梅毒螺旋体TP0993重组蛋白的表达、纯化及免疫活性分析

目的 探讨梅毒螺旋体重组蛋白TP0993在梅毒血清学诊断中的应用价值.方法 通过生物信息学分析,获取TP0993基因序列,构建原核载体进行诱导表达;Ni-NTA亲合层析柱纯化重组蛋白,Western印迹检测其免疫抗原性,用重组蛋白直接注射免疫新西兰家兔,评价其免疫原性.用纯化的TP0993重组蛋白包被微孔板,建立间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,检测临床梅毒患者血清和健康体检者正常血清,同时与梅毒螺旋体明胶凝集试验(TPPA)进行比较,根据重组蛋白与梅毒阴阳性血清的反应情况,评价重组抗原在梅毒血清学诊断中的应用价值.结果 成功构建PET-28a(+)-0993原核表达载体,经表达、纯化后获得相对分子质量约为34 000的重组蛋白;Western印迹检测显示该重组蛋白能与梅毒患者阳性血清发生特异性反应;利用纯化的TP0993重组蛋白免疫新西兰兔,能诱导新西兰兔产生特异性免疫应答.以重组蛋白为包被抗原建立间接ELISA法,对TPPA法检测的480份临床血清进行检测,与TPPA法比较ELISA法的灵敏度为88.3％,特异度为85.8％,ELISA法与TPPA法符合率为86.5％.结论 重组表达的TP0993蛋白具有较好的免疫活性,可作为梅毒血清学诊断的候选抗原之一.     

梅毒螺旋体重组蛋白Tp0136的表达、纯化及免疫活性分析

【摘要】 目的 克隆并表达梅毒螺旋体Tp0136基因,对其表达产物进行纯化以及免疫活性分析。方法 全基因合成Tp0136基因,构建E.coli表达载体;诱导表达并纯化重组蛋白,用SDS-PAGE和Western印迹鉴定。用纯化的重组蛋白Tp0136免疫新西兰兔,并以重组Tp0136作为包被抗原建立间接酶联免疫吸附试验（ELISA）以鉴定其免疫原性,Western印迹检测梅毒阳性血清鉴定其免疫反应性。结果 成功构建E.coli表达载体pET28a-Tp0136,并表达和纯化出膜蛋白Tp0136,相对分子质量为50 000,纯度 > 95%。用重组蛋白Tp0136免疫新西兰兔,能刺激其产生高滴度抗体,具有较强的免疫原性。Western印迹显示其能与梅毒阳性血清发生特异性反应,具有较好的免疫反应性。结论 成功表达具有Tp0136全基因和较强免疫活性的膜蛋白,Ｔp０１３６可能在梅毒螺旋体的免疫致病机制中起到重要作用。     

梅毒螺旋体Tp0821基因的克隆、表达、纯化及免疫活性研究

目的 构建梅毒螺旋体(Tp)膜脂蛋白Tp0821的重组质粒,表达、纯化其相应蛋白,研究其免疫活性.方法 构建重组质粒pQE32/Tp082l,诱导表达其相应蛋白,以纯化的重组蛋白免疫新西兰兔,制备多克隆抗体并测定其效价.建立间接ELISA法,检测80份梅毒参比血清、临床经FTA-ABS确诊的阳性血清各150份.结果 成功构建重组质粒pQE32/Tp0821,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白分子量与预期结果相符.将亲和层析后所获高纯度重组蛋白免疫新西兰兔,制备的多克隆抗体效价达1:6400.间接ELISA法检测梅毒参比血清、临床梅毒患者血清,与间接免疫荧光螺旋体抗体吸附试验(FTA-ABS)法比较,其灵敏度、特异度分别为92.6%和98.6%,差异有统计学意义(P<0.05).结论 Tp0821重组蛋白具有较好的免疫活性,可用于梅毒血清学检测.     

梅毒螺旋体Tp0319重组蛋白的表达及免疫活性研究

目的 克隆和表达梅毒螺旋体Tp0319基因,并对其表达产物进行免疫活性分析。方法 挑选并克隆出Tp0319免疫优势区基因,构建原核表达载体;诱导表达并纯化重组蛋白,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western印迹法鉴定;用纯化的重组蛋白免疫新西兰兔;间接ELISA法检测梅毒螺旋体参考血清及临床标本。结果 成功构建原核表达载体pQE32/Tp0319;高效表达和纯化出一相对分子质量约30 000的重组蛋白。用重组蛋白免疫新西兰兔,能刺激其产生高水平抗体滴度。Western印迹证明其能与梅毒患者血清发生特异性反应,阴性对照菌未见目的表达条带。间接ELISA法检测80份梅毒螺旋体参考血清（阴性、阳性各40份）,阳性和阴性结果的符合率均为100%。检测200份临床梅毒血清标本及200份正常人血清,结果与梅毒螺旋体明胶凝集试验相比,灵敏度和特异度分别为92.6%和100%,符合率为96%。结论 制备的Tp0319重组蛋白具有良好的免疫活性,为进一步研究其在梅毒血清学诊断中的应用奠定一定的基础。     

梅毒螺旋体特异性抗原Tp0453及其截短蛋白的克隆、表达及活性检测

目的:克隆和鉴定梅毒螺旋体(Tp)特异性抗原Tp0453及其截短蛋白(Tp0453-s),并用梅毒患者血清检测抗原反应性。方法:PCR扩增Tp0453和Tp0453-s基因,分别构建重组表达质粒pGEX-6P1-Tp0453和pET-28a(+)-Tp0453-s,经测序鉴定正确后转染E.coli BL21(DE3),对表达产物进行SDSPAGE电泳和Western blot鉴定。用不同分期梅毒患者血清作为一抗,Western blot检测抗原反应性。结果:经鉴定,2个原核表达质粒均构建成功,SDS-PAGE电泳和Western blot结果显示2个蛋白大小与预期一致。Western blot检测显示2个蛋白均与梅毒患者血清特异性结合,而与非梅毒患者血清无交叉反应。结论:成功克隆、表达并纯化了Tp0453和Tp0453-s蛋白,2个蛋白均有良好的抗原反应性。     

梅毒螺旋体Tp0844重组蛋白的表达、纯化及免疫反应性研究

目的 克隆、表达梅毒螺旋体重组蛋白Tp0844,纯化表达产物并进行免疫反应性分析,筛选与宿主具有高反应性的Tp主要蛋白。 方法 通过生物信息学分析,获取Tp0844基因序列,构建原核载体进行诱导表达;Ni-NTA亲合层析柱纯化重组蛋白,Western印迹法检测其重组蛋白与梅毒阴阳性血清的反应情况。结果 成功构建PET-30a（+）-Tp0844原核表达重组体,经诱导表达后发现该重组体可高表达出可溶性的重组蛋白,经亲和层析纯化后获得了相对分子质量为43 000的重组蛋白;以梅毒IgG抗体阴、阳性血清为一抗,采用Western印迹法检测发现,Tp0844重组蛋白与梅毒阳性血清能发生明显特异反应,而与健康阴性血清未出现反应条带。 结论 可溶性重组表达的Tp0844蛋白具有较好的免疫反应性,可作为梅毒发病机制研究的候选抗原。     

梅毒螺旋体TpN17抗原全长表达纯化和ELISA检测

目的在大肠埃希菌中重组表达梅毒密螺旋体TpN17抗原,用其建立梅毒诊断血清学方法。方法酶切与PCR联用,合成全长TpN17基因,亚克隆后克隆到pET-HIS质粒并转化到大肠杆菌BL21株中表达。亲和层析纯化。用纯化的rTpN17包被微孔板,ELISA方法检测临床8份梅毒阳性血清和4份梅毒阴性血清。结果获得了重组表达并纯化的TpN17,ELISA检测结果表明重组蛋白能被梅毒患者阳性血清所识别,特异性100%,灵敏度100%。结论该重组蛋白具有良好的免疫反应性,能鉴别梅毒阳性血清,有望进一步应用于梅毒感染的血清学检测。     

梅毒螺旋体 Tp0453缩短抗原和 Tp47抗原在不同期梅毒检测中的应用比较

目的：比较梅毒螺旋体 Tp0453缩短抗原（ Tp0453-s）和Tp47抗原在不同期梅毒检测中的应用。方法：表达并纯化 Tp47抗原,进行 SDS-PAGE 电泳和 western blot 鉴定。 western blot 检测比较Tp0453-s和Tp47抗原在不同期梅毒患者检测中的阳性率。结果：Tp47和Tp0453-s 2种抗原均可与一期、二期和三期梅毒患者血清发生反应,而与非梅毒病人血清无交叉反应性。 Tp0453-s和Tp47抗原与隐性梅毒患者的血清反应阳性率分别为55.6％（10／18）和94.4％（17／18）,差异具有统计学意义（礸2＝7.26,P＜0.01）。结论：Tp0453-s和Tp47两种抗原与各期梅毒患者血清反应性良好,但在隐性梅毒检测方面Tp47比Tp0453-s更具有优势。     

梅毒螺旋体Gpd重组蛋白的表达

随着基因工程技术的迅速发展和梅毒螺旋体(Tp)全基因序列的解析^[1],通过重组技术已制备多种重组Tp抗原,并被广泛应用于梅毒血清学检测的研究和试剂盒的开发^[2-5],但对于哪一种Tp蛋白抗原在临床各期梅毒的血清学诊断中具有更高的特异性和敏感性尚无一致观点。我们应用软件筛选分析,选取抗原性较强的Tp外膜蛋白GPd进行克隆表达,并以重组蛋白为包被抗原,建立间接ELISA法,评价其在梅毒血清学诊断中的应用价值。     

梅毒螺旋体体内诱生抗原Tp0462的表达鉴定及在临床血清学诊断中的应用评价

目的 筛选鉴定并评价梅毒螺旋体（Tp）体内诱生抗原Tp0462的临床血清学诊断价值。方法 提取Tp Nichols株全基因组,PCR扩增Tp0462,克隆构建重组质粒pET30a（+）?Tp0462,转化至E.coli Rosetta（DE3）菌,大量诱导表达重组蛋白Tp0462并纯化、鉴定。18只新西兰兔随机平均分为活Tp接种组、紫外线照射灭活Tp接种组和未接种对照组,接种后不同时间点抽血分离血清,用ELISA鉴定Tp0462蛋白的体内诱生性特点。ELISA法（Tp0462?ELISA）、梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA）、梅毒初筛ELISA试验及快速血浆反应素环状卡片试验（RPR）试验检测336份临床梅毒患者血清样本,初步评价该蛋白的诊断价值。结果 重组质粒Tp0462?pET30a（+）在E.coli Rosetta（DE3）中最适的表达条件为0.5 mmol/L IPTG,20 ℃,180 rpm摇床诱导培养4 h。活Tp接种组血清Tp0462特异性抗体水平从第2周起呈急剧上升趋势,至5周后趋于平稳,而灭活Tp接种组及未接种对照组血清Tp0462特异性抗体水平一直处于低水平。活Tp接种组Tp0462特异性抗体水平显著高于灭活Tp接种组及未处理组（P < 0.05）,而灭活Tp接种组与未处理组相比,差异无统计学意义（P = 0.256）。活Tp接种组、灭活Tp接种组Tp92抗体水平显著高于未处理组（P < 0.05）,而活Tp接种组与灭活Tp接种组差异无统计学意义（P = 0.127）。与TPPA相比,Tp0462?ELISA的灵敏度和特异度分别为91.7%和98.8%,符合率为95.2%,曲线下面积为0.997。Tp0462?ELISA与梅毒初筛ELISA试验的符合率为92.3%,Kappa值为0.846;与RPR试剂盒的符合率为83.9%,Kappa值为0.293。结论 Tp0462在梅毒血清学诊断中具有较高的灵敏度和特异度,可以作为潜在的梅毒诊断候选蛋白。     

梅毒螺旋体融合双价DNA疫苗的构建及其免疫活性研究

目的 构建含有梅毒螺旋体Gpd和Tp92抗原编码基因的真核表达重组体,并检测其在兔体内的免疫应答效果。方法 定向克隆构建双基因融合真核表达重组体pcDNA3.1(+)/Gpd-Tp92,用免疫组化技术检测其在HeLa细胞中的表达;同时将其与先期构建的pcDNA3.1(+)/Gpd、pcDNA3.1(+)/Tp92真核表达重组体分别免疫新西兰兔,ELISA检测免疫兔特异性抗体产生水平和脾细胞IFN-γ诱导水平,MTT法检测兔脾细胞增殖水平。结果 pcDNA3.1(+)/Gpd-Tp92在HeLa细胞中能有效表达。新西兰兔分别接种3种核酸疫苗后,均能产生特异性抗体,第3次免疫后2周抗体最高滴度均可达1:1024及以上,免疫后兔脾细胞受相应蛋白刺激有明显增殖反应,细胞培养上清中IFN-γ水平显著升高。检测指标均显著高于空质粒对照组和空白对照组(P<0.05)。3组核酸疫苗组抗体诱导水平差异无统计学意义,但Gpd-Tp92融合核酸疫苗组刺激机体引发特异性淋巴细胞增殖能力较之两单基因核酸疫苗组有明显提高。结论 梅毒螺旋体真核表达重组体pcDNA3.1(+)/Gpd-Tp92的成功构建及对新西兰兔产生强特异免疫应答的有效刺激,为梅毒DNA疫苗的研究奠定一定的实验基础。     

Kinetics of antibody response to polypeptides of pathogenic and nonpathogenic treponemes in experimental syphilis

Antigenic cross-reactivity between Treponema pallidum subspecies pallidum (TP) and nonpathogenic Treponema phagedenis biotype Reiter (TR), Treponema refringens strain Noguchi (TN), and Treponema vincentii (TV) was examined by the Western immunoblotting technique in pooled sera from five rabbits infected intratesticularly with T. pallidum. Sera were obtained before infection and on days 6, 12, 20, 30, 60, and 120 after infection. The pooled preinfection sera reacted with nine polypeptides of TV, nine of TS, and five of TR. The pooled sera did not show any clear-cut reactions with TP, but some individual rabbit sera did demonstrate visible reaction with three to five polypeptides of TP. Twelve days after infection, multiple serum antibodies reacting with polypeptides of all treponemes were detected. The number of antibodies reacting with polypeptides and the intensity of reaction increased with the duration of infection; for the nonpathogenic treponemes (TV, TS, TR) 21-26 polypeptides were identified on day 30, and by day 60 a total of 21 were detected for TP. By day 120 the reaction had become less pronounced, and fewer reactive polypeptides were seen. The extent of the cross-reactivity with the three nonpathogenic treponemes reflects the complex structure of T. pallidum, which should be viewed as a mosaic of more cross-reacting than strain- or species-specific antigens.     

人黑素浓集素受体1抗原表位肽的表达、纯化及其在白癜风患者中的检测

目的 表达及纯化人黑素浓集素受体1抗原表位肽,探讨其在白癜风患者自身抗体检测中的应用。方法 人黑素浓集素受体1抗原表位肽编码基因合成后克隆至原核表达载体pGEX-4T-2,转化大肠杆菌BL21菌株,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析和Western印迹鉴定目的蛋白表达。以提取的黑素细胞膜蛋白作为阻断抗原,进行阻断ELISA分析。以目的蛋白为抗原,检测100例进展期白癜风患者和30例正常人血清IgG抗体情况。结果 成功构建重组表达载体,重组蛋白成功表达并纯化,上样量低于0.0625 μg时纯化率达100％。目的蛋白与白癜风患者血清IgG抗体间的结合能被天然黑素细胞膜抗原抑制。100例进展期白癜风患者血清中有36例与目的蛋白结合反应呈阳性。结论 成功表达并纯化了人黑素浓集素受体1抗原表位肽,该目的蛋白能够结合白癜风患者血清中IgG抗体,可以用于抗人黑素浓集素受体1抗体的检测。     

Effect of syphilitic rabbit sera taken at different periods after infection on treponemal motility, treponemal attachment to mammalian cells in vitro, and treponemal infection in rabbits.

The time course of antibody synthesis during syphilis was studied in experimentally infected rabbits. A rapid antibody response was seen; the rabbits became positive in both the rapid plasma reagin (RPR) test and Treponema pallidum haemagglutination assay (TPHA) by nine days after infection. Treponemal immobilising antibodies were also seen as early as nine days after infection. Antibody inhibition of treponemal attachment to baby rabbit genital organ (BRGO) cells in culture occurred with immune sera taken 30 days after infection but not earlier. When T pallidum was mixed with immune syphilitic rabbit sera taken at different stages of the infection and used to infect normal rabbits the rabbits became partially resistant to T pallidum only when the treponemes were mixed with sera taken at least 30 days after syphilitic infection. This appearance correlated well with the development of antibodies which blocked attachment of T pallidum to host cells. These antibodies may be involved in the resistance to reinfection which develops in syphilis as the disease progresses.