DNA防龋疫苗经TSG途径免疫BALB/c小鼠实验研究

目的观察编码PAc结构基因A-P片段的重组质粒pCIA-P以经肌肉和颌下腺周围区域皮下注射(TSG)两种途径免疫BALB/c小鼠后的特异性免疫反应,并观察表面蛋白抗原PAc在小鼠颌下腺中的表达。方法将25只BALB/c小鼠随机分为4组,分别以重组质粒pCIA-P经肌肉、颌下腺区周围区域皮下注射两种途径免疫小鼠及pCI质粒和生理盐水肌肉免疫小鼠,ELISA法检测血清和唾液中特异性抗体水平动态变化。将pCIA-P经颌下腺区周围区域皮下注射以免疫组化技术观察表面蛋白抗原PAc。结果颌下腺区皮下注射法免疫后唾液IgA型特异性抗体和血清IgG型特异性抗体均明显升高,并持续数周。肌肉注射法后血清IgG型特异性抗体明显升高,但未有效诱导产生唾液IgA型特异性抗体。在小鼠颌下腺中检测到PAc蛋白的表达。结论重组质粒pCIA-P是一种有效的免疫原,该DNA防龋疫苗经颌下腺周围区域皮下注射免疫是可诱导长期粘膜免疫的有效途径。     

DNA防龋疫苗诱导长期免疫反应及机制初探

目的：观察编码pac结构基因A-P片段的重组质粒pCIA-P以经肌肉和颌下腺周围区域皮下注射（TSG）两种途径免疫BALB/c小鼠后的特异性免疫反应,并观察表面蛋白抗原PAc在小鼠颌下腺中的表达。方法：将20只BALB/c小鼠随机分为4组,分别以重组质粒pCIA-P经肌肉、颌下腺区周围区域皮下注射两种途径免疫小鼠及pCI质粒和生理盐水肌肉免疫小鼠,ELISA法检测血清和唾液中特异性抗体水平动态变化。将pCIA-P经颌下腺区周围区域皮下注射以免疫组化技术观察表面蛋白抗原PAc的表达。结果：颌下腺区皮下注射法免疫后唾液IgA型特异性抗体和血清IgG型特异性抗体均明显升高,并持续24周以上。肌肉注射法后血清IgG型特异性抗体明显升高,但未有效诱导产生唾液IgA型特异性抗体。在小鼠颌下腺中检测到PAc蛋白的表达。结论：DNA防龋疫苗经颌下腺周围区域皮下注射免疫是可诱导长期黏膜免疫的有效途径。     

DNA防龋疫苗经TSG途径免疫BALB／c小鼠实验研究

目的 观察编码PAc结构基因A—P片段的重组质粒pCIA—P以经肌肉和颌下腺周围区域皮下注射(TSG)两种途径免疫BALB／c小鼠后的特异性免疫反应，并观察表面蛋白抗原PAc在小鼠颌下腺中的表达。方法 将25只BALB／c小鼠随机分为4组，分别以重组质粒pCIA—P经肌肉、颌下腺区周围区域皮下注射两种途径免疫小鼠及pCI质粒和生理盐水肌肉免疫小鼠，ELISA法检测血清和唾液中特异性抗体水平动态变化。将pCIA—P经颌下腺区周围区域皮下注射以免疫组化技术观察表面蛋白抗原PAc。结果 颌下腺区皮下注射法免疫后唾液IgA型特异性抗体和血清IgG型特异性抗体均明显升高，并持续数周。肌肉注射法后血清IgG型特异性抗体明显升高，但未有效诱导产生唾液IgA型特异性抗体。在小鼠颌下腺中检测到PAc蛋白的表达。结论 重组质粒pCIA—P是一种有效的免疫原，该DNA防龋疫苗经颌下腺周围区域皮下注射免疫是可诱导长期粘膜免疫的有效途径。     

变异链球菌、表兄链球菌复合防龋DNA疫苗的研制

目的 构建包含变异链球菌和表兄链球菌两种致龋菌的主要抗原片段的复合防龋DNA疫苗,以期增强DNA防龋疫苗对表兄链球菌的抑制作用.方法 PCR获得表兄链球菌OMZ176GTF-1的CAT区,克隆至靶向防龋DNA疫苗pGJA-P/VAX中,构建编码变异链球菌PAc、GLU基因序列和表兄链球菌CAT基因序列的复合防龋DNA疫苗pGJGAC/VAX,转染CHO细胞系检测其表达.重组质粒及对照质粒分别经股四头肌注射和鼻腔滴注免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测血清和唾液中的特异性抗PAc,抗GLU和抗CAT抗体水平.重组质粒及对照质粒经鼻腔滴注免疫分别定植了变异链球菌和表兄链球菌的Wistar大鼠,龋齿记分评价防龋疫苗的龋齿保护效能.结果重组质粒pGJGAC/VAX构建成功.免疫小鼠后实验组小鼠血清和唾液抗PAc、抗GLU和抗CAT抗体水平均显著高于空载体对照组(P<0.01).血清特异性抗CAT抗体水平最高值在肌肉免疫组第8周和黏膜免疫组第10周时出现,分别为62.13μg/ml和11.43 μg/ml;唾液特异性抗CAT抗体水平最高值在肌肉免疫组第8周和黏膜免疫组第10周时出现,分别为0.67%和0.80%.大鼠龋齿保护实验结果显示在变异链球菌和表兄链球菌定菌鼠中实验组釉质龋(E),牙本质浅龋(Ds)和牙本质中龋(Dm)均显著低于pVAX1免疫组(P<0.05),实验组Ds和Dm均低于pGJA-P/VAX免疫组,但两组间E差异没有统计学意义(P>0.05).结论 复合防龋DNA疫苗构建成功,可在真核细胞中正确表达,动物实验证实能有效地诱导黏膜和系统体液免疫反应,并增强了DNA防龋疫苗对表兄链球菌的抑制作用.     

靶向融合防龋DNA疫苗经肌肉免疫动物的实验研究

目的　观察靶向融合防龋DNA疫苗pGJA P在大鼠肌肉组织中的原位表达。检测靶向融合防龋DNA疫苗pGJA P经股四头肌注射途径免疫大鼠后体内抗体水平和防龋效果 ,并与融合防龋DNA疫苗pGLUA P进行比较。在小鼠体内长期观察抗体动态变化。方法　质粒pGJA P经股四头肌注射途径免疫大鼠 ,免疫组织化学方法检测重组蛋白的原位表达。质粒pGJA P和pGLUA P经股四头肌注射途径免疫定菌鼠 ,ELISA法检测血清IgG和唾液IgA抗体水平 ,Keyes记分法评估定菌鼠磨牙患龋情况。质粒pGJA P和pGLUA P经股四头肌注射途径免疫BALB/c小鼠 ,ELISA法检测血清IgG和唾液IgA动态变化。结果　大鼠股四头肌组织检测到表达的重组蛋白。大鼠pGJA P免疫组血清抗PAcIgG水平 (1∶2 0 0 0 0 0 )和抗GTFIgG水平 (1∶5 80 0 0 )均显著高于pGLUA P免疫组 (1∶2 30 0 0和 1∶110 0 0 )(均P <0 0 1)。大鼠pGJA P免疫组唾液抗PAcIgA水平 (1∶8)和抗GTFIgA水平 (1∶6 )均显著高于pGLUA P免疫组 (1∶2和 1∶2 ) (均P <0 0 1)。pGLUA P免疫组未能引起有效的唾液IgA反应。pGJA P免疫组龋齿记分显著低于pGLUA P免疫组和空白组 (P <0 0 1)。小鼠pGJA P免疫组有效血清IgG、唾液IgA和pGLUA P免疫组有效血清IgG均持续至本实验结束 ,pGJA P免疫组血清IgG和唾液Ig     

SARS病毒N蛋白真核表达质粒构建及诱导的体液免疫

目的构建SARS病毒核衣壳蛋白（N）的真核表达质粒，并研究其在小鼠体内诱导的体液免疫应答。方法采用PCR方法体外扩增SARS病毒N蛋白基因片段，定向克隆入真核表达栽体pVAC，构建pVAC-N重组质粒；大量制备该重组质粒，经基因枪腹部皮内注射免疫BALB／c小鼠三次，间接ELISA法测定免疫鼠IgG抗体效价。结果成功构建了重组表达质粒pVAC-N，免疫小鼠后可诱导产生出特异性的IgG抗体。结论构建的真核表达质粒pVAC-N能诱导小鼠产生特异性抗体，为SARS疫苗的进一步研究打下基础。     

变形链球菌亚单位疫苗SBR制备及经颌下腺免疫小鼠的抗体应答

目的:探讨变形链球菌(S.mutans)唾液结合区段(SBR)作为亚单位防龋疫苗的免疫原性,并评价经涎腺接种诱导有效免疫应答的可行性。方法:构建含S.mutansSBR基因的重组原核表达质粒pTriEx-4-SBR,用该质粒转化大肠杆菌E.coliJM109DE3,培养转化后的E.coli并诱导其表达SBR蛋白;以SBR蛋白作为亚单位防龋疫苗经颌下腺免疫BALBC小鼠,ELISA检测特异性抗体指标。结果:纯化得到的SBR蛋白与预期相符;ELISA结果表明,SBR蛋白经颌下腺免疫小鼠能够诱导血清抗SBR特异IgG(P<0.01)、唾液抗SBR特异IgGP<0.01、唾液抗SBR特异IgAP<0.01显著应答。结论:本实验所表达及纯化的SBR蛋白经涎腺接种途径可诱导明显的免疫应答。     

Cpn0585蛋白的免疫活性及血清学诊断初步评价

目的克隆肺炎嗜衣原体包涵体膜蛋白Cpn0585基因,初步探讨其在血清学诊断中的应用价值。方法构建pGEX-6p-2／Cpn0585重组质粒,诱导表达并纯化重组蛋白,免疫BALB／c小鼠,间接酶联免疫附试验（ELISA）检测小鼠血清抗体滴度,以重组蛋白作为ELBA包被抗原检测血清中CpnIgG抗体和检测36份Cpn-／Ct＋IsG阳性参考血清。结果高效表达和纯化出一相对分子质量约为95kDa的重组蛋白,蛋白质印迹法证明其能与人抗CpnIgG抗体发生反应;在被免疫的BALB／c小鼠体内,特异性IgG抗体的滴度为1：12800;检测104例临床血清标本中的IgG抗体,与以色列SavyonDiagnostics公司SeroCPTMIgGELISA诊断试剂盒的检测结果进行比较,符合率为98．3％。结论表达的Cpn0585重组蛋白具有良好的免疫活性,在Cpn的血清学诊断中具有较高的应用价值。     

肺炎链球菌CbpA基因疫苗的构建及免疫学特性

目的：构建含有肺炎链球菌（SPN）毒力因子CbpA抗原编码基因的重组质粒pcDNA3.1/CbpA,测定其诱导特异性免疫应答的能力并评价其保护效果.方法：PCR扩增SPN CbpA编码基因,将该编码基因克隆到pcDNA3.1（＋）真核表达载体中,构建pcDNA3.1/CbpA重组质粒,经测序鉴定后转染COS-7细胞,WesternBlot鉴定目的蛋白的表达,重组质粒免疫BALB/c小鼠,TIGR4型SPN攻击后,监测其生存时间.结果：CbpA能在COS-7细胞中表达;pcDNA3.1/CbpA重组质粒主动免疫BALB/C小鼠后,体内产生特异性IgG抗体,并诱导小鼠对SPN感染产生有效的保护.结论：成功构建了重组真核表达质粒pcDNA3.1/CbpA,可为SPN基因疫苗的研制提供依据.     

重组Calpain蛋白诱导抗体产生及检测日本血吸虫感染的研究

目的 研究在大肠杆菌中表达的日本血吸虫Calpain蛋白的免疫原性及其在日本血吸虫病诊断上的应用。方 法用重组Calpain蛋白免疫BALB／c小鼠，ELISA法测定特异性IgG抗体的动态变化及其IgG亚型(IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3)产生特征；同时用重组Calpain蛋白作为诊断抗原，粪检血吸虫病阳性患者血清作为一抗，肝吸虫阳性患者血清作为考核交叉反应血清。结果 重组Calpain抗原免疫小鼠后，产生了一个极高的抗Calpain特异性抗体，免疫4周IgG类抗体达到高峰，与对照组鼠相比较免疫鼠血清中IgG1，IgG2a，IgG2b特异性抗体也显著上升；Calpain重组抗原血清检测日本血吸虫和粪检的符合率为100％，粪检阳性EPG低的个体抗Calpain抗体滴度高，EPG高的患者抗Calpain抗体滴度反而低，与肝吸虫的交叉反应率为37％。结论 日本血吸虫Calpain是一个具有免疫原性的蛋白，能够激发宿主产生高水平的免疫球蛋白，能够敏感地测定日本血吸虫的感染，提示Calpain可以发展成为日本血吸虫病的诊断抗原和日本血吸虫疫苗候选分子。     

弓形虫P30-P22复合DNA疫苗免疫小鼠诱导的体液免疫应答

目的通过肌内注射弓形虫DNA疫苗PCDNA3．1-P30-P22直接免疫小鼠，观察其诱导的体液免疫应答及保护性作用。方法大量制备重组真核表达质粒PCDNA3．1-P30-P22，肌内注射免疫小鼠，ELISA法测定其抗体滴度的变化，用弓形虫作致死性攻击感染。结果实验组抗体水平明显高于对照组，二者存在显著性差异(P＜0．05)；攻击感染后实验组小鼠存活时间明显延长(P＜0．05)。结论重组真核表达质粒PCDNA3．1-P30-P22肌注BALB/C系小鼠可诱导一定的体液免疫应答，对攻击感染具有一定的保护性。     

结核分支杆菌MPT64 DNA疫苗的纯化及免疫效果

目的：研究结核分支杆菌MPT64 DNA疫苗经肌肉注射免疫小鼠的效果。方法：通过Qiagen质粒纯化试剂盒纯化质粒DNA;将25只BALB/c小鼠随机分为四组,生理盐水组、载体质粒组和重组质粒组于第0周、第3周、第6周经肌肉注射免疫小鼠各1次,卡介苗组只在0周时皮内注射卡介苗1次;通过ELISA方法检测小鼠血清中抗MPT64抗体。结果：纯化后的JW4303和JW4303-MPT64质粒DNA经电泳证实无RNA污染,OD260/OD280大于1.8,每2000ml培养菌可获得2mg左右的质粒DNA。以三个对照组15只小鼠的血清抗MPT64抗体OD值经x^- 2s为正常界限值,免疫4周时重组质粒组10只小鼠中有4只血清中抗MPT64抗体阳性;免疫7周时有5只小鼠抗体阳性,抗体水平较前略微增高。结论：结核分支杆菌MPT64 DNA疫苗经肌肉注射免疫小鼠只能诱导部分小鼠产生特异的体液免疫应答,免疫效果存在明显的个体差异。     

白细胞介素-12和白细胞介素-18质粒对HBcAgDNA疫苗诱导小鼠(H-2d)体液免疫应答的影响

目的：观察编码白细胞介素（IL）－12和IL－18的真核表达载体[pcDNA3.1/IL-12(以下简称IL－12质粒）和pcDNA3.1/IL-18(以下简称IL－18质粒）]对HBcAg DNA疫苗（pJW4303/HBc)诱导BalB/c(H-2^d)小鼠免疫应答的影响。方法：肌肉注射接种IL－12质粒、IL－18质粒和HBcAg DNA疫苗，ELISA法检测小鼠血清抗HBc IgG亚类（IgGl,IgG2a)水平。结果：免疫6周后，联合注射IL－12、IL－18和IL－12＋IL－18组小鼠血清的抗HBc终点滴度均明显高于单纯注射HBcAg DNA疫苗组小鼠（P＜0．05），抗HBc IgG亚类以IgG2a占优。结论：IL－12、IL－18以及IL－12＋IL－18联合HBcAg DNA疫苗注射能够提高小鼠血清中抗HBc水平。     

轮状病毒DNA疫苗经不同途径接种诱导体内免疫应答研究

目的:通过研究不同途径接种轮状病毒DNA疫苗所诱导的体内免疫应答,寻找其适合的免疫途径.方法:轮状病毒基因疫苗pcDNA1/VP7经肌肉注射及鼻粘膜两种途径免疫BALB/c小鼠,利用ELISA方法对其诱导产生的体液免疫应答进行测定.结果:经肌肉注射及鼻粘膜两种途径接种轮状病毒DNA疫苗后,均在BALB/c小鼠体内诱导产生了病毒特异性IgG增高(P＜0.05),而病毒特异性IgA与对照组相比无显著性差异.结论:肌肉注射及鼻粘膜两种途径均能作为轮状病毒DNA疫苗的候选接种途径.     

沙眼衣原体主要外膜蛋白多表位重组DNA诱导小鼠体液免疫有效剂量的探讨

目的:探讨沙眼衣原体主要外膜蛋白多表位(Ct MOMP168)重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)/Ct MOMP168免疫小鼠的有效免疫剂量,为体内免疫学效应的研究提供实验依据.方法:在重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)/Ct MOMP168构建成功的基础上,抽提纯化质粒,分3个免疫剂量组,即50、100和150μg剂量组,同时设PBS对照组.肌肉注射免疫BALB/c小鼠3次,间隔2周,于免疫的0、2、4、6、8周分别尾静脉取血,分离血清,间接ELISA法检测小鼠血清中Ct MOMP多表位特异性抗体IgG的生成量,并于0、1、3、5、7周取小鼠阴道冲洗物,检测Ct MOMP多表位特异性SIgA的生成量,分别进行统计学分析.结果:3个不同免疫剂量组,血清特异性抗体IgG生成量于免疫第4周后均开始随免疫时间延长而逐步增加,150μg剂量组抗体IgG的生成水平高于其他剂量组(P＜0.05).免疫小鼠阴道分泌物中特异性抗体SIgA生成较快,免疫开始后1周,150 μg剂量组SIgA的产生水平高于其他组,7周后SIgA开始下降,但150 μg剂量组抗体水平仍高于其他剂量组(P＜0.05).结论:重组质粒DNA免疫小鼠的特异性抗体生成显示了剂量依赖关系,高剂量(150μg)免疫组小鼠血清特异性抗体IgG和阴道分泌性特异性抗体SIgA生成水平优势显著.     

Construction of a recombinant plasmid harbouring the rhoptry protein 1 gene of Toxoplasma gondii and preliminary observations on DNA immunity

Objective To observe the immune responses elicited in BALB/c mice by a DNA vaccine. A ge ne encoding rhoptry protein 1 (ROP1) from Toxoplasma gondii (T. gondii) was cloned into vector pcDNA3.Methods Amplifyied gene fragments coding for ROP1 from the genomic DNA of T.gondii ZS2 were inserted into cloning vector, pUC18, and sub-cloned into pcDNA3. Mice wer e injected at a dosage of 100 μg recombinant plasmid DNA by intramuscular inje ction and boosted after 2 weeks. pcDNA3 and normal saline were used as control . 30, 50 and 70 days after the second immunization, NK cell activity, T lympho cyte proliferation and sub-clusters and serum IgG antibody were assayed.Results The specific gene fragment coding for ROP1 was amplified and a pcROP1 recombinan t was constructed. At 30 days after immunization, the spleens of the mice were obviously enlarged evidently. NKC activity and the proliferation of spleen T ly mphocytes seen on MTT assay were higher in pcROP1 group than in the controls. T he number of CD4(+) T cells exhibited no obvious increase compared with that of the control, but CD8(+) T cells were obviously increased (P&lt;0.05). At 90 d ays after vaccination, the titer of IgG antibody in the serum of vaccinated mice was positive (1∶100).Conclusion pcROP1 was constructed and it could elicit both cellular and humoral immune r esponses in immunized mice.