胞的三维生长环境,使原本只能在材料上贴壁生长的脂肪干细胞能够在三维的环境中生长,为细胞外基质的再生提供足够的空间。几丁质凝胶/异种骨悬浮诱导后的脂肪干细胞,承载了更多的细胞,减少了细胞在载体中的流失,是一种较好的骨组织工程载体。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

小鼠脂肪间充质干细胞的分离培养及肠道归巢

背景：脂肪来源间充质干细胞因其取材安全、创伤小、易纯化、增殖快等优点而备受关注。 目的：建立一种有效、快速分离培养较高纯度小鼠脂肪间充质干细胞的方法,荧光标记后探索其是否可在体内向肠道归巢。 方法：取小鼠腹股沟及附睾脂肪,用0.1%Ⅰ型胶原酶消化得到单细胞,并与剩余未消化脂肪组织块一起接种,贴壁培养获得脂肪间充质干细胞,通过细胞形态、细胞表型、生长动力学、成骨成脂分化潜能4个方面进行鉴定,并将脂肪间充质干细胞用PKH67标记后经尾静脉注射移植到溃疡性结肠炎模型小鼠体内,观察其向肠道的归巢情况。 结果与结论：脂肪间充质干细胞镜下呈梭形,快速增殖呈漩涡状排列,细胞高表达 CD29、CD44、CD90,不表达CD45。成骨诱导碱性磷酸酶染色显示有黑色颗粒生成,茜素红S染色呈红色结节,成脂诱导油红O染色显示有大量脂滴。细胞生长曲线显示第3-5天为对数增长期,细胞生长活力良好。结肠冰冻切片在荧光显微镜下可见绿色荧光光点,并随时间推移有增加趋势。以上结果表明采用胶原酶消化加组织块贴壁法体外分离培养的脂肪间充质干细胞增殖快、纯度高,可向成骨成脂细胞分化,在体内可向结肠归巢并增殖。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：