罗格列酮对高糖环境下人脐静脉内皮细胞分泌NO及ICAM-1的影响

目的 研究在高糖环境下人脐静脉内皮细胞（HUVEC）分泌NO及ICAM-1的量随时间的变化以及罗格列酮的干预作用.方法 体外培养人脐静脉内皮细胞,随机分为正常对照组、高糖组、罗格列酮干预组,加入相应培养液培养不同时间（0 h,24h,48 h,72 h,96 h）.用硝酸还原酶法测细胞上清液中NO^-3＋NO^-2含量,来反映NO水平;用酶联免疫吸附技术双抗体夹心法（ABC-ELISA）测定细胞上清液中ICAM-1水平.结果 与正常对照组相比,高糖组NO含量在24 h明显升高,在48 h显著降低,于72 h基本达底线水平,ICAM-1水平在各时间点均明显升高且呈时间依赖性;罗格列酮可显著抑制高糖引起的NO的变化及ICAM-1的增高.结论 罗格列酮可纠正高糖诱导的内皮细胞功能紊乱,起到保护血管的作用.     

性激素对人脐静脉内皮细胞释放一氧化氮的影响

目的 :探讨性激素单独应用或联合应用对人脐静脉内皮细胞释放一氧化氮 (NitricOxide ,NO)的影响。方法 :取健康产妇分娩后 6h内的脐带内皮细胞进行培养 ,以Griess测定培养液中NO2 含量间接反映NO生成量 ,分别测定加入 0 .0 0 1μmol/L ,0 .1μmol/L和 10 μmol/L的 17β E2 ,P、T刺激细胞 10min、30min、6 0min时NO2 含量 ,以 1ml无钙镁盐液作对照。结果 :与对照组相比 ,17β 雌二醇浓度为 0 .0 0 1μmol/L、0 .1μmol/L、10 μmol /L单独作用于内皮细胞 10min和 30min时 ,培养液中NO含量明显增加 (P <0 .0 5 ) ,但刺激 6 0min时无明显作用 (P >0 .0 5 ) ;与孕激素 (0 .0 0 1μmol/L、0 .10 μmol/L、10 μmol /L)分别联合应用 ,作用于内皮细胞 10min、30min和 6 0min ,都能显著抑制雌激素刺激内皮细胞释放NO(P <0 .0 5 )。不同浓度和作用时间下 ,孕激素和雄激素对内皮细胞释放NO的作用不同。结论 :雌激素能够通过NO途径产生血管舒张作用 ,孕激素可能通过抑制NO的释放而抑制雌激素舒张血管的作用。     

白藜芦醇对高糖高脂处理的原代人脐静脉血管内皮细胞E-选择素表达及NO分泌的影响

目的：探讨白藜芦醇对高糖、高脂培养人原代脐静脉血管内皮细胞E-选择素mRNA表达及胰岛素刺激的一氧化氮（NO）分泌的影响。方法：原代培养人脐静脉内皮细胞,以0．1μmol／L白藜芦醇预处理4h后,以高糖（33．3mmol／L葡萄糖）＋高脂（棕榈酸0．5mmol／L）DMEM培养基培养24h,以RT—PCR法检测培养细胞E-选择素的表达。部分细胞经100nmol／L胰岛素刺激25min后,以硝酸还原酶法检测培养上清NO的含量。结果：与正常对照组相比．高糖高脂培养使内皮细胞E-选择素的表达升高,同时胰岛素刺激的NO分泌降低。而白藜芦醇预处理可以明显降低E-选择素的表达,并明显促进胰岛素对内皮细胞NO分泌的刺激作用。结论：白藜芦醇可以改善高糖、高脂诱导的血管内皮细胞胰岛素刺激的NO分泌作用,并可降低E-选择素表达,保护内皮细胞的功能,从而可能在糖尿病动脉粥样硬化的防治中具有广阔的前景。     

波动性高糖对内皮细胞粘附分子表达及NO分泌的影响

目的探讨波动性高血糖在糖尿病慢性血管并发症中的致病机制。方法以体外培养人脐静脉内皮细胞为研究对象,分别测定波动性高浓度葡萄糖（5或20mmolPL）与恒定性高浓度葡萄糖（20mmolPL）环境下内皮细胞表达VCAM-1、ICAM-1的含量,同时观察培养液中NO含量的不同。结果波动性高糖组VCAM-1、ICAM-1均明显高于恒定高糖组（分别为P〈0.01;P〈0.01）,而波动性高糖组的NO则明显低于恒定性高糖组（P〈0.01）.结论波动性高血糖较恒定性高血糖对血管内皮细胞可能具有更强的损伤效应。     

不同水平糖浓度对人脐静脉内皮细胞SOD、NOS及NO的影响

目的:观察体外培养条件下,不同水平的糖浓度对血管内皮细胞一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)的影响.方法:体外培养人脐静脉内皮细胞株ECV304,分对照组、高糖组和糖浓度递增组,使用分光光度比色法检测NOS、NO和SOD的吸光度,计算出活力或含量.结果:与对照组比较,高糖组NOS活力和NO含量增加,SOD活力下降;递增组NOS活力、NO含量增加及SOD活力下降幅度均较高糖组更加明显.结论:递增性高糖较持续的高糖对内皮细胞SOD的抑制作用和NOS、NO的诱导作用明显增强.     

阿魏酸钠对人脐静脉内皮细胞产生一氧化氮的影响

目的研究阿魏酸钠(SF)对人脐静脉内皮细胞产生一氧化氮(NO)的影响。方法用NO试剂盒分别测定氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)、VitE以及SF对培养的人脐静脉内皮细胞产生NO的影响。结果OX-LDL对培养的人脐静脉内皮细胞NO有明显的抑制作用,并且随着浓度的增加及作用时间的延长,抑制作用逐渐增强;SF和抗氧化剂VitE可明显减弱OX-LDL对内皮细胞NO产生的抑制作用。结论SF具有与抗氧化剂VitE相似的保护内皮细胞释放NO的作用。     

阿魏酸钠对人脐静脐内皮细胞产生一氧化氮的影响

目的：研究阿魏酸钠（ＳＦ）对人脐静脉内皮细胞产生一氧化氮（ＮＯ）的影响。方法：用ＮＯ试剂盒分别测定氧化低密度脂蛋白（ＯＸ－ＬＤＬ）、ＶｉｔＥ以及ＳＦ对培养的人脐静脉内皮细胞产生ＮＯ的影响。结果：ＯＸ－ＬＤＬ对培养的人脐静脉内皮细胞ＮＯ有明显的抑制作用,并且随着浓度的增加及作用时间的延长,抑制作用逐渐增加;ＳＦ和抗氧化剂ＶｉｔＥ可明显减弱ＯＸ－ＬＤＬ对内皮细胞ＮＯ产生的抑制作用。结论：ＳＦ具有与抗氧     

硫化氢对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的影响及其机制研究

目的 观察硫化氢（hydrogen sulfide,H2S）对内皮细胞凋亡的影响,并从抗氧化的角度初步探讨其作用机制.方法 以硫氢化钠（sodium hydrosulfide,NaHS）作H2S的供体,人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）经10 μmol/L NaHS预孵育24 h后加入33 mmol/L葡萄糖（高糖）作用48 h,以正常对照组、高糖损伤组和10 μmol/L NaHS预处理组作为对照,DAPI荧光染色观察细胞核形态的变化并检测细胞凋亡,Western Blot检测细胞黄嘌呤氧化酶（XOD）和超氧化物歧化酶（SOD）蛋白质的表达.结果 DAPI染色荧光显微镜观察发现,与正常对照组相比,高糖损伤组HUVECs中出现大量的核呈浓染致密的固缩形态或颗粒状荧光的凋亡细胞,NaHS预处理的HUVECs中细胞核呈浓染致密的固缩形态或颗粒状荧光的细胞数明显减少,大部分细胞染色质呈弥漫均匀的低强度荧光.Western Blot结果显示,33 mmol/L葡萄糖孵育HUVECs 48 h后,与正常对照组相比,SOD蛋白表达降低37.17%,XOD蛋白的表达增加47.06%;10 μmol /L NaHS 预处理组与高糖损伤组相比,HUVECs SOD蛋白的表达增加27.52%,XOD 蛋白表达降低 31.20%.结论 H2S对高糖诱导的HUVECs凋亡具有拮抗作用,并与其抑制高糖引起的细胞内SOD水平的降低、XOD升高有关.     

TNF-α对人脐静脉内皮细胞中NO和eNOS的影响

目的 讨论肿瘤坏死因子-α（TNF—α）对内皮细胞一氧化氮（NO）产生及内皮型一氧化氮合酶（eNOS）活性的影响。方法 以人脐静脉内皮细胞（HUVEC）为实验材料，检测与不同浓度TNF—α作用不同时间后．细胞培养上清液和细胞中NO水平的变化，以及细胞eNOS活性的改变。结果 （1）随着TNF—α浓度的升高，eNOS的活性减弱，而细胞和上清液中NO的含量增加；（2）随着干预时间的延长，eNOS的活性减弱；而细胞和上清液中NO的含量在作用24h后升高，且明显高于对照组；（3）L一单甲基精氨酸（L—NMMA）和地塞米松（DXM）均能阻断TNF-α引起的细胞和细胞上清中NO的表达增加。结论 TNF-α降低eNOS活性，却在高浓度和长时间作用后增加NO的合成，可能与激活诱导型一氧化氮合酶有关，因为NO的变化可以被L—NMMA和DXM阻断。     

波动性高糖诱导的内皮细胞凋亡与JNK信号转导途径

目的：观察波动性高糖对人血管内皮细胞凋亡的影响,并探讨其机制。 方法：波动性高糖（5.5或20 mmol/L）与恒定性高糖（20 mmol/L）作用于人脐静脉内皮细胞7 d,用Annexin V/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率,Hoechst33258荧光染色观察凋亡形态学变化,比色法测定培养液中超氧化物岐化酶（SOD）活力和丙二醛（MDA）含量, Western 印迹测定磷酸化c-JunNH2-末端激酶（p-JNK）水平。结果：波动性高糖组的细胞凋亡率明显高于恒定性高糖组（P＜0.05）,且其培养液中SOD活力降低（P＜0.05）,MDA含量增加（P＜0.05）,细胞p-JNK水平增高（P＜0.05）。JNK特异性抑制剂SP600125应用后降低了波动性高糖诱导的细胞凋亡率（P＜0.05）。抗氧化剂维生素C应用后抑制了细胞内p-JNK水平的升高（P＜0.05）,降低了细胞凋亡率（P＜0.05）。结论：波动性高糖较恒定性高糖更易促发培养的人脐静脉内皮细胞凋亡,其机制可能与氧化应激水平增高,进而激活JNK信号转导途径有关。     

低糖诱导人脐静脉内皮细胞一氧化氮与活性氧变化的研究

目的观察低浓度葡萄糖对人脐静脉内皮细胞一氧化氮(NO)与活性氧(ROS)变化的影响。方法以体外培养人脐静脉内皮细胞株HUVEC-12为研究对象,将实验分为正常对照组(5.5mmol/L葡萄糖)、低糖组(2.8mmol/L葡萄糖)、无糖组(0mmol/L葡萄糖)。分别用2.8、0mmol/L葡萄糖干预HUVEC-12细胞,经过1、2、4、12h后,硝酸还原酶法测定NO产量,化学比色法测定一氧化氮合成酶(NOS)活性,Dihydroethidium荧光探针法测定细胞内ROS水平。结果与正常对照组相比,低糖组与无糖组NO水平降低(P<0.01),NOS活性下降(P<0.01),细胞内ROS水平升高(P<0.01),均呈剂量依赖关系。同一浓度组内随着时间的延长,内皮细胞NO水平、NOS活性进一步降低(P<0.01),ROS水平进一步升高(P<0.05),各指标都具有浓度和时间依赖性。结论低糖可导致内皮细胞功能障碍,NO水平降低,NOS活性下降,其机制可能与低糖导致内皮细胞氧化应激损伤有关。     

Changes in human umbilical vein endothelial cells induced by endothelial nitric oxide synthase traffic inducer

This study investigated the changes in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) induced by overexpression of endothelial nitric oxide synthase traffic inducer (NOSTRIN) and its role in cellular injury. Recombinant NOSTRIN-expressing and empty vectors were transfected into cultured HUVECs, and factor Ⅷ-related antigen was examined by using immunohistochemical analysis. Growth curves were generated for both transfected and untransfected cells and these indicated that the proliferative ability of cells overexpressing NOSTRIN was significantly decreased. The expression of NOSTRIN and eNOS proteins was detected by using Western blot analysis, endothelial NOS (eNOS) activity was assayed by using spectrophotometry, and NO 2 /NO 3 levels were measured using nitrate reductase. Immunohistochemical analysis demonstrated that all groups expressed NOSTRIN in the plasma membrane and cytoplasm, and Western blot analysis confirmed that NOSTRIN levels were significantly higher in cells transfected with the NOSTRIN plasmid (P<0.01). The activity of eNOS and the levels of NO 2 /NO 3 were significantly decreased in NOSTRIN overexpressing cells as compared with empty vector and untransfected cells (P<0.01 and P<0.01, respectively). Morphological and ultrastructural changes were observed under light and electron microscopy, and it was found that NOSTRIN-overexpressing cells were elongated with deformities of the karyotheca, injury to the plasma membrane, increased lipids in the cytoplasm, and shortened microvilli. This study showed that overexpression of NOSTRIN had a significant effect on eNOS activity in HUVECs and resulted in significant cellular damage.     

高糖对人脐静脉内皮细胞GSH-PX活力、NOS及ICAM-1表达的影响

目的:探讨体外培养条件下高糖状态对血管内皮细胞的影响。方法:培养人脐静脉内皮细胞株ECV3 0 4,分为对照组和高糖组,用分光光度比色法检测谷胱甘肽过氧化物酶(GSH PX)活力,RT- PCR法检测细胞间粘附分子1(ICAM- 1)mRNA水平,免疫细胞化学法观察内皮细胞型一氧化氮合酶(eNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的蛋白表达。结果:高糖组GSH- PX活力明显下降,eNOS、iNOS蛋白表达明显增高,ICAM- 1mRNA水平也显著上升。结论:在较短时间内糖浓度升高可引起血管内皮细胞GSH PX活力下降,ICAM -1mRNA、eNOS和iNOS蛋白表达增高,对糖尿病血管病变早期进展起一定的作用。     

牙龈卟啉单胞菌促进人脐静脉内皮细胞一氧化氮的生成

目的:观察牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelialcells,HUVEC)一氧化氮(NO)生成的影响,探讨Pg对内皮细胞功能损伤的途径,以期为牙周病在动脉粥样硬化发病机制中的作用提供依据.方法:用感染复数(multiplicity of infection,MOI)1∶10、1∶100Pg干预HUVEC,未受Pg干预的HUVEC作为阴性对照组,分别于4、8、12、24 h时收集细胞上清液,利用硝酸还原酶法测定细胞上清液中NO的浓度:Western.blot检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白表达水平;透射电镜观察Pg对HUVEC的黏附和入侵方式.结果:在24 h内,PgMOI 1∶10、1∶100能促进HUVEC NO的生成,与阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),PgMOII∶10,MOII∶100可以诱导HUVEC iNOS的蛋白表达,抑制eNOS的蛋白表达,与阴性对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05),透射电镜观察Pg能够利用其菌毛黏附于HUVEC细胞表面并入侵到HUVEC细胞胞质内,定植于细胞内.结论:Pg能够黏附于HUVEC并入侵到细胞胞质内,诱导iNOS蛋白表达,抑制eNOS的蛋白表达,最终促进HUVEC NO的生成.过量的NO可能发挥细胞毒性作用,导致内皮功能失调.     

高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞中NO的变化及其对细胞外基质的影响

目的 探讨高糖培养的肾小球系膜细胞中一氧化氮（NO）合成的变化,以及上述变化对细胞外基质的影响.方法 体外培养大鼠肾小球系膜细胞,按干预方法分为正常组（NG组,5.56 mmol·L-1 DMEM）,高糖组（HG组,25 mmol·L-1 DMEM）、一氧化氮供体组（SNP组,5.56 mmol·L-1 DMEM＋100 μmol·L-1 SNP）、NO清除剂组（C-PTIO 组,25 mmol·L-1 DMEM＋200 μmol·L-1 C-PTIO）,以Griess比色法测定培养上清中NO水平;用ELISA法测定培养上清中Ⅳ型胶原、层黏蛋白含量.结果 高糖培养条件下上清中NO增多（P〈0.05）,Ⅳ型胶原、层黏蛋白含量增加（P〈0.01）,应用C-PTIO可显著降低上清中NO的含量,Ⅳ型胶原、层黏蛋白的含量也降低.结论 高糖可诱导大鼠肾小球系膜细胞产生NO,异常增多的NO又可导致系膜细胞中Ⅳ型胶原、层黏蛋白的积聚.     

ox-LDL对PLGF作用内皮细胞释放NO和内皮细胞黏附分子的影响

目的：探讨氧化型低密度脂蛋白对胎盘生长因子-1作用人脐静脉内皮细胞释放一氧化氮和内皮细胞黏附分子的影响。方法：在ox-LDL（25μg／mL）条件下,应用不同浓度的PLGF-1（20、40、80ng／mL）孵育ECV-304,对照组为内皮细胞未受损时,相同浓度梯度的PLGF-1孵育ECV-304,3h、6h、12h、24h后应用ELISA法检测内皮细胞黏附分子-可溶性细胞间黏附因子-1、可溶性血管内皮细胞黏附因子-1的表达,硝酸盐还原酶法检测NO的表达。结果：正常生理条件下,PLGF诱导NO和内皮细胞黏附分子的表达,且呈时间（当t=6h达到最理想的分泌量）、浓度依赖关系。在氧化损伤条件下,PLGF诱导NO的表达下降,而内皮细胞黏附分子的表达则增高,以VCAM-1表达增多更为明显。结论：氧化损伤是动脉粥样硬化的独立危险因素,而PLGF诱导内皮的活化,上调内皮黏附分子的表达,可进一步促使疾病的恶化。故认为抑制PLGF的生物活性可达到控制炎症反应的作用。     

一氧化氮合酶基因转染小鼠内皮祖细胞的实验研究

目的 探讨利用脂质体介导内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因体外转染小鼠骨髓来源的内皮祖细胞(EPC)的可行性.方法 密度梯度离心法分离ICR小鼠骨髓来源单个核细胞培养制备小鼠EPC并鉴定;构建、扩增、提取并纯化pcDNA3.0/eNOS基因质粒;用EPC培养基配成2×105·mL-1细胞悬液,按0.6 mL/孔重新铺6孔板,待细胞生长至80％左右融合时,用脂质体LipofectamineTM 2000体外转染eNOS基因至EPC.转染48 h后,采用RT-PCR检测EPC中eNOS的表达,硝酸还原酶法检测EPC中一氧化氮(NO)的含量,荧光探针DCFH-DA活性氧检测氧自由基(ROS)的含量.结果 成功培养EPC,成功构建pcDNA3.0/eNOS基因载体.转染48 h后,EPC中eNOS表达量明增加(P＜0.01),NO含量明显升高(P＜0.01),ROS含量明显降低.结论 脂质体介导eNOS基因能够有效转染小鼠EPC,并能在EPC中有效表达.