趋化性细胞因子MTCK1/mPBP的原核表达、纯化及活性分析

目的 原核表达、纯化小鼠CXC亚家族趋化性细胞因子MTCK1／mPBP并测定其生物学活性。方法 构建原核表达载体pQE-30-MTCK1/mPBP；在大肠杆菌M15菌株中表达重组蛋白6xHisMTCK1/mPBP，利用镍-亚硝胺乙酸-组氨酸(Ni-NTA-His)亲和层析法对重组蛋白进行纯化。采用Boyden小室对纯化的MTCK1／mPBP蛋白进行趋化活性分析。结果 通过优化表达和纯化条件，获得了重组．MTCK1／mPBP蛋白，并对大肠杆菌包涵体蛋白进行变性和复性处理。趋化试验表明，原核表达的MTCK1／mPBP蛋白对转染有CXCR2受体的293细胞系具有明显的趋化能力，并呈现浓度依赖性。结论 利用原核表达系统，表达并纯化了重组趋化性细胞因子6xHis-MTCK1／mPBP蛋白，体外功能试验证实有生物学活性．     

人源抗狂犬病毒二硫键稳定抗体在大肠杆菌中的融合表达

目的在大肠杆菌pMAL-P2x系统中表达anti-rabiesMBP-ScdsFv融合蛋白,酶切获得目的蛋白ScdsFv,进行纯化、鉴定及简单活性分析。方法利用DNA重组技术,将全长的ScdsFv蛋白基因克隆至原核表达载体pMAL-p2x中,重组质粒转化大肠杆菌E.coliER2566,IPTG诱导表达。表达产物经Xa酶切后,经Ni柱、AmyloseResin亲和层析进行纯化,SDS-PAGE和Western blot对其进行鉴定,ELISA检测其结合活性。结果成功地构建了重组质粒pMAL-ScdsFv,经诱导表达、蛋白酶切、亲和纯化后获得目的蛋白。ELISA检测其具有抗原特异结合活性,其热稳定性有显著提高。结论抗狂犬病毒ScdsFv蛋白具有良好的结合活性和生物学活性稳定性,可作为候选分子用于狂犬病的防治研究。     

RGD-FasL基因的构建、表达、纯化及其活性分析

目的构建适于原核表达的重组蛋白RGD-FasL表达载体,并进行重组蛋白的表达纯化及抗肿瘤活性分析。方法通过重叠PCR将RGD序列插入到FasL基因的N端,获得RGD-FasL基因,构建pGEX-5X-1/RGD-FasL表达载体。转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,GST柱纯化。采用体外黏附实验、MTT比色法、流式细胞法检测融合蛋白的功能。结果通过重叠PCR获得了编码正确氨基酸序列的目的基因。目的蛋白以分泌的形式表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上。纯化后,蛋白纯度达95%以上。体外黏附实验表明所纯化的融合蛋白可与宫颈癌Hela细胞发生特异结合。MTT比色法与流式细胞技术均表明纯化的融合蛋白能特异性地诱导肿瘤细胞发生凋亡。结论重组蛋白RGD-FasL表达载体的成功构建、表达、纯化及活性分析,为进一步的功能研究奠定了基础。     

福氏志贺菌毒力蛋白IpaC的表达、纯化及免疫活性鉴定

目的表达、纯化福氏志贺菌毒力蛋白IpaC并对其免疫活性进行鉴定。方法将含有ipaC基因的pET32a．ipaC表达质粒载体转入大肠杆菌BL21（kDE3）中表达，表达产物进行SDS—PAGE鉴定，并采用QIA expressionist^TM蛋白纯化系统纯化IpaC蛋白；用纯化的蛋白免疫动物获得抗血清，Western-blot检测抗原的免疫活性。结果诱导后的表达产物经SDS—PAGE发现有一相对分子量约为63000的条带，其含量约占总蛋白量的11％，对融合蛋白进行纯化纯度可达90％以上，抗His的抗体Western-blot分析，发现特异性区带出现在63000u处，证明该蛋白是所要表达的融合蛋白，制备的免疫血清可与Ipac发生特异免疫反应。结论pET32a-ipaC重组表达质粒转入大肠杆菌后，可稳定、高效地表达毒力蛋白IpaC，且纯化后的蛋白具有免疫活性。     

绿脓杆菌鞭毛蛋白FlgE的重组表达及初步活性鉴定

目的 原核表达及纯化绿脓杆菌鞭毛蛋白FlgE并进行初步活性鉴定.方法 分析绿脓杆菌鞭毛蛋白FlgE的基因序列,设计带适当酶切位点的引物,用PCR方法扩增出 FlgE的编码DNA序列,与大肠杆菌表达载体pET24a同时经Nde Ⅰ/HindⅢ双酶切、纯化及连接后构建pET24a-FlgE原核表达质粒,挑选重组阳性质粒经DNA测序确认序列正确,转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达条件优化,使重组质粒表达目的蛋白,采用组氨酸标签亲和层析法对目的蛋白进行纯化,通过SDS-PAGE对纯化后蛋白相对分子质量进行鉴定,用试剂盒进行去内毒素化处理.在体外培养人角膜上皮细胞系细胞,加入纯化的FlgE重组蛋白,培养4h后应用实时定量PCR检测各种相关的炎性因子以反映FlgE蛋白活性.结果 可用于大肠杆菌表达系统的重组pET24a-FlgE构建成功,其编码的蛋白在BL21中获得高效表达,当诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷浓度为1 mmol/L,在16℃、225r/min振荡培养20 h,诱导目的蛋白表达量最高,经纯化、去内毒素处理和SDS-PAGE鉴定,获得纯化的重组FlgE蛋白.角膜上皮细胞用20 μg/ml FlgE处理后,细胞内炎性相关分子IL-6和IL-8的表达量明显上升,而灭活的FlgE蛋白则丧失该刺激活性.结论 获得纯化的重组绿脓杆菌鞭毛蛋白FlgE,且可刺激角膜上皮细胞上调炎性因子IL-6、IL-8的表达.     

重组人可溶性B淋巴细胞激活因子的制备及活性分析

目的　制备具有功能活性的人TNF家族的B细胞激活因子 (BcellactivatingfactortotheTNFfamily ,BAFF)胞外区 134～ 2 85氨基酸残基段 ,为BAFF的深入研究创造条件。方法　提取人新鲜扁桃体组织总RNA ,经RT PCR扩增编码人BAFF胞外区 134～ 2 85氨基酸残基cDNA ,经序列测定后 ,构建于原核表达载体 pQE 80L并转化大肠杆菌DH5α ,经IPTG诱导表达及Ni2 NTA柱层析纯化目的蛋白 ,行SDS PAGE和Western印迹检测。最后经MTT法检测其增殖活性。结果　RT PCR扩增得到了 4 5 9bp的cDNA片段 ,序列分析与GenBank中报道的编码人BAFF13 4 2 85的cDNA序列一致 ,SDS PAGE及Western印迹证实表达蛋白确实为 6×His BAFF13 4 2 85融合蛋白并存在于包涵体中。活性检测证实其能明显刺激肿瘤细胞的增殖。结论　利用大肠杆菌可高效表达rhBAFF13 4 2 85,得到的纯化蛋白具有较高的生物学活性 ,为进一步的研究奠定了基础。     

一种重组β-内酰胺酶的原核表达,纯化及其活性检测

目的:利用原核表达系统诱导表达一种可以用于肿瘤生物治疗ADEPT(单抗导向酶活化前药)的重组蛋白RGD4CβL,并对该蛋白进行纯化以及活性检测。方法:对合成的DNA序列进行测序,将重组载体pColdII-RGD4CβL转化入大肠杆菌E.coli BL(DE3),在大肠杆菌细胞中诱导表达目的蛋白,用His标签纯化树脂Ni-NTA纯化目的蛋白,以流式细胞术(FCM)检测纯化所得蛋白的活性。结果:合成的DNA全长为1125bp,其在E.coli BL(DE3)中经IPTG诱导后表达出相对分子质量(Mr)约为42000的目的蛋白,经纯化后获得了产率和纯度均很高的重组蛋白RGD4CβL,流式细胞检测证明该蛋白具有很好的肿瘤细胞靶向性。结论:成功地对重组蛋白RGD4CβL进行了诱导表达,得到的纯化蛋白具有较好的肿瘤细胞靶向性,该重组蛋白将可能成为一种免疫原性更低的新型双功能蛋白用于ADEPT。     

提高树突状细胞腺病毒感染效率的融合蛋白的表达及活性鉴定北大核心CSCD

目的构建表达靶向树突状细胞融合蛋白CT40L的原核表达载体,在大肠杆菌中表达,并对CT40L融合蛋白进行纯化鉴定及功能验证。方法从GenBank上查找柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)、T4噬菌体fibritin和小鼠CD40L的基因序列,并将其主要功能区域连接形成拼接序列;序列进行原核表达密码子优化后将其克隆至原核表达载体pET42a(+),构建重组表达载体pET42a-CT40L,并将该载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达CT40L/GST融合蛋白,并采用GST琼脂糖凝胶纯化重组蛋白。纯化后的重组蛋白经Western blot法、间接ELISA鉴定其免疫活性。结果重组表达载体经NcoⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定正确;IPTG诱导后经SDS-PAGE分析表明获得了相对分子质量(Mr)78 000大小的重组蛋白;纯化后的蛋白纯度达到90%。Western blot法和ELISA检测证实纯化的CT40L分子能够与特异性抗体及相应受体发生反应,表明该融合蛋白具有良好的免疫学活性。结论成功构建了原核表达载体pET42a-CT40L,利用大肠杆菌表达系统实现了融合分子的可溶性表达,纯化后CT40L融合蛋白经检测具备较高的免疫学活性。     

提高树突状细胞腺病毒感染效率的融合蛋白的表达及活性鉴定

目的构建表达靶向树突状细胞融合蛋白CT40L的原核表达载体,在大肠杆菌中表达,并对CT40L融合蛋白进行纯化鉴定及功能验证。方法从GenBank上查找柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)、T4噬菌体fibritin和小鼠CD40L的基因序列,并将其主要功能区域连接形成拼接序列;序列进行原核表达密码子优化后将其克隆至原核表达载体pET42a(+),构建重组表达载体pET42a-CT40L,并将该载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达CT40L/GST融合蛋白,并采用GST琼脂糖凝胶纯化重组蛋白。纯化后的重组蛋白经Western blot法、间接ELISA鉴定其免疫活性。结果重组表达载体经NcoⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定正确;IPTG诱导后经SDS-PAGE分析表明获得了相对分子质量(Mr)78 000大小的重组蛋白;纯化后的蛋白纯度达到90%。Western blot法和ELISA检测证实纯化的CT40L分子能够与特异性抗体及相应受体发生反应,表明该融合蛋白具有良好的免疫学活性。结论成功构建了原核表达载体pET42a-CT40L,利用大肠杆菌表达系统实现了融合分子的可溶性表达,纯化后CT40L融合蛋白经检测具备较高的免疫学活性。     

人survivin蛋白的原核表达、纯化及抗原活性鉴定

目的 构建人肿瘤抗原survivin的原核表达载体,优化在大肠杆菌中的表达条件,并对survivin/His融合蛋白进行纯化和抗原活性鉴定.方法 设计针对survivin基因序列的特异引物,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增人survivin全长基因序列(538 bp)克隆至原核表达载体pET28a(+),构建重组表达载体pET28 a-survivin,并将该载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达survivin/His融合蛋白,并采用Ni亲和层析凝胶纯化重组蛋白.纯化后的重组蛋白经Western blot法、ELISA鉴定其抗原活性.结果 重组表达载体经BamH Ⅰ和HindⅢ鉴定正确;IPTG诱导后经SDS-PAGE分析表明获得了相对分子质量(Mr)24000大小的重组蛋白;纯化后的蛋白纯度达到90％.Western blot法和ELISA检测证实纯化的survivin蛋白能够与特异性抗体发生反应,表明其具有良好的抗原活性.结论 成功构建了原核表达载体pET28 a-survivin,利用大肠杆菌表达系统实现了融合蛋白的可溶性表达并进行纯化,纯化后survivin蛋白经鉴定具备较高的抗原活性.     

LIGHT基因的克隆及其可溶性表达

目的　克隆LIGHT基因 ,构建含有人LIGHT基因的表达载体 ,诱导其在大肠杆菌中可溶性表达 ,并对表达的LIGHT蛋白的生物学活性进行检测。方法　从人的外周血单个核细胞中克隆LIGHT全长cDNA及其胞外区片段 ,并将其胞外区片段亚克隆至原核表达载体pET 11a中 ,筛选阳性重组质粒pET LIGHT ,以IPTG诱导其可溶性表达 ,并以SDS PAGE和Westernblot检测进行分析。表达的蛋白初步纯化后 ,进行生物学活性分析。结果　RT PCR扩增出了LIGHT全长 72 3bp的cDNA。SDS PAGE和Westernblot分析证实重组pET LIGHT质粒可表达出相对分子质量 (Mr)为 19× 10 3的蛋白。可溶性LIGHT重组蛋白可共刺激T细胞的增殖及诱导IFN γ的产生。结论　本实验成功地将LIGHT胞外区片段在大肠杆菌中进行表达 ,表达的蛋白具有生物学功能 ,这为进一步的LIGHT基因的功能研究打下了基础     

诱骗受体DcR3的基因构建、表达及特异性鉴定

目的:构建适于原核表达的人诱骗受体DcR3基因,并进行重组蛋白的表达纯化及特异性鉴定。方法:查得人DcR3cDNA全序列,将其分段设计引物,通过重叠PCR获得DcR3基因。构建pET-22b( )/DcR3表达载体,转化大肠杆菌Rosseta-gami,IPTG诱导表达,Ni柱纯化。采用ELISA进行特异性鉴定。结果:通过重叠PCR获得了编码正确氨基酸序列的目的基因。目的蛋白以包涵体的形式表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上。纯化后,蛋白纯度达95%以上。ELISA结果表明所纯化的蛋白可与抗DcR3抗体发生特异结合。结论:诱骗受体DcR3基因的成功构建、表达及纯化,为进一步的功能研究奠定了基础。     

BirA酶基因表达载体的构建、原核表达及表达产物的活性鉴定

目的:构建生物素-蛋白连接酶(BirA酶)基因的表达载体,并在大肠杆菌BL-21(DE3)中表达具有生物学活性的BirA酶。方法:用PCR法扩增BirA酶基因。将PCR产物克隆入pGEX-4T-2中构建BirA酶-GST融合蛋白基因的重组表达载体pGEX-BirA。经测序验证后,在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达,表达产物采用谷胱苷肽-琼脂糖层析柱进行纯化。以带有生物素酶底物肽(BirAsubstratepeptide,BSP)的HLA-A2-肽复合物为底物,用ELISA和Westernblot鉴定表达产物的生物素化活性。结果:构建了pGEX-BirA原核表达质粒,并在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达Mr为61300的BirA酶-GST融合蛋白,表达产物经谷胱苷肽-琼脂糖层析柱纯化后,得到N端带有GST标签的BirA酶蛋白。ELISA和Westernblot的结果显示,表达产物能使HLA-A2-肽复合物生物素化。结论:成功地制备了具有生物学活性的Bi-rA酶,为研究蛋白质分子的相互作用提供了有效的制剂。     

四种hGM-CSF/IL-6融合蛋白的基因构建、表达及活性比较

目的 构建及表达具有hGM-CSF和hIL-6双重生物学活性的hGM-CSF／IL-6融合蛋白分子。方法 应用PCR技术对hGM-CSF和hIL-6的基因分别加以改造，同时在二者之间加上连接肽序列(G-G-S-G-S)3，克隆PCR产物，并构建成克隆有4种融合蛋白基因的pBV220表达质粒，4种融合蛋白分别是GM-CSF(9～127)-IL-6(29～184)(简称GII)、GM-CSF(9～127)-IL-6(1～184)(简称GL2)、GM-CSF(1-127)-IL-6(1—184)(简称GI3)、GM-CSF(9-127)-IL-6(24～184)(简称GI4)，表达质粒分别导入E．coli BL-21中诱导表达。通过Q Sepharose HP离子交换柱和Sephacryl S-200分子筛柱二步柱纯化以获取目的蛋白。使用hGM—CSF依赖细胞株TF1和hIL-6依赖细胞株B9通过MTT法测量融合蛋白的生物学活性。结果 对4种融合蛋白基因的测序结果表明，其序列与理论设计完全一致，表达质粒在E．coli BL-21中均得到高效表达，表达的融合蛋白均占到总蛋白含量的30％以上，表达产物以包涵体的形式存在，通过Q Sepharose HP离子交换柱和Sephacryl S-200分子筛柱二步柱纯化及复性后获得4种目的蛋白，其纯度均达到95％以上。活性测定结果表明4种融合蛋白均具有较高的hGM-CSF和hIL-6的双重生物学活性。结论 获得了具有较高纯度和双重生物学活性的GM-CSF／IL-6融合蛋白。     

荔枝果实中profilin的表达纯化及其与桦树花粉Bet v 2的交叉反应性研究

目的 表达和纯化荔枝果实profilin,并对其免疫学活性及交叉反应性进行研究.方法采用RT-PCR获得整个荔枝profilin的开放阅读框,将其与PET28a载体连接并转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)进行诱导表达,通过Ni2 亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,采用Western-blot检测其IgE结合活性,并通过ELISA抑制实验对其与桦树花粉profilin的交叉反应性进行研究.结果成功的构建了原核表达载体,并在大肠杆菌中大量的表达了荔枝profilin,纯化后的重组蛋白进行免疫印迹,结果显示15个荔枝过敏患者中有5个存在重组pofilin的特异性IgE抗体.ELISA抑制实验发现它们之间存在很高的交叉反应性.结论 成功的表达了荔枝profilin,经纯化后具有很好的免疫学活性,为进一步的深入研究奠定了基础.     

SUMO融合系统表达人白细胞介素17及其活性的研究

目的:克隆、表达和纯化人白细胞介素17(hIL-17),并对其生物学活性进行研究。方法:采用RT-PCR的方法从活化的人T细胞中克隆获得hIL-17cDNA。构建了含羟胺切割位点的重组载体pHisSUMO-hIL-17,导入宿主菌Rosetta中,经IPTG诱导后得到表达。用Ni-NTA琼脂糖颗粒层析纯化融合蛋白,经羟胺切割,复性,通过Western blot实验进行确认,并从核酸水平和蛋白水平鉴定其活性。结果:克隆表达出了hIL-17,利用Ni-NTA琼脂糖颗粒层析纯化得到的纯品蛋白经体外活性实验表明,该蛋白具有刺激3T3-L1细胞和HeLa细胞分泌IL-6、IL-8、G-CSF的作用。结论:制备了具有生物学活性的成熟hIL-17蛋白,为进一步研究该分子在疾病中的作用奠定了基础。     

大鼠HSPB7蛋白的表达、活性研究及抗体制备

目的克隆SD大鼠热休克蛋白HSPB7基因,通过原核表达、纯化获得HSPB7蛋白,对其活性进行初步研究,并制备其多克隆抗体,为进一步研究HSPB7蛋白奠定基础。方法从SD大鼠心脏组织中提取总RNA,经逆转录PCR得到HSPB7基因,亚克隆入pET-43.1a(+)载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,获得可溶性表达产物。经纯化、质谱鉴定后进行生物学活性研究,并用纯化蛋白免疫新西兰兔,分离血清,Westernblot法测定抗体效价和特异性。结果原核表达载体pET-43.1a-HSPB7成功构建,可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,得到相对分子质量(Mr)约18600的HSPB7蛋白,纯化蛋白经质谱鉴定正确。HSPB7具有分子伴侣活性,这种活性具有温度依赖性。用纯化的蛋白免疫新西兰大耳白兔,制备的多克隆抗体效价达1∶16000,且具有较强免疫特异性。结论得到具有生物学活性的大鼠HSPB7蛋白,成功制备了兔抗大鼠HSPB7蛋白的多克隆抗体,为后续研究提供了重要的实验材料。     

可溶性巨噬细胞集落刺激因子受体基因的克隆和原核表达

目的：克隆可溶性巨噬细胞集落刺激因子受体（sMR）基因，在大肠杆菌中表达，经纯化、复性后获得活性蛋白。 方法： 从人骨髓细胞中提取总RNA，在sMR基因引物两端分别加上NdeI和BamHI酶切位点，利用RT-PCR技术扩增sMR基因，经NdeⅠ和BamHⅠ酶切后连接到表达载体pET28a，测序证实克隆基因的正确性，并在大肠杆菌BL21菌株中诱导表达，采用his-tag纯化柱纯化目的蛋白，并经复性处理，配体结合实验证实蛋白活性。 结果： 限制性内切酶切出了预期条带，测序证实了克隆基因的正确性，sMR经诱导后在大肠杆菌中以包涵体形式表达，表达蛋白经纯化和复性处理，获得了具有活性的功能蛋白。 结论： 成功克隆与表达了sMR基因，得到了具有活性的功能蛋白，为进一步研究其生物学功能和应用奠定了基础。     

卡介苗HSP70的表达、纯化及活性检测

目的:在大肠杆菌中表达并纯化出具有良好生物学活性的卡介苗HSP70(BCG HSP70)蛋白.方法:利用PCR技术扩增出BCG HSP70的编码基因,将其克隆到pMD18-T载体,测序分析.再将该目的基因亚克隆至pET28a表达载体,转化入大肠杆菌BL21(DE3),获得正确的阳性克隆子后,用IPTG诱导表达.纯化表达产物,SDS-PAGE及Western blot鉴定目的蛋白,并通过脾增生实验检测其生物学活性.结果:扩增的BCG HSP70基因经序列测定与GenBank公布的序列完全一致.表达产物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量(Mr)约70 000处有表达条带.Western blot结果证实纯化产物在Mr约70 000处可见特异性条带.蛋白纯度约96.5%.脾细胞增生试验显示,该蛋白能够明显刺激鼠脾细胞增殖.结论:成功表达并纯化了具有良好生物学活性的BCG HSP70,为进一步研究BCG HSP70及BCG的功能奠定了基础.     

人血管抑制因子的原核表达、纯化及活性研究

目的：利用大肠杆菌表达系统表达人血管抑制因子，并利用镍金属螯合层析法进行纯化，探讨其抑制血管内皮细胞增殖的活性。方法：采用RT-PCR技术从人肝脏组织中获取人血管抑制因子的cDNA，将其克隆至原核表达载体pQE30中进行IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE分析，并利用镍金属螯合层析法进行纯化。^3H-TdR法检测纯化的血管抑制因子对血管内皮细胞增殖的抑制作用。结果：利用pQE30表达载体表达的含6个组氨酸尾的vasostafin蛋白，在SDS-PAGE上表现出一条约2lkD的阳性条带，经镍金属螯合层析纯化后的蛋白经肽指纹图谱分析鉴定为目的蛋白，在体外可抑制人脐静脉血管内皮细胞的增殖。结论：人血管抑制因子可在大肠杆菌中以包涵体形式高水平表达，并具有抑制血管内皮细胞增殖的活性．