转染反义VEGF121 cDNA恢复K562细胞β1整合素的活化功能

为了探索血管内皮细胞生长因子(VEGF)在K562细胞β1整合素活化功能中的作用,利用转染正义(S)、反义(As)VEGF121 cDNA及空载体(V,pcDNa3)的不同K562细胞株,通过流式细胞术检测其粘附分子VLA-4(CD49d/CD29)和VLA-5(CD49e/CD29)表达及β1整合素的可活化性.结果显示:K562/V,K562/S和K562/As细胞β1整合素VLA-4(CD49d/CD29)与VLA-5(CD49e/CD29)的表达率均在92%以上,但经β1整合素活化剂8A2抗体激活后,K562/As细胞可活化表9E9EG7表达率较K562/V细胞明显提高(75.6±10.5vs41.2±2.1%,P＜0.01).结论:转染反义VEGF121cDNA能增加K562细胞β1整合素的可活化性.     

VEGF反义RNA促骨髓瘤细胞凋亡及抑制内皮细胞形成血管作用的体外研究

本研究探讨血管内皮细胞生长因子（VEGF）反义RNA对人多发性骨髓瘤细胞系U266增殖、凋亡及内皮细胞ECV304体外血管形成的影响和以VEGF反义RNA进行多发性骨髓瘤（MM）基因治疗的可行性。将VEGF121反向克隆入真核表达质粒pIRES2-EGFP构建重组质粒AS-VEGF，酶切、测序鉴定。用此真核表达重组质粒转染人骨髓瘤细胞系U266，G418筛选获得阳性克隆。RT-PCR、Westernblot法分别检测阳性克隆中VEGFmRNA和蛋白的表达；利用MTT法、流式细胞术检测转染细胞增殖、凋亡的变化；利用基质胶中内皮细胞ECV304的网络形成检测血管形成。结果表明：获得了携带反义VEGF基因的真核表达重组质粒AS-VEGF；VEGF121反义RNA部分阻断了U266细胞中VEGF的表达，转染重组质粒的U266细胞VEGFmRNA和蛋白表达都较对照组细胞有明显减少，细胞的增殖受到抑制，凋亡增加。转染重组质粒的细胞培养上清在基质胶中作用ECV304细胞后的血管形成较对照组亦有明显减少。结论：VEGF反义RNA可以下调VEGF表达，从而抑制骨髓瘤细胞系U266增殖，增加其凋亡并抑制血管形成。     

K562细胞血管内皮生长因子自分泌链作用的实验研究

目的探讨抗VEGF抗体及抗VEGF发夹状核酶基因对K562细胞增殖、凋亡及相关基因表达的影响及其分子机制。方法将不同浓度的VEGF抗体作用于K562细胞，应用脂质体介导的方法将抗VEGF发夹状核酶基因真核表达载体pcDNA-RZ转染K562细胞，采用MTT法、甲基纤维素半固体培养法和细胞周期测定分析抗VEGF抗体及发夹状核酶基因对白血病细胞增殖的影响；DNA凝胶电泳和AnnexinⅤ标记法检测白血病细胞的凋亡程度；RT-PCR法测定K562细胞中相关基因表达的变化。结果抗VEGF抗体能抑制K562细胞生长，促进其凋亡，这一作用呈剂量依赖关系。0．165μg／ml VEGF抗体作用于K562细胞72h，DNA凝胶电泳出现梯状条带，当抗体浓度增加到0．825μg／ml时，梯状条带更为清晰；RT-PCR显示，VEGF抗体作用后，K562细胞MRP、TOPOⅡ基因的表达较对照组下调，而GST基因表达无明显改变。与K562及K562／PC细胞（转染空质粒的K562细胞）相比，转染抗VEGF核酶基因的K562／RZ细胞VEGF mRNA和蛋白的表达量明显降低；生长曲线提示K562／RZ细胞生长缓慢，甲基纤维素集落形成率较对照组明显下降，对照组集落形成率为（30．5±3．3）％，而K562／RZ组为（16．3±2．8）％，细胞周期动力学分析结果显示K562／RZ细胞G1期细胞增多，S期细胞显著减少；在小剂量As2O3作用下，K562／RZ细胞凋亡数量较对照明显增高（凋亡率对照组为13．4％，K562／RZ组为31．5％）。结论抗VEGF抗体阻断K562细胞VEGF自分泌环路或者抗VEGF发夹状核酶减少K562细胞中VEGF的合成，能抑制K562细胞的增殖，促进K562细胞的凋亡，引起部分与细胞凋亡和多药耐药相关的基因表达改变。     

新型人转录因子hBKLF对K562细胞增殖、分化及血红蛋白合成作用的研究

孕22周的胎肝是胎儿的主要造血器官,其中含有大量与造血相关的调控因子。人碱性Krüppel样因子(humanbasicKrüppel-likefactor,hBKLF)是本研究室从这一时期胎肝cDNA文库中新克隆的转录因子。对其C端的结构分析发现,它含有3个特征性C2H2锌指结构,因此属于KLF转录因子家族。前期的表达谱研究工作显示,hBKLF在成人外周血白细胞、骨髓和胎肝中表达量高,在红系中有表达,这提示它可能与造血相关。本研究以K562细胞为模型,研究hBKLF与造血细胞增殖、分化及血红蛋白合成的关系。构建hBKLF正义及反义真核表达载体,转染K562细胞,经G418筛选4周,得到稳定细胞株;用RT-PCR、Westernblot方法测定转染后K562细胞hBKLF表达水平的变化;以转染空质粒的K562细胞为对照组,在显微镜下直接观察转染正义质粒和反义质粒的两组细胞形态的改变;用MTT法比较增殖速率的变化;用甲基纤维素半固体培养法比较集落形成率的差别;用苯息丁法观察氯高铁血红素(hemin)诱导K562细胞分化后血红蛋白合成水平的差异。结果表明正义质粒和反义质粒经NcoI酶切鉴定构建正确。转染正义质粒的K562细胞(正义组)中hBKLF的mRNA及蛋白质表达水平增加,转染反义质粒的K562细胞(反义组)中hBKLF的mRNA水平降低。增殖活性在反义组、正义组、对照组分别为1.335±0.022、1.067±0.010、1.118±0.014,反义组K562细胞的增殖速率加快,正义组细胞增殖速率减慢(P<0.001)。细胞形态在各组间无明显区别。集落形成率在反义组、正义组、对照组分别为148±13、136±10、141±10,各组间无显著差异(P>0.05)。3组细胞血红蛋白合成水平在hemin诱导后均升高,诱导后血红蛋白升高倍数在对照组、反义组、正义组分别为9.064±1.637、14.360±2.185、4.820±0.404,反义组K562细胞合成血红蛋白能力增加,正义组合成血红蛋白能力下降(P<0.05)。结论hBKLF可以抑制K562细胞的增殖,对血红蛋白合成有负调控作用,但未观察到hBKLF对细胞形态及克隆形成率的影响     

核糖体蛋白L6对K562/A02细胞耐药性及凋亡的影响

本研究观察核糖体蛋白L6（RPL6）基因表达的改变对白血病细胞耐药性的作用及其可能的机制。通过RT-PCR方法获得RPL6 cDNA序列,用真核表达载体pcDNA3.1（＋）分别构建正向插入和反向插入的RPL6 cDNA重组质粒。以脂质体将正义RPL6 cDNA真核表达质粒转染K562细胞,将反义RPL6 cDNA真核表达质粒转染K562/AO2细胞。以MTT、流式细胞术和荧光分光光度计观察RPL6对化疗药物耐药性、凋亡和caspase-3的作用。结果表明：转染正义RPL6 cDNA真核表达质粒后,K562细胞对阿霉素的耐药性增强到原来的325%,凋亡和caspase-3活性明显降低（P〈0.005）;转染反义RPL6 cDNA真核表达质粒后,K562/A02细胞对阿霉素的耐药性降低原来的38%;凋亡和caspase-3活性明显增加（P〈0.005）。结论：RPL6基因过表达通过改变药物诱导的凋亡在K562/A02细胞耐药性的形成中起重要作用。     

CIAPIN1基因对K562细胞增殖能力的影响

本研究旨在探讨CIAPIN1基因对慢性髓系白血病（CML）细胞系I（562细胞增殖能力的影响。针对C1APIN1基因构建shRNA真核表达载体并稳定转染K562细胞,用real—timePCR和Westernblot技术验证干扰效率,采用MTT法检测K562细胞的增殖活性的改变,利用甲基纤维素集落形成实验观察K562细胞集落形成大小和数量的变化,通过体内实验观察K562细胞在小鼠体内的成瘤能力。结果表明,与对照组相比,K562细胞的CIAPIN1基因表达被有效抑制;干扰CIAPIN1基因后K562细胞的增殖活性明显下降,集落形成数量减少和集落大小显著减小,小鼠体内成瘤能力明显降低。结论：干扰CIAP删基因表达能抑制K562细胞在体内及体外的增殖能力。     

核糖体蛋白L6对K562/AO2细胞耐药性及凋亡的影响

本研究观察核糖体蛋白L6(RPL6)基因表达的改变对白血病细胞耐药性的作用及其可能的机制.通过RT-PCR方法获得RPL6cDNA序列,用真核表达载体pcDNA3.1(+)分别构建正向插入和反向插入的RPL6 cDNA重组质粒.以脂质体将正义RPL6 cDNA真核表达质粒转染K562细胞,将反义RPL6 cDNA真核表达质粒转染K562/AO2细胞.以MTT、流式细胞术和荧光分光光度计观察RPL6对化疗药物耐药性、凋亡和caspase-3的作用.结果表明转染正义RPL6cDNA真核表达质粒后,K562细胞对阿霉素的耐药性增强到原来的325%,凋亡和caspase-3活性明显降低(P＜0.005);转染反义RPL6 cDNA真核表达质粒后,K562/AO2细胞对阿霉素的耐药性降低原来的38%;凋亡和caspase-3活性明显增加(P＜0.005).结论RPL6基因过表达通过改变药物诱导的凋亡在K562/A02细胞耐药性的形成中起重要作用.     

干扰素-α2b对慢性髓系白血病抗血管生成作用的体外研究

本研究旨在应用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)及K562细胞探讨干扰素-α2b在慢性髓系白血病(CML)中抗血管生成作用。用ELISA法检测K562细胞系培养上清液中VEGF和bFGF水平;应用real-time RT-PCR法检测103、102、10U/ml IFN-α2b作用K562细胞24、36、48小时VEGF、bFGF mRNA的表达;通过MTT法、Transwell室及体外微管形成实验研究K562细胞培养上清液及IFN-α2b对HUVEC增殖、迁移及体外分化的影响。结果表明:K562细胞系表达和分泌VEGF和bFGF,细胞培养上清液能明显促进HUVEC的增殖、迁移、体外微管形成,其作用随着细胞培养上清液浓度的增加而增强;IFN-α10U/ml作用K562细胞24、36、48小时,VEGF相对表达量为1.64±0.18、1.49±0.14、1.31±0.05,bFGF相对表达量分别为1.53±0.10、1.29±0.15、0.79±0.13(p=0.002),随着药物浓度增高,细胞VEGF、bFGF相对表达量无明显差异。结论:CML存在血管新生,K562细胞分泌和表达促血管新生因子VEGF和bFGF,促进HUVEC的增殖、迁移、体外微管形成,干扰素通过抑制HUVEC的增殖、迁移、微管形成,下调K562细胞VEGF和bFGF mRNA表达,具有一定程度的抗血管新生作用。     

绿茶的主要成分表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)抗血液肿瘤血管新生机制的研究

目的 对绿茶的丰要成分表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对血液肿瘤血管新牛抑制作用进行研究,为EGCG用于白血病治疗提供依据.方法 采用MTT法,测定不同浓度的EGCG对白血病细胞株K562细胞增殖的抑制作用,并采用RT-PCR方法检测EGCG处理前后K562细胞血管内皮牛长因子(VEGF)mRNA的表达情况.结果 EGCG可明显抑制K562增殖,IC50值为118.34μM,并可以下调K562细胞VEGF mRNA的表达.结论 EGCG可下调VEGF mRNA的表达,从而减少VEGF的分泌.既可以减少VEGF的旁分泌,减弱其促进内皮细胞增生的作用;又可以减少VEGF的自分泌,削弱其通过白血病细胞细胞表而VEGF受体促进肿瘤细胞的分裂增殖、抑制肿瘤细胞的凋亡的作用.从不同途径发挥其抗血液肿瘤血管新生的作用.     

血管内皮生长因子121反义核酸抑制人胰腺癌细胞体外促血管生成能力

目的:探讨VEGF121反义核酸对体外培养胰腺癌细胞促血管生成能力的影响,以期通过抑制VEGF引起的肿瘤血管生成来达到抑制肿瘤生长的目的。方法:将稳定转染有VEGF反义核酸pcDNA3-ASVEGF121的胰腺癌细胞系BxPC-3在体外条件下培养,采用免疫组化检测肿瘤细胞表面VEGF及Flk-1表达水平。通过测定ECV-304生长曲线检测培养液上清对血管内皮细胞生长的影响。通过培养液上清体外血管生成试验检测肿瘤细胞体外促血管生成能力。结果:VEGF反义核酸转染BxPC-3细胞后,肿瘤细胞表面VEGF蛋白水平受到明显抑制,VEGF受体Flk-1表达水平上调。对血管内皮细胞ECV-304的促生长作用减弱。体外血管生成试验显示VEGF反义核酸能抑制肿瘤细胞体外促血管生成能力。结论:人反义VEGF121能显著抑制胰腺癌细胞表面的VEGF表达,抑制肿瘤细胞体外促血管生成能力。     

转染反义VEGF cDNA抑制K562细胞裸鼠体内生长和肿瘤内血管生成

目的　探讨转染反义血管内皮细胞生长因子 (VEGF)cDNA对慢性髓系白血病 (CML)急变细胞株K5 6 2裸鼠体内生长的影响。方法　利用转染反义 (AS)、正义 (S)VEGF1 2 1 cDNA及空载体 (V ,pcDNA3质粒 )的K5 6 2细胞株 ,观察转染细胞在裸鼠体内成瘤及生长情况 ;免疫组化法比较其裸鼠移植瘤微血管密度 (MVD) ;MTT法观察其对骨髓内皮细胞体外增殖的影响。结果　转染反义VEGF1 2 1 cDNA的K5 6 2 AS细胞组的瘤块体积小、生长慢于K5 6 2 V组 [(2 0 7.5± 192 .9)mm3 vs (4 45 .0± 15 0 .9)mm3 ,P <0 0 5 ],而K5 6 2 S组瘤块体积大于K5 6 2 V组 [(1174.6± 5 0 8.7)mm3 vs (4 45 .0± 15 0 .9)mm3 ,P <0 .0 1]。K5 6 2 AS组裸鼠体内肿瘤MVD低于K5 6 2 V组 [(11.0± 7.6 ) 0 .72mm2 vs (18.9± 7.0 ) 0 .72mm2 ,P <0 0 5 ],而K5 6 2 S组则高于K5 6 2 V组 [(5 0 .8± 11.7) 0 .72mm2 vs (18.9± 7.0 ) 0 .72mm2 ,P <0 .0 1]。K5 6 2 AS细胞的培养上清刺激骨髓内皮细胞增殖能力弱于K5 6 2 V ,而K5 6 2 S细胞的结果相反。结论　转染反义VEGF1 2 1 cDNA抑制K5 6 2细胞裸鼠体内肿瘤生长 ,降低裸鼠瘤块内MVD ,对骨髓内皮细胞的刺激增殖作用减弱     

转染反义VEGFl21 cDNA恢复K562细胞β1整合素的活化功能

为了探索血管内皮细胞生长因子 (VEGF)在K5 6 2细胞 β1整合素活化功能中的作用 ,利用转染正义 (S)、反义 (As)VEGF12 1cDNA及空载体 (V ,pcDNA3 )的不同K5 6 2细胞株 ,通过流式细胞术检测其粘附分子VLA 4(CD4 9d/CD2 9)和VLA 5 (CD4 9e/CD2 9)表达及 β1整合素的可活化性。结果显示 :K5 6 2 /V ,K5 6 2 /S和K5 6 2 /As细胞 β1整合素VLA 4 (CD4 9d/CD2 9)与VLA 5 (CD4 9e/CD2 9)的表达率均在 92 %以上 ,但经 β1整合素活化剂 8A2抗体激活后 ,K5 6 2 /As细胞可活化表位 9EG7表达率较K5 6 2 /V细胞明显提高 (75 .6± 10 .5vs 4 1.2± 2 .1% ,P <0 .0 1)。结论 :转染反义VEGF12 1cDNA能增加K5 6 2细胞 β1整合素的可活化性     

切割bcr/abl核酶的逆转录病毒载体构建及其对K562细胞的影响

目的：研究ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因在慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）中的作用以及探索ＣＭＬ基因治疗的可能性。方法：合成针对ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因转录本ｂ３ａ２断裂点“锤头状”核酶的ｃＤＮＡ序列，定向克隆于逆转录病毒载体内，通过脂质体介导的ＤＮＡ转染法，将核酶基因导入Ｋ５６２细胞，并通过克隆分析法、流式细胞术（ＦＣＭ）、逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）、ＤＮＡ电泳及电镜观察等方法检测核酶对Ｋ５６２细胞的影响。结果：①核酶转染Ｋ５６２细胞后４８小时克隆形成抑制率达８５％；②细胞内Ｐ２１０蛋白合成受到明显抑制；③ＲＴＰＣＲ半定量检测ｂｃｒ／ａｂｌｍＲＮＡ表达水平明显下降；④核酶处理组Ｋ５６２细胞发生凋亡，表现为：在ＦＣＭ图谱上可见明显的凋亡峰；ＤＮＡ电泳分析出现典型的梯状ＤＮＡ带；电镜观察呈现凋亡早期形态学改变。结论：核酶基因通过逆转录病毒载体导入Ｋ５６２细胞后可成功表达，使Ｋ５６２细胞ｂｃｒ／ａｂｌｍＲＮＡ及Ｐ２１０蛋白表达水平下降，抑制Ｋ５６２细胞增殖，同时诱导Ｋ５６２细胞发生凋亡。     

Aurora激酶抑制剂VX-680对慢性髓系白血病细胞增殖及凋亡的影响

本研究探讨Aurora激酶抑制剂VX-680在体外对白血病细胞系K562、KCL22和慢性髓系白血病（CML）患者骨髓CD34^＋细胞的增殖和凋亡的影响。利用CCK-8法观察VX-680对K562和KCL22细胞的增殖作用,细胞计数方法测定VX-680对CML的CD34^＋细胞增殖影响,Annexin V-PI凋亡检测试剂盒、流式细胞术分析VX-680对K562、KCL22细胞凋亡效应,集落形成试验检测VX-680对CML及正常供者（donor）的骨髓CD34^＋细胞集落形成能力影响。结果表明,Aurora激酶抑制剂VX-680（20-100 nmol/L）在处理细胞第3天时能明显抑制K562和KCL22细胞增殖（P〈0.01）,并能抑制CML患者骨髓CD34^＋细胞增殖,而且随着剂量增加,抑制作用增强;VX-680（20nmol/L）作用K562和KCL22细胞3天时可诱导细胞凋亡（P〈0.01）;集落形成试验表明,CML患者骨髓CD34^＋细胞在VX-680的体外处理下集落形成能力较正常骨髓CD34^＋细胞明显下降（P〈0.01）。结论：Aurora激酶抑制剂VX-680在体外对慢性髓系白血病细胞有抑制增殖和促进凋亡的作用。     

c-cbl反义RNA抑制K562细胞的增殖

为探讨原癌基因c-cbl对CML细胞增殖的影响,我们用RT-PCR克隆了包括5′端非编码区的人类c-cbl基因部分序列,将之反向插入pcDNA3载体,并转染K562及NB4细胞。经MTT实验、半固体集落培养和流式细胞术观察细胞增殖能力的改变。结果表明,限制性酶切分析及序列测定证明所克隆的基因核苷酸序列正确,MTT实验显示反义载体转染K562细胞生长明显受抑,24、48及72小时增殖抑制率分别为30.07％,42.53％和55.75％(P值均<0.001),FCM-BrdU法测定的细胞倍增时间之比为1∶1.87(P<0.02),细胞集落形成抑制率为33.01％,反义转染基因NB4细胞增殖率无改变。上述结果直接地证明了c-cbl在CML细胞生长中的重要性。     

转染p16与dll4阻滞白血病细胞株K562细胞周期

本研究探讨p16,dll4基因真核表达载体在白血病细胞中的表达和作用,设计并构建包含野生型p16cDNA,dll4cDNA的真核双表达载体pBudCE4.1-16-dll4,用脂质体法转染白血病细胞,用Western blot方法检测外源性p16及dll4的表达情况;通过CCK-8和流式细胞仪检测细胞的生长曲线和周期。结果表明:成功构建p16、dll4基因双表达真核载体,体外成功转染入白血病细胞。在白血病细胞检测到外源性P16、Dll4蛋白的表达。转染48小时后,试验组与对照组比较,细胞周期被阻滞(p0.001),细胞增殖下降(p0.001)。结论:重组质粒pBudCE4.1-16-dll4体外转染白血病细胞后,两个目的基因能够在细胞中同时表达,并诱发细胞周期阻滞于G0/G1期。     

S3核糖体蛋白基因的过表达与K562/DOX细胞耐药性的关系

目的 观察S3核糖体蛋白（S3rp)基因表达的改变对白血病耐药性的影响。通过RT－PCR方法获得含S3rp基因完整开放阅读框架（ORF）的cRNA，并将其克隆到pGEM-T Easy载体里，然后通过亚克隆方法将pGEM-T Easy重组质粒里的S3rp cDNA片段克隆到真核表达载体pcDNA3.1( )中，分别构建正向插入和反向插入的S3rp cDNA重组质粒，进行基因转染。将正义S3rp cDNA真核表达质粒转染K562细胞，使其S3rp基因表达增加，观察其对化疗药物敏感性的改变；将反义S3rp cDNA真核表达质粒转染具有多药耐药（MDR）表型的K562／DOX细胞，阻碍其S3rp基因的表达，观察其对化疗药物耐药性的改变。结果 转染正义S3rp cDNA真核表达质粒后，K562细胞对阿霉素的耐药性比未转染的K562细胞增强5．8倍；转染反义S3rp cDNA真核表达质粒后，K562／DOX细胞对阿霉素的耐药性比未转染的K562／DOX细胞降低69％。结论 S3rp基因过表达在K562／DOX细胞耐药性的形成中起重要作用。